施鵬飛,程悅寧,羅國良,王建科,程世鵬,易立
(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,長春 130112)
犬瘟熱是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病,貂、狐、貉、犬、熊貓、虎等動(dòng)物易感。在圈養(yǎng)的毛皮動(dòng)物中,犬瘟熱病毒的致病性因宿主種類不同也有所差異,對(duì)水貂、狐貍和貉的致死率很高,其中貉子的致死率更高[1],這種差異變化可能由于水貂、狐貍、貉種屬差異所致。犬瘟熱臨床癥狀以體溫呈現(xiàn)雙相熱、鼻炎、嚴(yán)重的消化道障礙和呼吸道炎癥等為特征,少數(shù)病例可發(fā)生腦炎。目前,對(duì)犬瘟熱CDV-PS 毒株非犬宿主的致病性研究較少,CDV-PS 株跨物種傳播原因還不清楚。因此,為了更好地研究犬瘟熱CDV-PS 毒株,本研究將CDV-PS毒株在實(shí)驗(yàn)犬上進(jìn)行了模擬感染試驗(yàn),成功復(fù)制出了犬瘟熱癥狀。對(duì)感染試驗(yàn)犬的臨床癥狀、臟器變化、組織病理變化以及病毒體內(nèi)分布和 H 基因特征進(jìn)行了詳細(xì)研究,為更好地預(yù)防和控制犬瘟熱病提供基礎(chǔ)。
1.1.1 毒株 CDV-PS 毒株(由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動(dòng)物病原與免疫團(tuán)隊(duì)保存)。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡未經(jīng)免疫的幼年雄性犬(農(nóng)村土犬)5 只,體重分別為 4.7、5.3、4.9、5.8、5.5 kg。血清學(xué)檢測CDV 中和效價(jià)為陰性(SN≤4)。通過試紙條和采集糞便分泌物進(jìn)行PCR 確定實(shí)驗(yàn)幼犬無細(xì)小病毒、腺病毒和冠狀病毒,排除了其他常見病原對(duì)本實(shí)驗(yàn)的影響。
1.1.3 主要試劑 RNA 提取試劑TriZol(英杰公司);Ex-Taq酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、pMD18-T載體(大連寶生物公司);無水乙醇、二甲苯、蘇木素和伊紅等均為分析純。
1.2.1 病毒接種及觀察 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為2 組,3 只犬為對(duì)照組(不攻毒),其余2 只為攻毒組,分別皮下接種CDV-PS 4mL。接種病毒前每日早、晚2 次測量體溫,并對(duì)動(dòng)物進(jìn)行觀察。接種病毒后,每日測量體溫1 次,并對(duì)其臨床癥狀進(jìn)行觀察。
1.2.2 病理組織觀察 采取死亡犬的肝臟、脾臟、肺臟、膀胱和大腦等組織樣品,100mL/L中性福爾馬林溶液固定、流水沖洗、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片,展片、附貼、烤片、染色。顯微鏡下觀察其病理組織變化。
1.2.3 H 基因克隆和序列 分別取病死犬臟器,依照文獻(xiàn)[2]方法對(duì)CDV H 基因進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后,進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109 感受態(tài)細(xì)胞,挑取目的單菌落并提取質(zhì)粒,測序,序列GenBank登陸號(hào)為:HM165273。序列數(shù)據(jù)的排列、轉(zhuǎn)換、分析比較均利用DNASTAR 軟件數(shù)據(jù)包進(jìn)行?;贜eighborjoining 法構(gòu)建種系發(fā)生樹,采用bootstrap=500 trails 驗(yàn)證。進(jìn)化樹參考毒株的具體信息見表1。
表1 進(jìn)化樹參考毒株信息Table.1 Reference strain information of evolutionary tree
接種CDV-PS的2 只試驗(yàn)犬在接種病毒后出現(xiàn)明顯的食欲減退;隨后出現(xiàn)腳掌增厚;有大量眼瞼分泌物;有鼻液流出,開始是漿液性鼻液,后變成膿性鼻液。病初有干咳,后轉(zhuǎn)為濕咳,呼吸困難;發(fā)病后期身體發(fā)顫,表現(xiàn)為癲癇、轉(zhuǎn)圈、站立姿勢異常、步態(tài)不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)、咀嚼肌及四肢出現(xiàn)陣發(fā)性抽搐等其它神經(jīng)癥狀。臟器剖檢結(jié)果表明,肺部有大量的出血斑,肝腫大,腸系膜充血,膀胱壁變厚,腦膜充血、出血,腦腔積液等病變。
攻毒組2 只試驗(yàn)犬呈現(xiàn)典型的“雙相熱”。實(shí)驗(yàn)犬1 體溫2 次增高到40 ℃以上,體溫第12 天后逐漸降低,死亡時(shí)已降到37 ℃以下,病程19 d;實(shí)驗(yàn)犬2 接毒后體溫一直保持39 ℃以上,第18 天開始降低,后自愈,體溫恢復(fù)正常。對(duì)照組3 只體溫?zé)o明顯變化。見圖1。
病犬的病變主要發(fā)生在呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng),肺部廣泛充血,肺泡腔內(nèi)充滿大量炎細(xì)胞,以中性粒為主(圖2-A),肺泡與肺泡之間間隔增寬,增寬的組織主要由單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞構(gòu)成,局部肺泡呈代償性擴(kuò)張,造成肺氣腫(圖2-B);腦膜和腦實(shí)質(zhì)充血、水腫,神經(jīng)細(xì)胞腫脹變性(圖2-C),可見吞噬細(xì)胞吞噬壞死的神經(jīng)纖維(圖2-D);膀胱毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張充血(圖2-E);心肌細(xì)胞脂肪變性(圖2-F);脾臟大量淋巴細(xì)胞浸潤(圖2-G);肝臟偶見有壞死點(diǎn)(圖2-H)。
圖1 試驗(yàn)犬接種犬瘟熱病毒后體溫變化情況Fig.1 Changes in body temperature of dogs after vaccination with canine distemper virus
圖2 犬主要病理組織學(xué)變化Fig.2 The main pathological changes of the dog
基于H 基因核苷酸序列,可將犬瘟熱病毒根據(jù)地域分類,CDV-PS毒株歸類于Asia-1 型,與我國目前主要的流行毒株一致。見圖3。
圖3 基于犬瘟熱病毒H基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic Tree Analysis of H Gene of Canine distemper virus
本研究CDV-PS株在犬傳代,出現(xiàn)典型的雙相熱、肺炎、眼瞼分泌物等特征。犬瘟熱臨床癥狀呈多樣性,有肺炎癥狀、腸炎癥狀和腦炎癥狀[3]。在本次試驗(yàn)中,接種病毒后動(dòng)物同時(shí)出現(xiàn)了上述3 種癥狀,其中神經(jīng)癥狀是在病程后期出現(xiàn),并導(dǎo)致犬不可逆轉(zhuǎn)的損害。在病理觀察中,肺部出現(xiàn)明顯的炎性損傷,出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞和炎性滲出物,造成肺氣腫;腦部神經(jīng)細(xì)胞腫脹變性,出現(xiàn)噬神經(jīng)現(xiàn)象等[4],這與廣泛報(bào)道的犬瘟熱病毒主要損傷呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)論一致[5]。
基于犬瘟熱病毒H基因的遺傳進(jìn)化分析,可將其區(qū)分為亞洲Ⅰ型(Asia-Ⅰ)、亞洲Ⅱ型(Asia-Ⅱ)、歐洲型(Europe)、歐洲野生動(dòng)物型(Europe wildlife)、美國型(America-2)、北極型(Arctic)和疫苗型(Vaccine或American-1)7 個(gè)基因型[6-9]以及新發(fā)現(xiàn)的非洲型-Africa[10]。本研究所分離的CDV -PS 歸屬于亞洲Ⅰ型(Asia-Ⅰ),與目前我國主要流行的犬瘟熱基因型一致。犬瘟熱病毒在試驗(yàn)犬中的模擬感染研究為下一步開發(fā)犬瘟熱疫苗和犬瘟熱病相關(guān)治療制劑提供感染模型,對(duì)更好地控制和預(yù)防犬瘟熱有著非常積極的作用。