王誼揚，劉陽，袁勝濤，孫立

（中國藥科大學(xué)江蘇新藥篩選重點實驗室，江蘇 南京 210009 ）

pH梯度失調(diào)是癌細胞的共同特征。與正常細胞相比，腫瘤細胞具有升高的細胞內(nèi)pH （pHi）和降低的細胞外pH（pHe）[1]。利用微電極、磁共振光譜法等方法測定腫瘤細胞內(nèi)外的pH，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的酸性程度遠高于正常組織[2]。腫瘤細胞不能長時間在pHi過低的條件下生存，于是將胞內(nèi)的酸性產(chǎn)物排出，從而引起腫瘤微環(huán)境的外酸化和內(nèi)堿化。這種微環(huán)境負pH梯度的維持與一些離子交換蛋白[如Na+/H+交換體-1（NHE-1）、空泡質(zhì)子泵（V-ATPase）、HCO3-轉(zhuǎn)運體等]密切相關(guān)。目前逆轉(zhuǎn)微環(huán)境pH的方法主要包括直接利用小分子堿性藥物[3]和間接使用離子蛋白抑制劑，如NHE-1抑制劑[4]、質(zhì)子泵抑制劑（PPIs）[5]等。此外，通過抑制碳酸酐酶（CA）的活性，也能一定程度逆轉(zhuǎn)pHe/pHi。基于上述研究成果，本文簡介了腫瘤失調(diào)pH的成因及腫瘤微環(huán)境pH失調(diào)對腫瘤生長發(fā)展的影響，著重對近年來一些逆轉(zhuǎn)微環(huán)境異常pH梯度的治療策略的研究進展作一綜述，為逆轉(zhuǎn)腫瘤失調(diào)pH藥物的開發(fā)提供思路。

1 腫瘤微環(huán)境的異常pH

1.1 外酸化與內(nèi)堿化

在各種惡性腫瘤中，細胞的外酸化與內(nèi)堿化的現(xiàn)象普遍存在。在生理狀況下，正常組織中pHe一般保持在7.4而pHi一般保持在7.2（pHe ＞ pHi）。然而在腫瘤細胞中，pHe大多介于6.5 ～ 7.0而呈弱酸性，pHi則與正常細胞類似，為堿性或接近中性[3]。這一發(fā)現(xiàn)顛覆了癌細胞中的pHi也比正常細胞更低的傳統(tǒng)認知。在大多數(shù)腫瘤中都可以觀察到這種負的 pH 梯度（pHe ＜ pHi）。

1.2 異常pH梯度的成因

腫瘤微環(huán)境異常pH梯度的形成與腫瘤細胞的組織結(jié)構(gòu)以及代謝特點息息相關(guān)。在惡性腫瘤的發(fā)展過程中，由于組織增生迅速、腫瘤組織的血管發(fā)育不良等原因，造成部分組織供氧嚴重不足。缺氧的狀況阻抑了腫瘤細胞通過有氧呼吸獲得能量，腫瘤細胞向糖酵解代謝發(fā)生轉(zhuǎn)變以滿足能量需要。因此，腫瘤細胞以比正常細胞更高的速率消耗葡萄糖并產(chǎn)生乳酸來產(chǎn)生供其生存所需的能量。實際上，癌細胞不管在有氧和無氧狀況下都保持較高的糖酵解效率[6]（即Warburg效應(yīng)）。糖酵解的增加引起大量的乳酸產(chǎn)生，腫瘤血管異常又不可及時清除積聚的乳酸，這是引起腫瘤微環(huán)境酸化的因素之一。

另外，胞內(nèi)生成的CO2彌散到胞外，腫瘤缺氧的狀態(tài)活化了缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1），誘導(dǎo)腫瘤細胞高表達CA，催化CO2和H2O反應(yīng)生成碳酸[7]。綜上所述，乳酸和CO2是腫瘤酸性環(huán)境產(chǎn)生的兩大物質(zhì)基礎(chǔ)。腫瘤細胞無法在pHi過低的條件下長期生存，因此必須通過某些機制將酸性產(chǎn)物不斷排出細胞外而維持胞內(nèi)pH穩(wěn)定。乳酸產(chǎn)生后，一些氫離子和乳酸根被單羧酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白（monocarboxylate transporter，MCT）以共轉(zhuǎn)運的方式運輸?shù)郊毎?，大部分的氫離子則被細胞膜上眾多激活的離子轉(zhuǎn)運蛋白運至細胞外或泵入某些細胞器中，最終導(dǎo)致腫瘤細胞在維持胞內(nèi)pH呈中性至堿性的同時，胞外及胞內(nèi)一些細胞器（如內(nèi)涵體、溶酶體）的pH明顯降低。

1.3 異常pH梯度的維持

癌細胞pHe/pHi的維持與位于細胞質(zhì)膜上一些離子轉(zhuǎn)運體息息相關(guān)。維持癌細胞負pH梯度的離子轉(zhuǎn)運蛋白主要包含NHE-1、V-ATPase、HCO3-轉(zhuǎn)運體、MCT[8]等（見圖1）。NHE是一種調(diào)節(jié)pHi的重要跨膜蛋白，可以使細胞內(nèi)部的H+與細胞外部的Na+以等比例的方式發(fā)生跨膜交換從而調(diào)節(jié)pHi，防止細胞內(nèi)酸化。NHE家族總體包括9個亞型（NHE-1 ～ 9），其中NHE-1是最早被發(fā)現(xiàn)的亞型[9]，對NHE抑制劑敏感度最高。NHE-1亞型的表達廣泛，對細胞內(nèi)pH的調(diào)控起到重要作用。

圖1 維持腫瘤細胞異常pH梯度的膜轉(zhuǎn)運體Figure 1 Membrane transporters maintaining abnormal pH gradient in tumor cells

V-ATPase作為一種細胞pH調(diào)節(jié)泵，也是最近幾年的研究熱點之一。V-ATPase不止在細胞內(nèi)的細胞器（如溶酶體、內(nèi)涵體、分泌小泡）膜上表達，而且在細胞質(zhì)膜上表達。腫瘤細胞升高V-ATPase的活性，將細胞內(nèi)H+泵到細胞外或溶酶體、內(nèi)涵體等細胞器內(nèi)[10]，造成腫瘤細胞外酸性環(huán)境，并且防止腫瘤細胞內(nèi)酸化，逃避凋亡損傷，導(dǎo)致腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性增強。此外，V-ATPase在多種類型的轉(zhuǎn)移性腫瘤中過表達，與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛力表現(xiàn)出正相關(guān)性。因此，阻斷V-ATPase的表達可以抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

此外，CA對維持癌細胞內(nèi)外的pH梯度起關(guān)鍵作用。其是一類廣泛存在于人體內(nèi)的含鋅金屬酶，可以有效催化CO2與水合成碳酸的可逆過程。目前在靈長類動物中共發(fā)現(xiàn)了16種α-CA，其中有15種是常見且在人類中共有的[6]。研究發(fā)現(xiàn)，CA在維持癌細胞pHi方面起著重要作用。

2 異常的微環(huán)境pH對腫瘤的影響

2.1 促進腫瘤的生長轉(zhuǎn)移

Pouyssegu及其同事研究發(fā)現(xiàn)，較高的pHi可以被看作腫瘤細胞增殖率提高的信號[11]。近年來Grillohill等[12]也已在體內(nèi)證實了pHi依賴性的腫瘤細胞增殖。腫瘤細胞中pHi的增加也與細胞侵襲表型有關(guān)；降低的pHe則可通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的活性促使腫瘤細胞發(fā)生浸潤和遷移[13]。酸性微環(huán)境中排出的一些產(chǎn)物（如組織蛋白酶B和其他蛋白水解酶）造成細胞外部基質(zhì)降解[14]及周圍正常細胞的壞死和凋亡。降低pHi或增加pHe則可抑制腫瘤細胞的生長遷移[15]。因此，設(shè)法降低pHi或增加pHe有望成為阻遏腫瘤生長和遷移的治療新方法。

2.2 增加腫瘤的耐藥性

研究發(fā)現(xiàn)，酸性微環(huán)境導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生抗藥性并逃避化療藥物損傷[16]。目前，臨床上大多數(shù)化學(xué)治療藥物均為弱堿性，藥物分子在胞外酸性條件下發(fā)生質(zhì)子化，難以穿過細胞膜脂質(zhì)層到達細胞內(nèi)部，從而引起了腫瘤細胞對化學(xué)治療藥物的天然抗性。另一方面，耐藥性腫瘤細胞通常比對藥物敏感的細胞含有更多的酸化細胞器（例如內(nèi)涵體、溶酶體等），并且酸化程度更高。化療藥物到達胞內(nèi)之后被酸性細胞器捕獲，經(jīng)質(zhì)子化后被隔離，接著通過外吐作用被排到細胞外部，因此減少了胞質(zhì)內(nèi)藥物濃度[2]。此外，酸性微環(huán)境還導(dǎo)致腫瘤細胞的免疫功能發(fā)生異常，逃避宿主免疫應(yīng)答以及免疫治療，并引起腫瘤細胞對放療的敏感度下降。

3 逆轉(zhuǎn)腫瘤pH梯度的治療策略

3.1 小分子堿性藥物

Raghunand等[17]早期研究發(fā)現(xiàn)，對移植人類腫瘤的小鼠經(jīng)口給予或注射NaHCO3能夠誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生堿化，增強乳腺癌模型對米托蓖恩或多柔比星治療的敏感度，且未引起正常肌肉pHe的明顯提高。Robey等[18]發(fā)現(xiàn)，給乳腺癌轉(zhuǎn)移模型小鼠經(jīng)口給予或脾內(nèi)注射NaHCO3能夠有針對性地升高腫瘤細胞的pHe，同時減少淋巴結(jié)和肝轉(zhuǎn)移灶的形成。此外，與對照組相比，經(jīng)過NaHCO3治療的小鼠體內(nèi)的癌細胞顯著減少，總生存時間也得以延長。因此，通過碳酸氫鹽調(diào)控pH的變化從而實現(xiàn)對腫瘤轉(zhuǎn)移的控制，是將來值得深入的研究方向[19]。

3.2 離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑

3.2.1 Na+/H+交換體-1抑制劑 NHE-1參與pH的調(diào)節(jié)并且在許多不同的惡性腫瘤中上調(diào)，其活化是避免細胞內(nèi)酸化并保護腫瘤細胞免于凋亡的一種方式。如在膠質(zhì)瘤的治療中，敲低或抑制NHE-1的活性都能顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的遷移和增殖[20]；在 T細胞急性淋巴細胞白血?。═-ALL）中，沉默NHE-1可以增強細胞對多柔比星的敏感程度[21]。因此，開發(fā)NHE-1抑制劑有望應(yīng)用于癌癥的預(yù)防及治療。Amith等[22]已發(fā)現(xiàn)NHE-1抑制劑通過降低乳腺癌細胞的pHi，誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。

鹽酸阿米洛利（amiloride hydrochloride，1）是最先被發(fā)現(xiàn)的NHE-1抑制劑[6]。此后，其吡嗪環(huán)5位被取代的化合物陸續(xù)被合成，如5-（N，N-六亞甲基）阿米洛利（HMA，2）、5-（N，N-二甲基）阿米洛利（DMA，3）、5-（N-乙基-N-異丙基）阿米洛利（EIPA，4）等，它們對NHE-1的抑制效果大多比鹽酸阿米洛利要好[23]。在急性髓性白血?。ˋML）中，AML細胞比健康的造血細胞顯示出更高的pHi[24]，HMA可以抑制NHE-1活性進而抑制AML細胞系的生長，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。此外，研究發(fā)現(xiàn)HMA能夠抑制肺癌干細胞（CSCs）的增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡[25]。

卡立泊來德（cariporide，5）是另一種NHE-1選擇性抑制劑。Albatany等[26]研究發(fā)現(xiàn)，對小鼠單劑量腹腔注射卡立泊來德后，可以誘導(dǎo)多形性膠質(zhì)母細胞瘤的急性細胞內(nèi)酸化；Lee等[27]研究發(fā)現(xiàn)，卡立泊來德可以誘導(dǎo)惡性間皮瘤細胞發(fā)生DNA損傷和細胞凋亡；陳琦等[28]研究發(fā)現(xiàn)，該藥增加了乳腺癌細胞對化療的敏感性?？⒉磥淼伦鳛槟壳把芯拷Y(jié)果較理想的、特異性較強的NHE-1抑制劑，有望在各種人類惡性腫瘤的治療中成為一種毒性輕微而又有效的新型抗癌劑。

除了卡立泊來德之外，研究新發(fā)現(xiàn)了一種有效的NHE-1抑制劑，即化合物9T（6）。該化合物對NHE-1的抑制活性已被證明是卡立泊來德的500倍以上[29]，且能靶向抑制NHE-1（高于NHE-2約1 400倍）。與其他NHE-1抑制劑相比，化合物9T的安全性較好，是目前較有開發(fā)前景的抗腫瘤藥物之一[30]。此外，另一種NHE-1的新型小分子抑制劑，化合物KR-33028（7）被發(fā)現(xiàn)可以抑制三陰性乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移[31]。其通過靶向NHE-1，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的異常pH，起到很好的預(yù)防乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的作用，而其較小的相對分子質(zhì)量也使其易被口服吸收。

3.2.2 空泡質(zhì)子泵抑制劑 PPIs能抑制V-ATPase的活性，調(diào)控多種癌細胞的pH梯度，從而抑制腫瘤細胞的生長并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[32]。PPIs也可以調(diào)控胞內(nèi)酸性細胞器的pH梯度（如內(nèi)涵體、溶酶體），從而改變抗癌藥物在胞內(nèi)的分布情況，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感度[33]。此外，PPIs可以通過調(diào)控腫瘤細胞自噬使其對化療藥物的敏感性增加[34]。自從第1代PPIs奧美拉唑（omeprazole，8）在20世紀80年代被美國FDA批準用于治療胃酸分泌異常及相關(guān)疾病以來，蘭索拉唑（lansoprazole，9）、泮托拉唑（pantoprazole，10）、雷貝拉唑（rabeprazole，11）、埃索美拉唑（esomeprazole，12）和右蘭索拉唑（dexlansoprazole，13）也分別陸續(xù)獲批用于治療胃酸相關(guān)性疾病。而研究發(fā)現(xiàn)，PPIs不僅是治療消化性潰瘍的一線藥物，其還具有抑制V-ATPase活性的重要作用，可用于改善癌癥治療效果。

Zhang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，作為癌癥治療的輔助藥物時，奧美拉唑具有協(xié)同增效作用，可以提高輔助放化療（CRT）療效并減少直腸癌的復(fù)發(fā)。癌細胞中的酸性內(nèi)涵體可以介導(dǎo)自噬，同時增加癌細胞的耐藥性并促進癌細胞的存活。Yu等[36]發(fā)現(xiàn)，蘭索拉唑可以濃度依賴性地提高內(nèi)涵體pH并減少多柔比星在體內(nèi)的滯留；此外，蘭索拉唑可以改善阿霉素分布并增加其活性，增強阿霉素在實體瘤中的治療效果。細胞自噬的上調(diào)是化療耐藥的一種機制，而泮托拉唑可以下調(diào)V-ATPase的表達，抑制自噬并增加癌細胞對藥物的敏感性。Tan等[37]發(fā)現(xiàn)，泮托拉唑可以改善抗癌藥物多西紫杉醇的細胞毒作用。

此外，在乳腺癌的治療中，F(xiàn)an等[38]觀察到長壽保證同源物2（LASS2）能夠抑制V-ATPase活性。在體外試驗中，LASS2改善了阿霉素（DOX）、順鉑（DDP）和5-氟尿嘧啶（5-FU）的療效。他們檢測到，LASS2與V-ATPase的亞基C結(jié)合，抑制了V-ATPase的功能，從而增加這些化療藥物的治療效果，LASS2也導(dǎo)致溶酶體pH增加，使隔離在細胞質(zhì)的DOX能在細胞核釋放，從而增加了DOX對細胞凋亡的誘導(dǎo)。Wang等[39]也發(fā)現(xiàn)，LASS2可以通過調(diào)節(jié)V-ATPase活性抑制膀胱癌的生長和侵襲。另外，天然產(chǎn)物山荷葉素（diphyllin，14）被發(fā)現(xiàn)可有效抑制V-ATPase活性，用于食管癌的治療[40]。以上研究結(jié)果表明：靶向抑制V-ATPase，有望提高腫瘤對化療藥物的敏感性，改善抗癌治療效果。

3.3 碳酸酐酶抑制劑

在對CA的研究中發(fā)現(xiàn)，有2種與腫瘤相關(guān)性較大的CA，分別為CAIX和CAXII。CAIX和CAXII主要存在于缺氧腫瘤細胞中，在正常組織中其表達則受限，活性位點閉合，因此酶保持無活性。最新研究也證實了CAIX和CAXII是癌癥治療中抗腫瘤轉(zhuǎn)移的有吸引力的靶標[41]。研究發(fā)現(xiàn)，CAIX/XII抑制劑與其他抗癌劑，如順鉑、PPIs、多柔比星、替莫唑胺等都具有協(xié)同作用，是一種多功能的新興抗癌藥物[42]。

目前，研究最多的CA抑制劑主要有磺胺類和香豆素類。許多磺胺類、氨基磺酸鹽類、香豆素類的CA抑制劑都被發(fā)現(xiàn)能有效靶向CAIX[43]。其中，磺胺類抑制劑是一類較早被研究的CA抑制劑，也是目前最重要的CAIX/XII抑制劑。然而，這類化合物大多數(shù)對CAIX/XII的抑制特異性不強，因此還需基于藥物的結(jié)構(gòu)設(shè)計和開發(fā)不同的磺酰胺衍生物，并從中篩選更具選擇性的腫瘤靶向CAIX/XII抑制劑。

磺胺類藥物中，N-（3-氯-1H-吲哚-7-基）-1，4-苯二磺酰胺（indisulam，15）作為抗腫瘤藥物進入臨床試驗，并進入了Ⅱ期臨床試驗階段，但在2016年終止。最近，另一種磺胺類CAIX/XII抑制劑——SLC-0111（16）治療晚期轉(zhuǎn)移性實體瘤的Ⅰ期臨床試驗獲得成功，目前處于Ⅰb/Ⅱ期臨床試驗階段[42]，并正作為單一療法或與其他藥物如吉西他濱等聯(lián)用。最新研究證明：SLC-0111不僅增強了目前用于晚期黑色素瘤治療的達卡巴嗪和替莫唑胺的細胞毒性，還增加乳腺癌細胞對阿霉素的反應(yīng)，并增強5-FU對結(jié)腸癌細胞的抑制活性[44]。

香豆素（17）是另一類CAIX/XII抑制劑。作為廣泛存在的天然產(chǎn)物，香豆素具有苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)，是一種重要的雜環(huán)化合物。研究發(fā)現(xiàn)，香豆素能抑制CA的活性。其中，一些靶向CAIX和CAXII的糖基取代香豆素已被發(fā)現(xiàn)在過表達CA的乳腺癌原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤動物模型中都能顯著抑制腫瘤細胞的生長[45]。香豆素不僅易于獲取和制備，且因其與CA結(jié)合位點的特殊性，能實現(xiàn)對不同亞型的選擇性抑制[46]。因此，香豆素及其衍生物也是一種靶向CA的抗腫瘤的潛力藥物。此外，CAIX和CAXII的單克隆抗體也是目前CA選擇性抑制藥物開發(fā)的重要方向。

4 結(jié)語

惡性腫瘤中，微環(huán)境的外酸化和內(nèi)堿化普遍存在。通過靶向調(diào)控微環(huán)境pH梯度的離子轉(zhuǎn)運蛋白及CA，可以一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的異常pH梯度，進而抑制腫瘤細胞增殖，減弱腫瘤侵襲能力并降低腫瘤耐藥性。因此，研究和開發(fā)靶向性強的、毒性輕微、新型有效的NHE1、V-ATPase和CAIX/XII抑制劑是逆轉(zhuǎn)pHe/pHi的重要方法。最近一項研究表明：與單一藥物治療相比，質(zhì)子泵抑制劑PPI和CA抑制劑的聯(lián)合使用獲得了更有效的抗腫瘤效果[47]。這代表了首次嘗試同時靶向腫瘤微環(huán)境pH調(diào)控中涉及的2種重要機制的特殊治療方法。當然，在將上述藥物相互組合或與其他抗癌藥物聯(lián)合使用時，必須考慮藥動學(xué)中藥物間的相互作用，深入探討其協(xié)同作用的動力學(xué)機制。相信在不久的將來，這些逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞微環(huán)境pH梯度相關(guān)藥物的開發(fā)，能作為有效的抗癌治療新策略。