常玉，丁克

（暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632）

TANK結(jié)合激酶1（TANK binding kinase 1，TBK1）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白，屬于非經(jīng)典的IκB激酶（IKK）家族。TBK1通過(guò)調(diào)控干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）、核因子κB（NF-κB）等多條信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子，在免疫、腫瘤、炎癥、代謝等疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。作為腫瘤免疫治療的重要潛在靶標(biāo)之一，近年來(lái)對(duì)TBK1的作用機(jī)制及小分子抑制劑的研究逐漸成為熱點(diǎn)。本文針對(duì)TBK1在腫瘤免疫中的生物機(jī)制以及小分子抑制劑研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 TBK1的蛋白結(jié)構(gòu)和信號(hào)通路

IKK蛋白家族可分為經(jīng)典和非經(jīng)典2類亞型蛋白。經(jīng)典的IKK蛋白包括IKKα、IKKβ、IKKγ（又稱NEMO）；非經(jīng)典的IKK蛋白包括IKKε和TBK1。TBK1與IKKε的氨基酸序列具有較高相似性，其序列比對(duì)同一性高達(dá)49%，相似性65%，二者具有多種相似的生物學(xué)功能[1-2]。盡管如此，二者的體內(nèi)分布卻明顯不同，TBK1與經(jīng)典的IKKα、IKKβ一樣，在體內(nèi)各個(gè)組織和器官中廣泛表達(dá)，而IKKε主要表達(dá)于淋巴組織、外周血淋巴細(xì)胞和胰腺[3]。另外，小鼠和人類的TBK1蛋白具有超過(guò)99%的同源性，說(shuō)明該蛋白在哺乳動(dòng)物中高度保守[2]。

TBK1蛋白由729個(gè)氨基酸組成，包含4個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域：位于N-端的激酶域（kinase domain，KD，9 ～ 301）、位于C-端的亮氨酸拉鏈域（leucine zipper，LZ，499 ～ 527）、螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)（helixloop-helix motif，HLH，591 ～ 632）和泛素樣結(jié)構(gòu)域（ubiquitin-like domain，ULD，305～383）（見(jiàn)圖1）[1]。LZ和HLH對(duì)TBK1蛋白的二聚化激活至關(guān)重要[4]；ULD是TBK1蛋白的主要調(diào)節(jié)區(qū)域，調(diào)控蛋白的激活、底物結(jié)合以及下游信號(hào)通路[5]。TBK1通過(guò)激酶域第172位絲氨酸磷酸化而被激活[6]，激活后的TBK1蛋白中Ser172附近loop區(qū)發(fā)生較大變化，導(dǎo)致αC螺旋向口袋內(nèi)發(fā)生較大扭轉(zhuǎn)（見(jiàn)圖1），后口袋閉合，而蛋白其他部分構(gòu)象不發(fā)生明顯改變[6-7]。

圖1 TBK1蛋白結(jié)構(gòu)Figure 1 Crystal structure of TBK1

研究人員最早在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，TBK1蛋白通過(guò)與TANK、TNF受體相關(guān)因子2（TRAF2）形成三元復(fù)合物來(lái)激活NF-κB信號(hào)通路，同時(shí)，該三元復(fù)合物的形成對(duì)TBK1蛋白活化也至關(guān)重要[2]。另外，在對(duì)下游干擾素誘導(dǎo)的IRF家族轉(zhuǎn)錄因子的激活過(guò)程中，非經(jīng)典的IKK蛋白TBK1和IKKε，比經(jīng)典的IKK蛋白（IKKα和IKKβ）具有更為重要的調(diào)節(jié)作用。TBK1通過(guò)與其類似蛋白IKKε形成同源二聚體進(jìn)而被激活，TBK1/IKKε復(fù)合物是下游干擾素β（IFN-β）、前列腺素E2（PGE2）、一氧化氮（NO）等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的重要調(diào)控因子[8-9]。TBK1在多條細(xì)胞信號(hào)通路，包括轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、IRF3通路，以及Ⅰ型干擾素（IFN-I）、Ⅱ型干擾素（IFN-II）靶基因的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與多種疾病，特別是免疫、自噬、代謝、炎癥以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。

當(dāng)病原體侵入后，模式識(shí)別受體（PRRs），如Toll樣受體4（TLR4）、視黃酸誘導(dǎo)基因樣受體（RLRs）和胞漿DNA受體等先天免疫傳感器與其同源配體，如脂多糖（LPS）、雙鏈RNA或DNA等相互作用，招募TRIF（TIR domain-containing adaptor-inducing IFN-β） 和 TRAF3， 促使 TBK1 與其類似蛋白IKKε或NF-κB活化激酶相關(guān)蛋白1（NAP1）形成復(fù)合物，最終被激活[11]?；罨腡BK1進(jìn)而使IRF3磷酸化，導(dǎo)致其同源二聚化并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)誘導(dǎo)抗病毒IFN-I和IFN-II表達(dá)[12-14]，從而警告鄰近細(xì)胞（包括免疫細(xì)胞）危險(xiǎn)和外來(lái)入侵，形成早期的防御反應(yīng)（見(jiàn)圖2）。同時(shí)，活化的TLR3也能夠招募其配體TRIF、TRAF3激活TBK1，從而誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生。除細(xì)胞膜上的TLRs蛋白外，由病毒RNA活化的胞漿RLRs、雙鏈DNA活化的胞漿DNA受體環(huán)狀GMP-AMP合成酶（cGAS）以及干擾素基因刺激蛋白（STING）啟動(dòng)子信號(hào)[15-18]，都能夠激活下游TBK1蛋白繼而誘導(dǎo)IRF3活化，在某些情況下也能夠誘導(dǎo)IRF7的活化，誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生[19-20]（見(jiàn)圖2）。另外，TBK1能夠與同源蛋白IKKβ二聚化，激活下游NF-κB轉(zhuǎn)錄因子p50、p65，從而導(dǎo)致TNF-α、IP-10等多種炎癥因子產(chǎn)生。此外，天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸（DEAD）解螺旋酶3（DDX3X）也被證實(shí)在DNA和病毒RNA識(shí)別后能夠直接與小鼠巨噬細(xì)胞中的TBK1相互作用，誘導(dǎo) IFN-β 表達(dá)[21]。

圖2 TBK1介導(dǎo)的信號(hào)通路Figure 2 TBK1-mediated signaling pathways

2 TBK1與腫瘤發(fā)生發(fā)展

研究表明，TBK1蛋白在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[22-24]。Barbie等[25]發(fā)現(xiàn)TBK1和其誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)在KRAS突變腫瘤生長(zhǎng)中是必需的。在人肺癌細(xì)胞中，對(duì)TBK1誘導(dǎo)凋亡的抑制作用依賴于Kras致癌基因的表達(dá)，TBK1是KRAS致癌的重要合成致死因子。此外，TBK1在黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中也具有致癌作用[26-27]。Eskiocak等[26]在對(duì)耐藥突變的黑色素瘤研究中發(fā)現(xiàn)，含有BRAF突變的對(duì)威羅非尼和曲美替尼耐藥的黑色素瘤細(xì)胞對(duì)TBK1/IKKε蛋白較敏感，TBK1/IKBKε抑制劑能夠選擇性地抑制含有BRAF耐藥突變的黑色素瘤細(xì)胞活性。在黑色素瘤中，NRAS過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)TBK1磷酸化激活。利用siRNA將5種不同的NRAS突變黑色素瘤細(xì)胞中TBK1敲除，能夠有效地抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，相反地，持續(xù)高表達(dá)TBK1導(dǎo)致侵襲增加，然而在NRAS野生型黑色素瘤細(xì)胞中沒(méi)有這種現(xiàn)象。此外，NSCLC的部分癌細(xì)胞也表現(xiàn)出對(duì)TBK1抑制的敏感性，這與Akt和mTORC1信號(hào)通路的激活相關(guān)[27]。在人T細(xì)胞白血病1型病毒（HTLV-1）誘導(dǎo)的成人T細(xì)胞白血?。ˋTL）的研究中發(fā)現(xiàn)，TBK1/IKKε對(duì)STAT3蛋白在HTLV-1轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞中的激活至關(guān)重要，將TBK1或IKKε沉默均可導(dǎo)致STAT3失活，抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)[28]。因此，TBK1/IKKε在HTLV-1轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖中具有關(guān)鍵作用。在乳腺癌中，TBK1能夠通過(guò)對(duì)ERα第305位絲氨酸進(jìn)行磷酸化修飾，增加ERα的轉(zhuǎn)錄活性，最終導(dǎo)致雌激素耐藥產(chǎn)生[29]。

功能復(fù)雜的蛋白激酶TBK1能夠通過(guò)介導(dǎo)多條途徑來(lái)驅(qū)動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)，主要包括：TBK1與有絲分裂底物PLK1、CEP170和NUMA相互作用，促進(jìn)癌細(xì)胞的細(xì)胞分裂，進(jìn)而促進(jìn)微管穩(wěn)定性和有絲分裂；TBK1誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬，抑制引發(fā)免疫反應(yīng)的多種促炎信號(hào)；TBK1還能夠參與Akt/mTOR信號(hào)通路的激活，促進(jìn)癌細(xì)胞存活。

2.1 TBK1與有絲分裂

據(jù)報(bào)道，TBK1能夠通過(guò)直接磷酸化Akt來(lái)激活polo樣激酶1（PLK1）[27,30]。然而在人肺癌A549細(xì)胞中，敲除TBK1蛋白能抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)，但不影響Akt蛋白活性[31]。進(jìn)一步對(duì)磷酸化蛋白的質(zhì)譜分析表明，TBK1的敲除的確能夠抑制PLK1磷酸化激活。研究還發(fā)現(xiàn)TBK1在體外能夠誘導(dǎo)PLK1磷酸化，TBK1磷酸化在有絲分裂期間增加并位于中心體、有絲分裂紡錘體和中間體，對(duì)TBK1的選擇性抑制或敲除能夠阻斷PLK1有絲分裂相關(guān)蛋白的磷酸化激活，引起紡錘體組裝缺陷，抑制有絲分裂的進(jìn)行[31]。TBK1能夠與中心體蛋白CEP170和有絲分裂器蛋白NuMA結(jié)合，二者均為T(mén)BK1的底物。在CEP170中心體定位、CEP170與微管解聚酶Kif2b結(jié)合以及NuMA與動(dòng)力蛋白結(jié)合過(guò)程中，TBK1發(fā)揮著關(guān)鍵作用[32]。此外，選擇性破壞TBK1-CEP170復(fù)合物能夠增加微管穩(wěn)定性，引起有絲分裂缺陷，這表明TBK1是微管動(dòng)力學(xué)和有絲分裂所必需的有絲分裂激酶。

2.2 TBK1與自噬

自噬是由饑餓反應(yīng)誘導(dǎo)的在溶酶體中捕獲并降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，回收細(xì)胞內(nèi)組分以維持細(xì)胞代謝和存活的過(guò)程。自噬在控制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、細(xì)胞器的質(zhì)量和數(shù)量方面起著重要的穩(wěn)態(tài)作用，當(dāng)自噬功能失調(diào)時(shí)，會(huì)誘發(fā)多種疾病，包括癌癥[33-34]。自噬在癌癥中的作用機(jī)制很復(fù)雜，在不同的情況下分別發(fā)揮中性、促進(jìn)或抑制腫瘤生長(zhǎng)的不同生理功能，具體取決于微環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物、微環(huán)境脅迫以及免疫系統(tǒng)等[29]。研究表明：自噬能夠通過(guò)抑制p53通路，防止能量危機(jī)、細(xì)胞死亡和衰老，抗腫瘤免疫等途徑促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展；相反地，在腫瘤發(fā)生初期，自噬能夠抑制腫瘤形成，例如在胰腺癌中，自噬能夠阻止炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷，從而抑制胰腺癌的發(fā)生發(fā)展[35]。

TBK1能夠通過(guò)多種方式參與自噬。研究表明：TBK1能夠誘導(dǎo)自噬受體視神經(jīng)蛋白第177位絲氨酸磷酸化激活，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的清除[36-37]。另外，TBK1通過(guò)對(duì)p62/SQSTM1第403位絲氨酸磷酸化來(lái)調(diào)控自噬以及線粒體的自噬體吞噬[38-39]，而p62/SQSTM1被證實(shí)與癌癥的發(fā)展相關(guān)[40]。Wild等[36]發(fā)現(xiàn)被TBK1激活的p62/SQSTM1能夠通過(guò)降解STING，抑制天然免疫反應(yīng)。有研究表明：在巨噬細(xì)胞中，TBK1調(diào)控p62磷酸化水平，p62是自噬清除中所必需的調(diào)控因子，在自噬成熟過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[41]。同時(shí)，促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中分枝桿菌的自噬清除，而該細(xì)胞因子IL-1β活性也依賴于TBK1。Yang等[42]發(fā)現(xiàn)，在自噬缺失的胰腺炎小鼠模型中，TBK1蛋白磷酸化水平增加，中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞滲透性以及PK-L1蛋白也隨之上調(diào)和增加。在體外胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中，由自噬抑制引起的TBK1蛋白的過(guò)度激活也能夠誘導(dǎo)CCL5、IL-6蛋白表達(dá)上調(diào)（促進(jìn)腫瘤發(fā)生）以及多種T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞趨化因子的增加。相應(yīng)地，自噬對(duì)pTBK1的降解也限制了TBK1信號(hào)傳導(dǎo)，防止TBK1過(guò)度激活自噬并限制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞的募集。自噬與TBK1之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)，活化的TBK1促進(jìn)PDA細(xì)胞中的基礎(chǔ)自噬，然后在自噬過(guò)程中被降解，以限制自噬和TBK1誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生的過(guò)度激活，二者都促進(jìn)腫瘤形成。研究還發(fā)現(xiàn)，TBK1/IKKε/JAK抑制劑CYT387（momelotinib）不僅抑制自噬，還能夠抑制這種反饋炎癥并降低PD-L1表達(dá)，限制KRAS驅(qū)動(dòng)的胰腺異常生長(zhǎng)[42]。

2.3 TBK1與腫瘤免疫

天然免疫感應(yīng)是促進(jìn)腫瘤中T細(xì)胞產(chǎn)生和滲透性的關(guān)鍵步驟。TBK1被廣泛認(rèn)為是天然免疫激酶，作為IFN-I反應(yīng)通路中STING的跨膜蛋白刺激物的下游蛋白。細(xì)胞內(nèi)病原體感染的核酸引起STING活化，進(jìn)而逐級(jí)啟動(dòng)下游信號(hào)，包括TBK1介導(dǎo)的IRF3和Stat6等，最終導(dǎo)致IFN-I和細(xì)胞因子產(chǎn)生[19,43]。在小鼠模型中，STING的激活能夠通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中IFN-β的產(chǎn)生，發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。在B16黑色素瘤、4T1乳腺癌以及CT26結(jié)腸癌的小鼠模型中，瘤內(nèi)注射STING激動(dòng)劑環(huán)狀二核苷酸衍生物均能夠誘導(dǎo)IFN-β、細(xì)胞因子和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生，抑制原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)并使其消退，同時(shí)也抑制遠(yuǎn)端病變的發(fā)生，促進(jìn)免疫記憶的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答[44]。Woo等[44]在該工作中強(qiáng)調(diào)了天然免疫調(diào)節(jié)策略的抗腫瘤功效，并暗示TBK1能夠作為潛在的抗腫瘤蛋白。

與上述研究結(jié)果相反地，Xiao等[45]發(fā)現(xiàn)在樹(shù)突狀細(xì)胞中，TBK1能夠促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，是抗腫瘤免疫的潛在靶標(biāo)。他們通過(guò)構(gòu)建選擇性敲除樹(shù)突狀細(xì)胞中TBK1的小鼠模型（TBK1-DKO）與野生型小鼠（WT）對(duì)比發(fā)現(xiàn)，TBK1為樹(shù)突狀細(xì)胞的非必需蛋白，TBK1的特異性缺失會(huì)破壞T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，使T細(xì)胞活化并引發(fā)自發(fā)性自身免疫；同時(shí)，皮下注射腫瘤細(xì)胞的TBK1-DKO小鼠的壽命更長(zhǎng)，腫瘤更小，提示TBK1的特異性缺失還增強(qiáng)了小鼠模型中的抗腫瘤免疫力。對(duì)TBK1-DKO和WT小鼠的骨髓和脾臟對(duì)比表明，二者具有相似的外周免疫譜，說(shuō)明TBK1對(duì)骨髓細(xì)胞發(fā)育不是至關(guān)重要的。然而，含有B16黑色素瘤的抗腫瘤免疫研究中，與WT小鼠相比，TBK1-DKO小鼠對(duì)腫瘤和淋巴結(jié)表現(xiàn)出更強(qiáng)的T細(xì)胞效應(yīng)以及抗PD-1治療的協(xié)同作用，并且在另外2種腫瘤細(xì)胞（EG7-OVA和EL4淋巴瘤細(xì)胞）也證實(shí)了這些結(jié)果。進(jìn)一步研究表明，TBK1能夠反向調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素受體（IFnAr）誘導(dǎo)的下游基因，敲除IFnAr1能夠抑制TBK1-DKO小鼠中異常的T細(xì)胞活化和自身免疫反應(yīng)。這些研究結(jié)果證實(shí)了TBK1在樹(shù)突狀細(xì)胞中的促腫瘤功能，TBK1通過(guò)抑制IFnAr1信號(hào)傳導(dǎo)以介導(dǎo)免疫耐受，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

盡管上述2篇文獻(xiàn)對(duì)TBK1在腫瘤免疫中的作用解釋相互矛盾，但可以發(fā)現(xiàn)TBK1的生物功能在不同的癌癥類型以及含有腫瘤的不同基質(zhì)細(xì)胞類型中都可能是不同的，目前對(duì)TBK1在腫瘤免疫研究中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，針對(duì)評(píng)價(jià)TBK1在某一種細(xì)胞類型和特定腫瘤中對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制研究可能為該領(lǐng)域的研究方向之一。

3 TBK1小分子抑制劑

TBK1在腫瘤、免疫、自噬等疾病中發(fā)揮重要作用，是多種疾病治療的重要潛在靶標(biāo)，因此，尋找TBK1小分子抑制劑具有重大意義：一方面可以為探究TBK1的復(fù)雜生物學(xué)功能提供小分子探針工具；另一方面也為相關(guān)疾病的治療提供藥物候選化合物。近年來(lái)對(duì)TBK1小分子抑制劑的報(bào)道逐漸增多，但仍非常有限。已報(bào)道的TBK1小分子抑制劑大多具有類似骨架，即2-氨基嘧啶類衍生物。盡管一些化合物對(duì)TBK1表現(xiàn)出較好的體外、體內(nèi)活性以及選擇性，但進(jìn)一步尋找高效的選擇性TBK1小分子抑制劑仍十分必要。

3.1 2-氨基嘧啶類TBK1小分子抑制劑

BX795（1）是最早被發(fā)現(xiàn)并申請(qǐng)專利保護(hù)的代表性TBK1小分子抑制劑[46]，最初作為PDK1抑制劑設(shè)計(jì)而被報(bào)道[47]，在進(jìn)一步激酶活性篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，BX795對(duì)多種蛋白激酶均表現(xiàn)出高抑制活性，其中對(duì) TBK1 的激酶活性（IC50= 2.3 nmol · L-1）比對(duì)原靶標(biāo)PDK1的活性（IC50=7 nmol · L-1）還要強(qiáng)；此外，對(duì) TBK1 同源蛋白 IKKε（IC50= 9.5 nmol · L-1）和Aurora B（IC50=11 nmol · L-1）等表現(xiàn)出高抑制活性，類似化合物BX320（2）對(duì)TBK1的抑制活性與BX795相當(dāng)[48]。進(jìn)一步在口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）細(xì)胞中的作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，BX795能夠抑制Akt和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期，并增加自噬癌細(xì)胞的產(chǎn)生，從而劑量依賴性地抑制癌細(xì)胞增殖[49]。Tu等[50]成功解析了BX795與TBK1蛋白的晶體結(jié)合模式（見(jiàn)圖3），BX795結(jié)合于TBK1蛋白的ATP結(jié)合口袋并形成多組相互作用。在鉸鏈區(qū)，BX795的1-N和4-NH能夠與Cys89形成2個(gè)氫鍵，8'-NH與β1折疊上Leu15的C = O形成氫鍵，BX795中9'位C = O分別與Ser93和Thr96形成3組氫鍵作用，在后口袋部分，BX795第6''位C = O能夠與Lys38形成一對(duì)氫鍵。BX795既可以結(jié)合于未活化的TBK1蛋白，也能夠與活化的TBK1蛋白結(jié)合。隨后以BX795結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，研究人員又陸續(xù)優(yōu)化、報(bào)道了多種2-氨基嘧啶類TBK1小分子抑制劑。

英國(guó)鄧迪大學(xué)的Clark等[51]對(duì)BX795進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到化合物MRT67307（3），其具有良好的激酶抑制活性，對(duì)TBK1和IKKε的IC50分別為19和160 nmol · L-1，而對(duì)同源蛋白IKKα和IKKβ未表現(xiàn)出明顯的抑制活性；與BX795不同，MRT67307對(duì)JNK和p38 MAPK等蛋白也不具有抑制活性，展現(xiàn)了較好的選擇性。在解析的MRT67307與TBK1蛋白晶體結(jié)構(gòu)中，2-氨基嘧啶的結(jié)構(gòu)保持了化合物在鉸鏈區(qū)與Cys89形成的2個(gè)氫鍵作用，第6''位C = O與Thr156形成氫鍵，尾部的環(huán)丁基被DFG區(qū)域包裹（見(jiàn)圖4）[50]。與BX795結(jié)構(gòu)頭部不同，MRT67307頭部甲基嗎啉的結(jié)構(gòu)伸向溶劑域，未與蛋白形成多個(gè)氫鍵作用，這可能是導(dǎo)致MRT67307較BX795活性低的原因。

圖3 BX795與TBK1共晶結(jié)構(gòu)（PDB: 4jl9）Figure 3 Co-crystal structure of BX795 with TBK1（PD: 4jl9）

Richters等[52]利用活性篩選的方法獲得了多個(gè)含有嘧啶結(jié)構(gòu)的TBK1抑制劑，經(jīng)過(guò)一系列結(jié)構(gòu)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，在嘧啶結(jié)構(gòu)第2、4、6位帶有取代基的骨架結(jié)構(gòu)有助于提高TBK1抑制活性，并優(yōu)選出化合物 4 ～ 7，其對(duì) TBK1 的 IC50為 0.06 ～ 0.38 μmol · L-1，其中以含有強(qiáng)吸電子基團(tuán)硝基的化合物4活性最優(yōu)；同時(shí)這類化合物也展現(xiàn)出較好的體外抗炎活性。

McIver等[53]報(bào)道了一系列BX795衍生物（8 ～15）作為T(mén)BK1選擇性抑制劑。通過(guò)改變5位取代基團(tuán)，如溴、碘、脲、芳基酰胺、N-甲基哌啶等，開(kāi)發(fā)了40多種不同的5-取代-2，4-二氯嘧啶中間體。其中，化合物11對(duì)TBK1抑制活性最強(qiáng)，IC50達(dá)2 nmol · L-1?；衔?5也具有高抑制活性（IC50=8 nmol · L-1）和選擇性，并且在人和小鼠肝微粒體中表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。此外，化合物15還能夠抑制小鼠體內(nèi)LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子釋放。

Scripps研究所報(bào)道了以2-氨基-4-(3-氰基-40-吡咯烷)苯基-嘧啶的剛性結(jié)構(gòu)為骨架的一類2-氨基嘧啶類TBK1小分子抑制劑[54]。他們以JNK抑制劑SR8185（16）為先導(dǎo)化合物，通過(guò)系統(tǒng)的構(gòu)效關(guān)系研究和結(jié)構(gòu)優(yōu)化成功獲得對(duì)TBK1具有高抑制活性和高選擇性的化合物17和18，其IC50均小于1 nmol·L-1。化合物17和18在人乳腺癌、前列腺癌和口腔癌細(xì)胞中都表現(xiàn)出良好的細(xì)胞抑制活性，并且在異種移植和同種異體移植小鼠模型中能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，顯示出較好的體內(nèi)抗腫瘤活性。此外，化合物17和18具有低相對(duì)分子質(zhì)量、低細(xì)胞色素P450抑制和高代謝穩(wěn)定性等成藥特性，有望成為T(mén)BK1抑制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)的潛在候選化合物。

圖4 MRT67307與TBK1共晶結(jié)構(gòu)（PDB: 4iwq）Figure 4 Co-crystal structure of MRT67307 with TBK1 (PDB: 4iwq)

Domainex是研發(fā)TBK1/IKKε激酶抑制劑較早的藥物研發(fā)公司之一，他們?cè)O(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了80余個(gè)含有2-氨基嘧啶的TBK1/IKKε激酶抑制劑（如19～22），其中多個(gè)化合物具有較好的口服生物利用度、強(qiáng)效的體外激酶抑制活性，并且在動(dòng)物疾病模型中也表現(xiàn)出較好的體內(nèi)活性，可用于治療TBK1相關(guān)疾病[55]。特別地，化合物20和21對(duì)TBK1具有高激酶抑制活性，IC50達(dá)到 1～2 nmol·L-1，且對(duì)其他相似蛋白，如IKKβ、JNK-1、JNK-3表現(xiàn)出200倍以上的選擇性。有趣的是，在進(jìn)一步進(jìn)行的炎癥小鼠模型試驗(yàn)中，該類化合物能夠抑制多種促炎細(xì)胞因子，包括TNF-α、RANTES、IL-1β、IL-6，且不會(huì)出現(xiàn)副作用。這些結(jié)果表明該類化合物有望作為治療TBK1相關(guān)炎癥等疾病的藥物候選化合物進(jìn)行進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)。

Myrexis公司是研發(fā)TBK1抑制劑領(lǐng)先的藥物公司之一，設(shè)計(jì)合成了超過(guò)670個(gè)2-氨基嘧啶類化合物（如23～28）[56]，其中大量化合物具有良好的TBK1抑制活性，IC50小于 10 nmol·L-1。代表性化合物MPI-0485520（23）對(duì)TBK1具有強(qiáng)效的抑制活性和選擇性，IC50達(dá)到500 pmol·L-1。多個(gè)化合物在炎癥小鼠模型中表現(xiàn)出良好的體內(nèi)外抑制活性，能夠顯著抑制RANTES、IP-10和IFNβ蛋白表達(dá)。例如，化合物26～28對(duì)RANTES的IC50均小于10 nmol·L-1，化合物26對(duì)IP-10和IFNβ的IC50分別為60和40 nmol·L-1，表明該類化合物對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他相關(guān)疾病的患者具有潛在的治療效果。

最近，Thomson等[57]報(bào)道了一個(gè)新型的2-氨基嘧啶類選擇性TBK1小分子抑制劑GSK8612（29），該化合物具有良好的細(xì)胞活性，能夠抑制淋巴瘤細(xì)胞Ramos中TLR3誘導(dǎo)的IRF3磷酸化、人原代單核細(xì)胞中IFN-I的分泌，以及人淋巴瘤細(xì)胞THP1中IFN-β的產(chǎn)生。同時(shí)，GSK8612在多種細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)顯著的脫靶靶點(diǎn)，表現(xiàn)出較好的TBK1選擇性，能夠作為探針?lè)肿舆M(jìn)一步探究TBK1在免疫、神經(jīng)炎癥、肥胖及腫瘤中的生物學(xué)功能。

3.2 3H-咪唑并[4, 5-b]吡啶類TBK1小分子抑制劑

2012年阿斯利康公司報(bào)道了44個(gè)3H-咪唑并[4，5-b]吡啶類TBK1小分子抑制劑[58]，幾乎所有這些化合物在1 μmol · L-1濃度下均顯示出對(duì)TBK1的激酶抑制活性，多個(gè)化合物（30 ～ 37）IC50均小于10 nmol · L-1。代表性化合物33、35、36對(duì)TBK1激酶表現(xiàn)出強(qiáng)抑制活性，其IC50分別為4、3 和4 nmol · L-1，但這3個(gè)化合物缺乏對(duì)其他激酶如IKKε、Aurora B和CDK2的選擇性?；衔?7對(duì)TBK1顯示出較好選擇性，對(duì) TBK1、IKKε的IC50分別為9 和 46 nmol ·L-1，而對(duì)Aurora B和CDK2沒(méi)有明顯的抑制活性。

2014年，阿斯利康公司繼續(xù)報(bào)道了另外35個(gè)作為T(mén)BK1小分子抑制劑的3H-咪唑并[4, 5-b]吡啶類衍生物（如化合物38 ～ 41）[59]。通過(guò)引入噻唑基團(tuán)所得的化合物41對(duì)TBK1具有強(qiáng)抑制活性，IC50為9 nmol · L-1，而對(duì) IKKε、Aurora B 和 CDK2 的 IC50分別為 42 nmol · L-1、1.45 μmol · L-1和 0.284 μmol · L-1，表現(xiàn)出對(duì)TBK1較強(qiáng)的抑制活性和選擇性?；衔?9也具有較好的選擇性，對(duì)TBK1、IKKε和Aurora B 的 IC50分別為 77 nmol · L-1、0.273 μmol · L-1和 5.92 μmol · L-1，對(duì) CDK2 則沒(méi)有明顯抑制作用。

3.3 Amlexanox類TBK1小分子抑制劑

Amlexanox（42）是美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的治療哮喘和口腔潰瘍的藥物，2013年被確定為T(mén)BK1和IKKε抑制劑，其對(duì) 2 種激酶的 IC50為 1 ～ 2 μmol · L-1[60-61]。在肥胖小鼠模型中，amlexanox能夠顯著影響小鼠體內(nèi)代謝功能，恢復(fù)cAMP對(duì)兒茶酚胺的敏感性，激活p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），誘導(dǎo)脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白1（Ucp1）的表達(dá)，通過(guò)增加能量消耗導(dǎo)致體質(zhì)量減輕，同時(shí)，amlexanox還能夠通過(guò)IL-6激活肝JAK/STAT通路，改善胰島素敏感性，調(diào)節(jié)葡萄糖水平[62]。鑒于amlexanox在臨床使用中具有良好的安全性，Oral等[63]在2型糖尿病和非酒精性脂肪肝患者中進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)amlexanox能夠改善糖尿病患者的血糖水平，部分患者表現(xiàn)出肝臟脂肪減少的治療效果，這可能與能量消耗增加有關(guān)。最近，Beyett等[64]設(shè)計(jì)合成了一系列amlexanox衍生物（43 ～ 47）作為T(mén)BK1/IKKε選擇性抑制劑，多數(shù)衍生物對(duì)TBK1表現(xiàn)出微摩爾級(jí)的激酶抑制活性。他們重點(diǎn)探討了3位取代基對(duì)活性的影響，并成功解析了amlexanox以及化合物43、45、46與TBK1蛋白的晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖5）。與2-氨基嘧啶類抑制劑類似，在TBK1蛋白鉸鏈區(qū)，amlexanox中1-N、2-NH2也分別與Cys89、Glu87形成2個(gè)氫鍵，3位羧基對(duì)活性保持很重要，當(dāng)成酯或變成酰胺后活性下降，如化合物43對(duì)TBK1的活性下降為amlexanox的1/70，其IC50為55 μmol · L-1。當(dāng) 3 位羧基替換成四氮唑（化合物 46）時(shí)，能夠與 Met86 形成氫鍵作用，IC50為 0.4 μmol · L-1，比 amlexanox（IC50=0.8 μmol · L-1）活性提高 1 倍。

圖5 化合物42、43、45和46與TBK1共晶結(jié)構(gòu)Figure 5 Co-crystal structures of compounds 42, 43, 45 and 46 with TBK1

3.4 TBK1小分子蛋白降解劑

蛋白降解靶向嵌合體（proteolysis-targeting chimaera，PROTAC）技術(shù)是將靶蛋白配體與E3連接酶配體連接形成雙功能分子，募集E3連接酶至靶蛋白以促進(jìn)其泛素化，進(jìn)而被蛋白酶體系統(tǒng)識(shí)別并降解。PROTAC在藥物研發(fā)中具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)已成為熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。最近，Crews等[65]已成功將PROTAC技術(shù)應(yīng)用于TBK1靶向降解。他們將2-氨基嘧啶類TBK1小分子配體48/49與E3連接酶VHL配體（50）連接起來(lái)，并對(duì)TBK1配體和連接鏈進(jìn)行了系統(tǒng)的構(gòu)效研究，優(yōu)化得到的化合物51能夠顯著地劑量依賴性地降解TBK1 蛋白（DC50=12 nmol·L-1，Dmax=96%），而不影響同源蛋白IKKε表達(dá)，具有高選擇性。特別地，在多種含有KRAS突變型和野生型細(xì)胞，包括H23細(xì)胞、A549細(xì)胞、H1792細(xì)胞、H2110細(xì)胞和HCC827細(xì)胞中，化合物51均能夠顯著抑制TBK1蛋白表達(dá)。該化合物為進(jìn)一步研究TBK1相關(guān)生物學(xué)功能提供了重要的小分子探針工具。

4 總結(jié)與展望

TBK1蛋白參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、免疫反應(yīng)、自噬、炎癥、代謝等多種生理學(xué)過(guò)程。盡管有研究表明TBK1在黑色素瘤、NSCLC、乳腺癌等腫瘤生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用，但其過(guò)程涉及對(duì)細(xì)胞周期、自噬、免疫等諸多方面影響，分子作用機(jī)制尚未完全明確，還需進(jìn)一步細(xì)化研究TBK1在不同的疾病、不同細(xì)胞類型中的潛在生物學(xué)功能及作用機(jī)制。目前針對(duì)TBK1抑制劑研究，除amlexanox獲批用于臨床治療哮喘及口腔潰瘍外，尚無(wú)選擇性TBK1抑制劑進(jìn)入臨床研究，多數(shù)TBK1抑制劑研究集中于對(duì)2-氨基嘧啶類結(jié)構(gòu)骨架的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)新型高選擇性TBK1抑制劑仍十分必要，一方面，能夠?yàn)檫M(jìn)一步探究TBK1介導(dǎo)的生物機(jī)制研究提供重要的小分子探針，驗(yàn)證其作為腫瘤免疫治療靶標(biāo)的作用機(jī)制和可靠性；另一方面，也為針對(duì)TBK1的腫瘤免疫治療提供藥物候選化合物。