張海威，程悅寧，王曉旭，周玉成，喬連江，周曼莉，趙蒙，2，程世鵬，楊艷玲※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112；2.山東省樂(lè)陵市人民政府，山東 樂(lè)陵 253600）

水貂出血性肺炎的病原體由傳統(tǒng)的單一病原體（銅綠假單胞菌）感染逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N病原體混合感染，其中，包括肺炎克雷伯、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等，引起水貂的高致病性死亡[1-4]。銅綠假單胞菌和大腸桿菌普遍存在于自然環(huán)境中，是畜禽、野生動(dòng)物、受傷病人的重要病原菌，可導(dǎo)致胃腸炎、出血性結(jié)腸炎[5-8]。隨著我國(guó)水貂養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，巨大經(jīng)濟(jì)利益誘發(fā)水貂養(yǎng)殖戶盲目地?cái)U(kuò)大飼養(yǎng)規(guī)模，部分養(yǎng)殖場(chǎng)是小規(guī)模養(yǎng)殖戶[9]，銅綠假單胞菌和大腸桿菌廣泛存在于土壤、飼料、產(chǎn)箱等水貂飼養(yǎng)的環(huán)境中[10]。出血性肺炎在夏秋時(shí)節(jié)多發(fā)，對(duì)10月齡水貂可造成大范圍急性死亡，發(fā)病率高達(dá)54%[11]。銅綠假單胞菌和大腸桿菌均為條件性治病菌，菌體本身帶來(lái)的耐藥性、自身的耐藥機(jī)制、長(zhǎng)時(shí)間抗生素的大量使用導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性逐年增強(qiáng)，導(dǎo)致水貂出血性肺炎的防治難度加大[12-15]。所以，研制一種針對(duì)水貂出血性肺炎的多價(jià)滅活疫苗，勢(shì)在必行。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 E、G、D 型3 種高致病性銅綠假單胞菌菌株和H11 基因型高致病性大腸桿菌菌株均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB）（美國(guó) BD 公司）；瓊脂粉（Agar）（西格瑪奧德里奇公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京索萊寶科技有限公司）；甲醛（丹東市龍海試劑廠）；AL（OH）3（上海創(chuàng)宏生物科技有限公司）。

1.1.3 儀器 一次性注射器（長(zhǎng)春金康源醫(yī)用器具有限公司）；分裝器（保定創(chuàng)銳泵業(yè)有限公司）；磁力攪拌器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；搖床（QYC 211）（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 200 只8月齡健康雄性水貂，體重1.6～2.0 kg，購(gòu)自吉林中特農(nóng)業(yè)科技有限公司異獸路分公司。

1.2 方法

1.2.1 半數(shù)致死量的確定 將E、G、D 不同血清型銅綠假單胞菌和H11 基因型大腸桿菌菌種分別命名為1號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)菌株并將菌株分別劃線于TSA 培養(yǎng)基上，挑取單菌落接種于5 mL TSB 肉湯中，37 ℃220 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)，1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)采用菌落計(jì)數(shù)法調(diào)整菌液濃度，其濃度分別為2.2×108、1.2×108、1.0×108、2.0×108CFU/mL，用 PBS 10 倍梯度稀釋，稀釋后濃度分別為 2.2×106～2.2×108、1.2×106～1.2×108、1.0×106～1.0×108、2.0×106～2.0×108CFU/mL。將 80 只水貂隨機(jī)分成16 組，每組5 只。分別取不同稀釋度菌液皮下注射水貂，劑量為 1 mL/只，其中第 4、8、12、16組為空白對(duì)照組，其皮下注射同量的PBS。連續(xù)觀察5～7 d 記錄水貂死亡情況。

1.2.2 菌株的滅活 將 1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)菌株分別劃線于TSA 平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單一菌落接種于 5 mL TSB 培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)，采用活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算菌體數(shù)量。

將上述菌液按照1∶50 比例分別導(dǎo)入2 500 mL TSB中培養(yǎng)24 h，加入最終濃度為0.35%的甲醛溶液，邊加邊攪拌。37 ℃滅活48 h，每隔3 h 震動(dòng)搖晃1 次。取1 mL 滅活后接種于TSA 平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察TSA平板上是否有細(xì)菌生長(zhǎng)，若無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)則證明無(wú)菌滅活完全。

1.2.3 二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗的制備 將滅活的4 株菌液濃度調(diào)整為 1.0×109CFU/mL，與 40%的 AL（OH）3溶液按照1∶1∶1∶1∶1 混合充分乳化并加入終濃度為0.01%硫柳汞，即為水貂出血肺炎二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗。

1.2.4 超劑量接種安全檢驗(yàn) 將制備的二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗接種于5 mL 的TSB 培養(yǎng)基中37 ℃靜置過(guò)夜培養(yǎng)，并設(shè)立TSB空白對(duì)照組，觀察培養(yǎng)液是否渾濁。取3 mL 二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗，后腿皮下注射免疫5 只水貂，設(shè)置空白對(duì)照組，21 d內(nèi)觀察水貂免疫后的精神狀態(tài)。

1.2.5 最小免疫劑量 將80 只水貂隨機(jī)分成16 組，5 只/組。第 1 天首免，第 7 天和第 14 天 2 免和 3 免。免疫21 d后，用10 LD50（1.0×108CFU）疫苗菌株（1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)菌株）感染水貂，5～7 d內(nèi)觀察記錄水貂死亡率和發(fā)病率，其中第4、8、12、16 組均為空白對(duì)照組，其余為實(shí)驗(yàn)組。見(jiàn)表1。

1.2.6 攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn) 對(duì)40 只水貂隨機(jī)分成8 組，5只/組，第 1、3、5、7 組為實(shí)驗(yàn)組，第 2、4、6、8 組為空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組皮下注射該疫苗0.5 mL，首免疫后第7 d 和14 d 對(duì)水貂再次進(jìn)行2 免和3 免；空白對(duì)照組注射同等劑量的PBS 緩沖液。免疫21 d 后用10 LD50 疫苗菌株（1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)菌株）感染水貂。攻毒后5～7 d 內(nèi)觀察并記錄水貂死亡率和發(fā)病率。見(jiàn)表2。

表1 水貂最小免疫劑量分組及測(cè)定Tab.1 Minimum immune grouping and determination of mink

表2 水貂攻毒保護(hù)試驗(yàn)Tab.2 Immune attack protection of mink

1.2.7 水貂出血性肺炎二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗臨床應(yīng)用對(duì)山東省、河北省的8 個(gè)水貂養(yǎng)殖場(chǎng)共7 000 只水貂進(jìn)行出血性肺炎二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗的接種，觀察免疫后水貂情況。

2 結(jié)果

2.1 半數(shù)致死量的確定

水貂感染分離株后48～72h水貂出現(xiàn)呼吸急促、抖動(dòng)、快速死亡、食欲下降、被毛凌亂、飲水減少等情況，從死亡水貂腫脹的脾臟中均可分離出大量的1 號(hào)、2號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)菌株。1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)菌株的半數(shù)致死量分別為 2.2×107、1.2×107、1.0×107、2.0×107CFU，見(jiàn)表3。

2.2 菌株滅活

菌板未見(jiàn)細(xì)菌單菌落，1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)菌株滅活完全，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗的制備及超劑量接種安全檢驗(yàn)

TSB 培養(yǎng)基中未出現(xiàn)渾濁，即二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗制作成功，同時(shí)安全性檢驗(yàn)結(jié)果顯示陰性。超劑量滅活疫苗免疫后21 d內(nèi)水貂采食、精神狀態(tài)均未出現(xiàn)明顯異常變化，再次證明疫苗制作比較成功。

2.4 水貂最小免疫劑量的確定

0.5 mL 二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗對(duì)4 種菌株感染的水貂均能達(dá)到100%的免疫保護(hù)，對(duì)照組全部死亡，該疫苗對(duì)水貂的最小免疫劑量為0.5 mL，見(jiàn)表4。

表3 水貂半數(shù)致死量試驗(yàn)Table 3 Half lethal dose test of mink

表4 水貂最小免疫劑量確定Tab.4 Minimum immunization dose of mink

2.5 水貂攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)

水貂保護(hù)率均為100%，即二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗對(duì)1號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)備選疫苗株免疫效果較好，見(jiàn)表5。

表5 水貂攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)Table 5 Immune attack protection of mink

2.6 水貂出血性肺炎二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗臨床應(yīng)用

7 000 只水貂均未出現(xiàn)不良反應(yīng)，說(shuō)明該疫苗研制成功且對(duì)水貂出血性肺炎具有較好的防控效果。

3 討論

目前，水貂出血性肺炎疫苗的備選菌株均由不同血清型的銅綠假單胞菌滅活后研制而成，其中，銅綠假單胞菌的血清型以G 型為主，B 型為輔[16]。該疫苗對(duì)出血性肺炎起到了一定的保護(hù)作用，但近年來(lái)，免疫該疫苗的水貂仍發(fā)生以出血性肺炎為典型癥狀的死亡病例。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，水貂出血性肺炎不再是單一銅綠假單胞菌感染引起發(fā)病，而且銅綠假單胞菌的血清型也不再是以G 型為主，B 型為輔。目前，水貂出血性肺炎是一種多病原體混合感染引起的呼吸道細(xì)菌性疾病，以銅綠假單胞菌和大腸桿菌為主，存在銅綠假單胞菌或大腸桿菌單獨(dú)感染和混合感染情況。為此，本研究采集全國(guó)四個(gè)省份28 份具有典型水貂出血性肺炎癥狀的病料，分離得到主要致病菌，并制備了水貂出血性肺炎二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗，該疫苗填補(bǔ)了我國(guó)出血性肺炎疫苗防治的空白，該疫苗研制成功也是首次被公開(kāi)報(bào)道。

細(xì)菌滅活疫苗是臨床上常用的疾病防控手段之一，在臨床上發(fā)揮著無(wú)法估量的作用[17]。菌株的滅活是衡量疫苗安全性的重要標(biāo)準(zhǔn)，因此對(duì)滅活疫苗進(jìn)行無(wú)菌檢查是非常重要的環(huán)節(jié)[18]。若滅活菌株被其它細(xì)菌或霉菌污染，會(huì)間接造成其它細(xì)菌或霉菌對(duì)動(dòng)物體造成感染，進(jìn)一步對(duì)動(dòng)物體造成二次傷害，很可能會(huì)導(dǎo)致免疫動(dòng)物的大面積死亡，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。安全性實(shí)驗(yàn)是為確保動(dòng)物試驗(yàn)中免疫的水貂不會(huì)因?yàn)橐呙绫旧韺?duì)其造成影響，如免疫后水貂的發(fā)熱、死亡、采食量減少、接種部位的破潰等現(xiàn)象的發(fā)生[19]。

免疫滅活疫苗是防治水貂細(xì)菌性疾病的主要手段，評(píng)價(jià)疫苗的好壞主要取決于疫苗的免疫效價(jià)、最小免疫劑量和疫苗的安全性等因素影響。本研究通過(guò)對(duì)自制二聯(lián)四價(jià)水貂出血性肺炎滅活疫苗進(jìn)行臨床動(dòng)物試驗(yàn)，可知該疫苗對(duì)水貂的最小免疫劑量為0.5 mL（含菌量 5.0×108CFU）。

二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗免疫水貂后，疫苗的副作用很難評(píng)價(jià)，雖然我國(guó)在這方面沒(méi)有嚴(yán)格的規(guī)定或副反應(yīng)詳情，但動(dòng)物的安全性方面是必須考慮的。應(yīng)觀察疫苗接種部位的變化，疫苗接種與副反應(yīng)之間存在明顯的時(shí)間關(guān)系性。免疫水貂在幾秒鐘或幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯的過(guò)敏反應(yīng)有可能與疫苗的接種有直接關(guān)系，但疫苗接種幾周后出現(xiàn)的不良反應(yīng)不一定有因果關(guān)系，也可能是其它原因如水貂自身原因、注射操作不當(dāng)、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)不良等[20-22]。相關(guān)研究報(bào)道表明，疫苗中的致敏原刺激機(jī)體產(chǎn)生IgE 抗體，IgE 抗體又是過(guò)敏反應(yīng)的主要抗體，間接引發(fā)動(dòng)物體全身低壓肺高壓，引起水貂出現(xiàn)呼吸困難、肺水腫、出血、淤血等病理變化[23]。個(gè)體原因指?jìng)€(gè)體的差異性造成的，如過(guò)敏體質(zhì)。注射操作不當(dāng)指捕捉水貂時(shí)機(jī)體由于高度緊張?jiān)斐傻目只徘闆r，突發(fā)性的出現(xiàn)免疫副作用反應(yīng)。注射器械的未完全消毒和交叉使用也可能將病原體間接注射到水貂體內(nèi)[24]。疫苗副反應(yīng)嚴(yán)重時(shí)可造成水貂當(dāng)場(chǎng)死亡，給養(yǎng)殖戶造成心理上的恐慌同時(shí)出現(xiàn)拒絕接種疫苗現(xiàn)象[25]。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)間接造成水貂發(fā)病后不治而亡，進(jìn)一步阻礙了水貂養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

小鼠動(dòng)物免疫效果無(wú)法取代本源動(dòng)物免疫效果，因此，本研究選取水貂為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)研究。韓明明[26]等報(bào)道，水貂出血性肺炎綠膿桿菌三價(jià)滅活疫苗中銅綠假單胞菌血清型分別為G、I型和C型。白雪等[11]等報(bào)道，銅綠假單胞菌疫苗研究進(jìn)展中綠膿桿菌的血清型為G、B 型和C 型。表明水貂出血性肺炎疫苗中銅綠假單胞菌的血清型不同，主要為G型。在感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌E 型、D 型與G型毒力相當(dāng)，E型、D型分離株感染水貂也可造成與G型同等程度的經(jīng)濟(jì)損失，且首次發(fā)現(xiàn)與G型致病力相當(dāng)?shù)?D 型菌株。由于銅綠假單胞菌各血清型之間不存在交叉保護(hù)，故常規(guī)出血性肺炎疫苗只針對(duì)特定血清型的銅綠假單胞菌產(chǎn)生較好的保護(hù)力。新血清型銅綠假單胞菌感染水貂時(shí)，常規(guī)出血性肺炎疫苗未必能對(duì)水貂產(chǎn)生保護(hù)力，可能導(dǎo)致水貂出血性肺炎的全面爆發(fā)給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

4 結(jié)論

成功制備了檢驗(yàn)合格的新型水貂出血性肺炎二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗。該疫苗對(duì)水貂具有較好的免疫保護(hù)力且安全性好。水貂的最小免疫劑量為0.5 mL/只，標(biāo)準(zhǔn)免疫劑量為1 mL。臨床初步應(yīng)用結(jié)果顯示，能夠保護(hù)水貂出血性肺炎的發(fā)生。