張?zhí)煜?梁家寧 楊揆 鄭龍 陳偉 張艷 宋立強(qiáng)

空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,西安710032

肺內(nèi)源性急性呼吸窘迫綜合征(pulmonary acute respiratory distress syndrome,ARDSp)是ARDS的最常見臨床類型,是指由直接影響肺實(shí)質(zhì)的病變?nèi)绶窝?、淹溺、毒氣、肺挫傷等誘發(fā)的ARDS,其中最常見的病因是感染[1]。目前認(rèn)為發(fā)病機(jī)制是感染相關(guān)啟動(dòng)因子誘導(dǎo)以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞在肺內(nèi)大量積聚、浸潤(rùn),過度釋放、活化炎癥因子,而抗炎因子相對(duì)減少,引發(fā)肺部炎癥反應(yīng)失衡[2]。其中支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中中性粒細(xì)胞百分比和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平是反映炎癥程度的常用監(jiān)測(cè)指標(biāo)[3-4]。但ARDSp病死率仍居高不下的主要原因是炎癥的啟動(dòng)機(jī)制仍未能完全闡明。

氣道上皮細(xì)胞是呼吸系統(tǒng)的第一道物理屏障,也是具有生物學(xué)活性的免疫屏障,對(duì)外界刺激能迅速做出功能性反應(yīng)甚或結(jié)構(gòu)性改變。近年研究發(fā)現(xiàn)氣道杯狀細(xì)胞分泌的人鈣激活氯離子通道1(human calcium-activated chloride channel 1,hCLCA1)蛋白與COPD、支氣管哮喘等氣道疾病的黏液高分泌及炎癥機(jī)制緊密相關(guān)[5-6]。但是氣道上皮杯狀細(xì)胞及h CLCA1在ARDSp發(fā)病機(jī)制中扮演怎樣的角色仍不清楚?；诖?本觀察性臨床研究擬探討h CLCA1表達(dá)水平與ARDSp患者肺部炎癥水平、臨床預(yù)后的相關(guān)性,試圖找到hCLCA1在ARDSp病理生理中發(fā)生變化的線索。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 2017年1月至2018年6月空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診及病房需要行支氣管鏡檢查的患者作為研究篩選對(duì)象,根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)分別收入ARDSp組、社區(qū)性獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)組及正常對(duì)照組。研究方案得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),檢測(cè)標(biāo)本得到入選患者的知情同意。

1.1.1ARDSp組納入標(biāo)準(zhǔn) (1)入住呼吸重癥監(jiān)護(hù)室并且未超過48 h；(2)符合ARDS柏林指南診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],病因系CAP；(3)排除COPD、哮喘、支氣管擴(kuò)張等慢性氣道基礎(chǔ)疾病、血液疾病及長(zhǎng)期吸煙史,近1周無(wú)使用全身皮質(zhì)激素史；(4)臨床診療過程已經(jīng)決定擬行支氣管鏡檢查及灌洗獲取下呼吸道標(biāo)本；(5)年齡≥18歲；(6)根據(jù)臨床特征排除單純性重癥CAP[8]。

1.1.2CAP組納入標(biāo)準(zhǔn) (1)已經(jīng)預(yù)約氣管鏡檢查的門診患者；(2)符合《中國(guó)成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南(2016年版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(3)病程未超過1周；(4)排除COPD、哮喘、支氣管擴(kuò)張等慢性氣道基礎(chǔ)疾病、血液疾病及長(zhǎng)期吸煙史,近1周無(wú)使用全身皮質(zhì)激素史；(5)年齡≥18歲；(6)未達(dá)到重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.3正常對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn) (1)已經(jīng)預(yù)約氣管鏡檢查的門診患者；(2)臨床診斷為孤立性肺部結(jié)節(jié)或包塊性質(zhì)待查；(3)排除COPD、哮喘、支氣管擴(kuò)張等慢性氣道基礎(chǔ)疾病、血液疾病及長(zhǎng)期吸煙史,近1周無(wú)使用全身皮質(zhì)激素史；(4)年齡≥18歲；(5)同意在正常肺葉獲取BALF。

1.2方法

1.2.1BALF標(biāo)本采集 根據(jù)ARDSp組和CAP組患者的影像學(xué)滲出性病灶、正常對(duì)照組患者的正常肺葉確定灌洗的靶位。經(jīng)支氣管鏡工作通道注入37℃無(wú)菌生理鹽水20 ml。注入完成后,抽吸灌洗液,回收率40%～60%為合格,經(jīng)雙層紗布過濾,收集至無(wú)菌容器置于含冰塊的保溫箱里,立即送往實(shí)驗(yàn)室檢查。

1.2.2BALF細(xì)胞計(jì)數(shù) 在4℃、1 200 r/min、離心半徑8.4 cm條件下離心10 min,上清液放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。沉淀的?xì)胞用Hank's液(不含Ca2+、Ma2+)再離心沖洗2次,每次5 min。棄去上清后加Hank's液3～5 ml制成細(xì)胞懸液。在Neubauer計(jì)數(shù)臺(tái)上計(jì)數(shù)BALF中細(xì)胞總數(shù)。如果細(xì)胞數(shù)過高時(shí),再用Hank's液稀釋,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×109/L,并同時(shí)將試管浸入碎冰塊中備用。計(jì)數(shù)方法：采用細(xì)胞離心涂片裝置,加入備用細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為5×109/L)100μl,在4℃、1 200 r/min、離心半徑8.4 cm條件下離心1 min,通過離心作用將一定數(shù)量的BALF細(xì)胞直接平鋪于載玻片上。取下載玻片立即用冷風(fēng)吹干,置于無(wú)水乙醇中固定30 min后進(jìn)行瑞吉式染色。在40倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)并計(jì)算中性粒細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)百分比。

1.2.3BALF蛋白含量檢測(cè) 取上述離心后獲取的BALF上清液,常溫下解凍,使用多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司),采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)TNF-α(由武漢博士德公司提供)及hCLCA1(由英國(guó)Abcam公司提供)水平。具體操作步驟如下：(1)從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條；(2)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品100μl；(3)樣本孔先加待測(cè)樣本10μl,再加樣本稀釋液40μl,空白孔不加；(4)除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μl,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃恒溫箱溫育90 min；(5)棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1 min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)5次；(6)每孔加入底物A、B各50μl,37℃避光孵育15 min；(7)每孔加入終止液50μl,在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,推導(dǎo)回歸方程,計(jì)算各組BALF中hCLCA1、TNF-α的水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以±s表示,處理組間分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)。指標(biāo)間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1一般資料 ARDSp組26例,其中男15例,女11例,年齡(59.3±6.7)歲。以28 d內(nèi)是否死亡為標(biāo)準(zhǔn)分為2個(gè)亞組：生存組14例,其中男8例,女6例,年齡(57.2±7.8)歲；死亡組12例,其中男7例,女5例,年齡(61.2±3.2)歲。生存組和死亡組的入院基線臨床指標(biāo)分別是氧合指數(shù)[(142.5±20.1)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)、(133.6±15.5)mm Hg]、APACHEⅡ評(píng)分[(17.3±3.1)分、 (18.4±7.2)分]、SOFA評(píng)分[(6.5±1.4)分、(7.2±2.5)分],組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CAP組26例,其中男16例,女10例,年齡(53.84±14.60)歲。正常對(duì)照組28例,其中男16例,女12例,年齡(50.03±15.3)歲。3組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,基礎(chǔ)情況具有均衡性。

2.2各組BALF中h CLCA1、TNF-α水平及中性粒細(xì)胞百分比的比較 與正常對(duì)照組比較,ARDSp組、CAP組BALF中hCLCA1、TNF-α、中性粒細(xì)胞百分比均顯著升高(P值均＜0.01)。ARDSp組BALF中hCLCA1、TNF-α、中性粒細(xì)胞百分比高于CAP組(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

表1 3組患者BALF中hCLCA1、TNF-α水平及中性粒細(xì)胞百分比的比較(±s)

表1 3組患者BALF中hCLCA1、TNF-α水平及中性粒細(xì)胞百分比的比較(±s)

注：BALF為支氣管肺泡灌洗液；hCLCA1為人鈣激活氯離子通道1；TNF-α為腫瘤壞死因子α；CAP為社區(qū)性獲得性肺炎；ARDSp為肺內(nèi)源性急性呼吸窘迫綜合征；與正常對(duì)照組比較,a P＜0.01；與CAP組比較,b P＜0.05,c P＜0.01

組別 例數(shù) hCLCA1(ng/L)TNF-α(ng/L)中性粒細(xì)胞百分比(%)正常對(duì)照組 28 5.03±1.55 5.52±1.64 1.32±0.98 CAP組 26 22.35±11.85a 52.58±28.81a 43.25±16.15a ARDSp組 26 50.01±20.72ab 80.73±25.91ab 74.37±10.13ac

2.3不同預(yù)后ARDSp患者治療前后BALF中hCLCA1、TNF-α及中性粒細(xì)胞百分比的比較 治療前,ARDSp死亡組BALF中hCLCA1、TNF-α均高于生存組(P值分別為0.035、＜0.01),2組BALF中中性粒細(xì)胞百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與治療前比較,ARDSp死亡組BALF中hCLCA1、TNF-α、中性粒細(xì)胞百分比在治療7 d后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ARDSp生存組BALF中hCLCA1、TNF-α、中性粒細(xì)胞百分比在治療7 d后下降(P值均＜0.05)。見表2。

表2 不同預(yù)后ARDSp患者治療前后BALF中hCLCA1、TNF-α及中性粒細(xì)胞百分比的比較(±s)

表2 不同預(yù)后ARDSp患者治療前后BALF中hCLCA1、TNF-α及中性粒細(xì)胞百分比的比較(±s)

注：ARDSp為肺內(nèi)源性急性呼吸窘迫綜合征；BALF為支氣管肺泡灌洗液；hCLCA1為人鈣激活氯離子通道1；TNF-α為腫瘤壞死因子α

組別 例數(shù) hCLCA1(ng/L)TNF-α(ng/L)中性粒細(xì)胞百分比(%)治療前 治療7 d后 P值治療前 治療7 d后 P值治療前 治療7 d后 P值生存組 14 38.12±16.27 27.05±12.75 0.043 60.82±18.47 44.79±18.70 0.034 72.64±6.89 64.35±11.92 0.039死亡組 12 52.29±17.46 63.79±12.45 0.081 96.33±21.17 106.91±12.09 0.150 76.38±12.61 72.91±17.68 0.610 P值 0.035 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.490 0.170

2.4ARDSp患者BALF中各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性直線相關(guān)分析顯示,ARDSp患者BALF中hCLCA1與TNF-α呈正相關(guān)(r=0.823,P＜0.05),BALF中中性粒細(xì)胞百分比與TNF-α呈正相關(guān)(r=0.417,P＜0.05),同時(shí)與hCLCA1也呈正相關(guān)(r=0.430,P＜0.05)。

3 討論

全身及肺部炎癥風(fēng)暴目前仍被公認(rèn)為是ADRS的主要發(fā)病機(jī)制。包括肺炎在內(nèi)的多種肺內(nèi)外病因能誘發(fā)過度活化的炎癥反應(yīng)發(fā)生,其中肺內(nèi)中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的激活以及大量炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子的釋放被認(rèn)為是ARDS的特征性炎癥標(biāo)志。但是這種炎癥風(fēng)暴的始動(dòng)機(jī)制仍不清楚,以至于在ARDS發(fā)生后臨床只能被動(dòng)地給予支持對(duì)癥處理,而且針對(duì)炎癥本身采取的糖皮質(zhì)激素、一氧化氮、西維來司他、他汀等治療方案在臨床研究中均未能獲得預(yù)期療效,“積極等待”炎癥水平回落成為臨床的無(wú)奈事實(shí)。

炎癥細(xì)胞數(shù)量及炎癥介質(zhì)水平仍然是臨床評(píng)判炎癥程度的直接指標(biāo)。TNF-α作為促炎分子之一,其可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的吞噬能力,促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒和釋放溶酶體,增強(qiáng)中性粒細(xì)胞呼吸暴發(fā),產(chǎn)生大量脂質(zhì)代謝產(chǎn)物,引起微血管舒縮異常和微血栓形成,加速ARDS的發(fā)展進(jìn)程。Kim等[10]研究認(rèn)為ARDS患者氣道中中性粒細(xì)胞的水平與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān),在氣道炎癥中發(fā)揮著重要作用。另有研究認(rèn)為,TNF-α是ARDS發(fā)生炎癥介質(zhì)“瀑布”樣反應(yīng)的始動(dòng)因子,可以刺激其他細(xì)胞因子和炎癥因子的生成和釋放,形成逐級(jí)放大的連鎖反應(yīng),進(jìn)一步損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,增加其通透性,導(dǎo)致白細(xì)胞黏附、中性粒細(xì)胞脫顆粒并趨化到炎癥損傷部位,加重肺部損傷,在ARDS的發(fā)生中發(fā)揮著極為重要的作用[11]。本課題組曾使用內(nèi)毒素誘導(dǎo)建立ARDS小鼠模型,得出ARDS小鼠BALF中TNF-α含量明顯高于正常小鼠的結(jié)果[12]。然而針對(duì)TNF-α的單抗沒能在臨床研究中改善預(yù)后,可見復(fù)雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)機(jī)制在ARDS發(fā)生中共同發(fā)揮著作用。此外,Abraham等[13]提出BALF中中性粒細(xì)胞百分比可以很直觀反映急性肺損傷的嚴(yán)重程度的觀點(diǎn),驗(yàn)證了肺損傷程度與肺泡內(nèi)中性粒細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARDSp患者BALF中的TNF-α水平均明顯高于CAP患者及正常對(duì)照組；ARDSp生存組TNF-α水平低于死亡組,同時(shí)治療7 d后該組的TNF-α水平較治療前下降。提示了TNF-α是肺組織炎癥水平的重要標(biāo)識(shí)因子之一。此研究中ARDSp患者BALF中中性粒細(xì)胞百分比與TNF-α呈正相關(guān),ARDSp生存組在治療7 d后BALF中中性粒細(xì)胞百分比也較治療前下降,此結(jié)果再一次驗(yàn)證了TNF-α及中性粒細(xì)胞在ARDSp嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)中的意義。

氣道上皮細(xì)胞是否參與ARDS肺部炎癥風(fēng)暴的形成仍不清楚。防治ARDS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)仍然是闡明其炎癥的始動(dòng)機(jī)制,位于氣道第一屏障的上皮細(xì)胞是否在ARDSp發(fā)生中扮演一定的始動(dòng)作用呢?本研究擬初步探討既往未知的氣道上皮杯狀細(xì)胞及相關(guān)蛋白在ARDSp發(fā)生、發(fā)展中的角色。氣道杯狀細(xì)胞特有的hCLCA1最初被認(rèn)為是一種跨膜蛋白,目前確認(rèn)hCLCA1是分泌型蛋白,裂解的N端肽段對(duì)上皮細(xì)胞Cl-通道具有調(diào)節(jié)作用,能調(diào)控黏液蛋白的合成[14],其與氣道慢性炎癥(包括哮喘、COPD和肺囊性纖維化等)的發(fā)生與程度密切相關(guān)[15-19]。有研究表明,hCLCA1與肺部感染性炎癥的形成相關(guān)。如Hauber等[20]使用內(nèi)毒素可以直接誘導(dǎo)培養(yǎng)人氣道黏液細(xì)胞分泌hCLCA1。2014年Dietert等[21]報(bào)道m(xù)CLCA3-/-小鼠金黃色葡萄球菌肺炎模型BALF中趨化因子CXCL1及IL-17減少,并降低了肺部中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。以上結(jié)果初步證實(shí)了氣道上皮合成的CLCA參與了肺部感染性炎癥的形成并可能扮演促進(jìn)作用,而其與ARDS之間的關(guān)系正是本研究設(shè)計(jì)時(shí)關(guān)注的要點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示ARDSp患者BALF中的hCLCA1高于CAP患者及正常對(duì)照組。ARDSp死亡組BALF中hCLCA1高于生存組,經(jīng)過治療未能下降,而生存組則有所降低。通過直線相關(guān)性分析得出hCLCA1與TNF-α水平呈正相關(guān),這種相關(guān)性提示兩者在ARDSp病理生理改變中可能存在一定因果關(guān)系。

總之,本研究以ARDSp為主要目標(biāo)人群,以BALF中hCLCA1水平為主要目標(biāo)指標(biāo),通過對(duì)ARDSp、CAP及正常肺葉人群BALF中hCLCA1、TNF-α水平及中性粒細(xì)胞百分比的變化、相關(guān)性以及與預(yù)后轉(zhuǎn)歸的關(guān)系分析,初步提示氣道上皮hCLCA1與ARDSp的肺組織炎癥水平及預(yù)后可能存在一定正相關(guān)性,推測(cè)CLCA可能對(duì)ARDS炎癥機(jī)制具有促進(jìn)作用,需要在動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突