王 平 姚平波 張劍鋒

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，衡陽421002)

動脈粥樣硬化是臨床常見的心腦血管疾病如冠心病、腦梗死和外周血管病變的主要病理原因，其發(fā)病的本質(zhì)是脂質(zhì)代謝障礙，特點(diǎn)表現(xiàn)為受累動脈病變從內(nèi)膜開始，一般先有脂質(zhì)和復(fù)合糖類積聚、出血及血栓形成，進(jìn)而纖維組織增生及鈣質(zhì)沉著，并有動脈中層的逐漸蛻變和鈣化，導(dǎo)致動脈壁增厚變硬、血管腔狹窄，且動脈血管內(nèi)膜積聚大量黃色粥樣脂質(zhì)[1,2]。動脈粥樣硬化的發(fā)病原因較為復(fù)雜，與高血壓、高血脂、糖尿病、肥胖和遺傳因素等均有密切關(guān)系[3,4]。自噬是真核細(xì)胞保守的生物學(xué)現(xiàn)象，在維持細(xì)胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[5]。自噬在粥樣硬化中扮演雙刃劍的角色，起初的研究顯示在動脈粥樣硬化過程中自噬水平明顯增加，促進(jìn)了動脈粥樣硬化的進(jìn)展[6,7]。但是最近有報(bào)道顯示自噬也可以緩解動脈粥樣硬化的發(fā)生[8,9]。但是機(jī)制尚不完全清楚。本研究采用自噬激活劑雷帕霉素分析了其對動脈粥樣硬化的影響，旨在為臨床治療動脈粥樣硬化提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 8周齡載脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-) C57BL/6J小鼠購自北京維通利華公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青鏈霉素均購自美國Gibico公司；LC3兔多克隆抗體均購自日本MBL公司;BODIPY493/503購自美國Thermo Fisher公司；TNF-α、IL-6和IL-1β ELISA試劑盒購自美國R&D公司；Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司；高脂飼料購自南通特洛菲飼料科技有限公司；JEM-ARM200F 透射電子顯微鏡購自日本電子；ZEISS510激光共聚焦顯微鏡購自德國蔡司公司。

1.2方法

1.2.1動脈粥樣硬化模型構(gòu)建、分組和治療 30只6周齡ApoE-/-C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為兩組，模型組和實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)選取15只正常小鼠作為對照組。模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠(每組15只)均從第6周開始采用高脂飼料喂養(yǎng)，兩組小鼠均喂養(yǎng)6周，至第12周實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)尾靜脈注射雷帕霉素10 mg/kg，對照組和模型組經(jīng)尾靜脈注射等體積的生理鹽水。連續(xù)治療1周后處死小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2主動脈平滑肌細(xì)胞分離和培養(yǎng) 對照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠脫臼處死，75%酒精浸泡3 min，無菌條件下打開胸腔，剪取沿主動脈弓及下端至膈的主動脈，置于無菌磷酸鹽緩沖液中，用鑷子剝離血管外組織和脂肪，將血管轉(zhuǎn)移至新鮮細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將血管剪碎，加入1.5 mg/ml的 Ⅱ 型膠原酶在37℃酶解30 min，然后將細(xì)胞采用80目細(xì)胞篩過濾，將細(xì)胞均勻鋪于6孔板或者爬片上，然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3HE染色分析主動脈病理變化 對照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠處死后，取心臟主動脈，用石蠟包埋，并切成8 μm的切片，將切片在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中分別處理15 min使組織透明，甩掉二甲苯，切片依次置于無水乙醇Ⅰ 5 min，無水乙醇Ⅱ 5 min，95%酒精5 min，90%酒精5 min，80%酒精5 min，70%酒精5 min，然后將切片浸于蒸餾水中5 min，然后采用蘇木精染色15 min，用水沖洗干凈后，用1%鹽酸酒精分化，再用自來水沖洗15 min，然后1%氨水酒精迅速處理5 s，用自來水洗滌，然后采用1%伊紅染色3 min，自來水洗滌后再進(jìn)行脫水、中性樹脂封片處理。然后在顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.4免疫熒光分析主動脈平滑肌細(xì)胞自噬水平 待對照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組平滑肌細(xì)胞爬片貼壁后，將細(xì)胞采用4%多聚甲醛固定10 min，然后用PBS洗滌3次后，采用5%的BSA封閉液室溫封閉30 min，然后采用封閉液稀釋羊抗兔LC3抗體(1∶200),在4℃孵育過夜，次日用PBS洗滌3次，每次5 min，然后采用FITC標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗在室溫孵育2 h，結(jié)束后用PBS洗滌3次，每次5 min，用DAPI染核，封片后采用激光共聚焦顯微鏡觀察自噬膜泡的數(shù)量。

1.2.5BODIPY染色分析平滑肌細(xì)胞脂質(zhì)水平 對照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組平滑肌細(xì)胞爬片貼壁后，將細(xì)胞采用4%多聚甲醛固定10 min，然后用PBS洗滌3次后，然后采用BODIPY493/503染料(1∶2 000)在室溫染色20 min，PBS洗滌3次，每次5 min，然后采用DAPI染核，最后滴加防淬滅劑，封片，采用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中脂質(zhì)水平。

1.2.6ELISA分析炎癥因子水平 對于小鼠血清，三組小鼠處死前眼球取血，然后分離血清；對于平滑肌細(xì)胞，對照組和實(shí)驗(yàn)組平滑肌細(xì)胞分別培養(yǎng)于6孔板中，細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)12 h后，收集細(xì)胞上清。采用ELISA試劑盒測定對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠血清或平滑肌細(xì)胞上清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。

2 結(jié)果

2.1三組小鼠主動脈病理變化 與對照組小鼠比較，模型組小鼠組主動脈血管內(nèi)膜增厚，血管壁厚薄不均一，可見泡沫樣細(xì)胞及膽固醇結(jié)晶形成的粥樣斑塊病灶；實(shí)驗(yàn)組小鼠主動脈血管泡沫化程度緩解，動脈粥樣硬化程度減輕。實(shí)驗(yàn)組小鼠主動脈壁紅色脂肪性板塊數(shù)量較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2三組小鼠平滑肌細(xì)胞自噬分析 實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光染色自噬體標(biāo)記物L(fēng)C3分析了雷帕霉素處理后細(xì)胞自噬體數(shù)量的變化，結(jié)果如圖2所示，可見對照組平滑肌細(xì)胞有較少的自噬體，而實(shí)驗(yàn)組小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞自噬體數(shù)量很多。定量分析顯示，對照組和模型組小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞LC3標(biāo)記的自噬體數(shù)量(11.86±3.97)個(gè)，(9.43±3.02)個(gè)明顯低于實(shí)驗(yàn)組小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞(23.87±6.03)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 三組小鼠主動脈病理變化分析(×100)Fig.1 Pathological changes of aorta in three groups of mice(×100)

圖2 三組小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞自噬體比較Fig.2 Comparison of autophagosome number of aortic smooth muscle cells in three groups

2.3三組小鼠平滑肌細(xì)胞脂質(zhì)水平分析 結(jié)果如圖3所示，采用免疫熒光對主動脈平滑肌細(xì)胞中脂質(zhì)染色顯示，可見與對照組比較，模型組細(xì)胞中大量脂質(zhì)被染色，且呈聚集狀態(tài)，而經(jīng)雷帕霉素處理的實(shí)驗(yàn)組小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞中脂質(zhì)相對較少。定量分析顯示模型組脂質(zhì)熒光強(qiáng)度(198.43±29.54)明顯高于對照組和實(shí)驗(yàn)組脂質(zhì)熒光強(qiáng)度(121.43±17.91)(89.43±12.49)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4三組小鼠血脂水平比較 結(jié)果如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠TC、TG、LDL和HDL水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠TC、TG、LDL和HDL水平均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血TC、TG、LDL和HDL水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5三組小鼠炎癥因子水平分析 實(shí)驗(yàn)采用ELISA分析對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血和主動脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，結(jié)果如表2所示，與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血和主動脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.06)。對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血和主動脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 三組小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞脂質(zhì)水平比較Fig.3 Comparison of lipid level of aortic smooth muscle cells in control group and experiment group

GroupsnTC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL(mmol/L)HDL(mmol/L)Control group 1521.27±4.091.32±0.383.12±1.453.02±0.15Model group1554.11±5.091)2.09±0.111)18.28±3.511)4.19±0.281)Experiment group1525.87±4.151.45±0.274.91±1.263.75±0.18

Note：1)P<0.05 vs the control group and experiment group.

GroupsnThe peripheral blood(pg/ml)TNF-αIL-6IL-1βThe culture supernatant of aortic smooth muscle cells(pg/ml)TNF-αIL-6IL-1βControl group 15171.54±20.44519.19±43.12291.58±25.2926.19±6.3840.22±7.0169.44±10.12Model group15312.44±25.321)943.32±40.321)732.12±23.561)56.44±7.091)98.48±9.011)173.23±12.541)Experiment group15198.43±19.87559.19±32.43309.15±19.6430.61±5.8947.24±6.9478.99±7.42

Note：1)P<0.05 vs the control group and experiment group.

3 討論

自噬是來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)的雙層膜，包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需要降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)、受損傷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)等形成自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新的生物學(xué)過程。目前研究顯示自噬在許多人類疾病中發(fā)揮著重要作用，包括神經(jīng)退行性疾病、腫瘤和衰老等[10,11]。研究也發(fā)現(xiàn)自噬在動脈粥樣硬化過程中起著重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)離體的血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞受到外界刺激后，會促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生，而在這個(gè)過程中，細(xì)胞中會出現(xiàn)泛素化和包涵體聚集等不同程度的自噬現(xiàn)象[12]。此外，在動脈粥樣硬化的中晚期階段，平滑肌細(xì)胞的自噬過程將會加速纖維帽變薄，從而促使斑塊向不穩(wěn)定方向發(fā)展[13]。但是隨著研究的不斷深入，自噬可能在預(yù)防動脈粥樣硬化發(fā)生過程中發(fā)揮正面角色。動脈脂質(zhì)積累和泡沫化細(xì)胞形成是動脈粥樣硬化的關(guān)鍵，通過促進(jìn)自噬可以顯著清除細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平，進(jìn)而達(dá)到緩解動脈粥樣硬化的目的。

本研究首先發(fā)現(xiàn)注射雷帕霉素后從病理角度而言，其可以顯著緩解動脈粥樣硬化的程度，表現(xiàn)為動脈血管周圍脂質(zhì)減少、泡沫化細(xì)胞減少，血管內(nèi)膜相對完整，說明促進(jìn)自噬的確對動脈粥樣硬化有治療效果。本研究從主動脈平滑肌細(xì)胞著手，研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以顯著提高主動脈平滑肌細(xì)胞的自噬水平，表現(xiàn)為細(xì)胞自噬膜泡。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素處理后血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平明顯減少。而目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，被吸收后的ox-LDL可通過自噬-溶酶體途徑降解。本研究結(jié)果再次證明促進(jìn)自噬可促進(jìn)主動脈平滑肌細(xì)胞將胞內(nèi)大量的脂質(zhì)降解。血管平滑肌細(xì)胞在動脈粥樣硬化小鼠中會處于慢性炎癥狀態(tài)，進(jìn)而釋放炎癥因子，加劇動脈粥樣硬化的發(fā)生。我們的研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素處理后無論小鼠外周血還是平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子的水平均顯著下調(diào)，說明雷帕霉素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬后炎癥水平得到了顯著抑制。而炎癥因子水平降低，對緩解動脈粥樣硬化具有重要意義。

綜上所述，雷帕霉素可顯著促進(jìn)細(xì)胞自噬，促進(jìn)主動脈平滑肌細(xì)胞加速脂質(zhì)代謝，進(jìn)而降低主動脈平滑肌細(xì)胞炎癥水平，緩解了動脈粥樣硬化疾病的進(jìn)展。