姚協(xié)豐 李蘋(píng)芳 徐錦華 張曼 任潤(rùn)生 劉廣 羊杏平

目的與意義： 蔓枯?。╣ummy stem blight，GSB）是葫蘆科作物（比如哈密瓜、香瓜、黃瓜和西瓜等）的世界性病害，往往危害莖和葉，且通過(guò)溫室育苗和修剪被侵染植株而交叉感染傳播，也可通過(guò)種子帶菌傳播。在有利的環(huán)境條件下，低水平的潛在侵染苗有可能導(dǎo)致病害大流行。大棚內(nèi)的高濕環(huán)境有利于瓜類(lèi)蔓枯病發(fā)生，已成為瓜類(lèi)生產(chǎn)中繼枯萎病之后最嚴(yán)重的病害之一。蔓枯病菌（Didymella bryoniae）是導(dǎo)致葫蘆科作物蔓枯病的病原，蔓枯病菌的早期診斷、靈敏、快速的檢測(cè)對(duì)于限制蔓枯病在溫室育苗或田間移栽的傳播具有重要意義。本研究基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP），建立可視化、快速、靈敏的瓜類(lèi)蔓枯病菌檢測(cè)體系。

材料與方法： （1）對(duì)瓜類(lèi)蔓枯病菌和其他對(duì)照菌株（蔓枯病菌、菜豆褐斑病菌、西瓜炭疽病菌、甜瓜鏈格孢葉斑病菌、葫蘆輪枝鐮孢菌、西瓜枯萎病菌0號(hào)生理小種、西瓜枯萎病菌1號(hào)西瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌2號(hào)生理小種）的菌絲真空干燥后采用DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA，USA）試劑盒進(jìn)行DNA提取。瓜類(lèi)蔓枯病原菌人工噴霧接種甜瓜植株，收集接種甜瓜葉片和對(duì)照葉片，然后通過(guò)DNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取DNA。（2）利用引物設(shè)計(jì)軟件網(wǎng)站（PrimerExplorer V4），根據(jù)來(lái)源于RAPD（random amplified polymorphic DNA）的標(biāo)記（GenBank GQ872461，GQ872462）通過(guò)軟件設(shè)計(jì)LAMP特異性引物4組。設(shè)計(jì)的LAMP引物，包括一對(duì)內(nèi)引物，一對(duì)外引物和后環(huán)引物。（3）LAMP反應(yīng)的優(yōu)化，選擇不同試劑，不同濃度優(yōu)化最佳濃度：設(shè)計(jì)Bst DNA聚合酶量范圍 （2～8 U），dNTPs濃度范圍（2～10 mmol·L-1），鎂離子濃度范圍（2～8 mmol·L-1），引物濃度范圍（2～4 mmol·L-1），氯化錳濃度梯度（0.1～1.0 mmol·L-1），鈣黃綠素濃度梯度（2～8 mmol·L-1）。選擇LAMP最適反應(yīng)溫度及最佳反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化，設(shè)計(jì)溫度梯度：61 °C、62 °C、63 °C、64 °C、65 °C、66 °C、68 °C。設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)時(shí)間梯度：60、45、30、15 min。LAMP反應(yīng)特異性檢測(cè)，以5種不同蔓枯病菌（包括RAPD Group I和II）和7種葫蘆科病原菌及一種與蔓枯病菌同屬的菜豆褐斑病原菌，檢測(cè)LAMP引物特異性和區(qū)分度。LAMP反應(yīng)靈敏度檢測(cè)，設(shè)計(jì)不同濃度梯度DNA為模板：105、104、103、102、10、1、10?1 濃度的DNA（fg·μL?1） ，LAMP和常規(guī)PCR的比較。LAMP方法最低檢測(cè)下限和常規(guī)PCR檢測(cè)下限比較。（4）LAMP檢測(cè)人工接種蔓枯病菌侵染葉片，以?xún)煞N不同基因型蔓枯菌株D. bryoniae（DBJSJY2、DBZJNB7）和無(wú)菌水為對(duì)照，噴霧接種甜瓜植株。選取前3天無(wú)明顯病斑葉片和對(duì)照甜瓜葉片提取DNA，用于LAMP檢測(cè)侵染葉片的特異性。

結(jié)果與分析：（1）通過(guò)63 °C恒溫30 min可以檢測(cè)包括RG I和RG II在內(nèi)的所有基因型蔓枯菌株，特異性引物涵蓋蔓枯基因型廣泛，結(jié)合鈣黃綠素（calcein）的熒光顯色指示劑作用，建立了目測(cè)可視化的蔓枯病菌快速檢測(cè)體系。（2）筆者開(kāi)發(fā)的LAMP檢測(cè)蔓枯病菌體系，靈敏度為常規(guī)PCR反應(yīng)的1 000倍，檢測(cè)下限達(dá)到 0.1 fg·μL?1，與之前報(bào)道的LAMP方法檢測(cè)菌核病菌效率一致。并且比最近報(bào)道的檢測(cè)蔓枯病菌方法效率高。（3）通過(guò)比較檢測(cè)葫蘆科作物上其它7種常見(jiàn)病害，我們開(kāi)發(fā)的方法區(qū)分特異性高，可以把蔓枯病菌特異性從葫蘆科7種病原（蔓枯病菌、西瓜炭疽病菌、甜瓜鏈格孢葉斑病菌、葫蘆輪枝鐮孢菌、西瓜枯萎病菌0號(hào)生理小種、西瓜枯萎病菌1號(hào)西瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌2號(hào)生理小種）和一種同屬病原（菜豆褐斑病菌）區(qū)分開(kāi)。由于筆者開(kāi)發(fā)的LAMP方法快速、靈敏、可視化、操作簡(jiǎn)單，所以對(duì)于規(guī)?；绻S，苗期早期快速、準(zhǔn)確診斷潛病害尤為重要，并且足夠滿(mǎn)足用于潛在侵染作物和大田檢測(cè)，所以這一方法對(duì)于早期病害診斷和減少病害流行具有重要作用。（4）文獻(xiàn)報(bào)道加入環(huán)引物（loop primer）后反應(yīng)速度相比未加環(huán)引物的標(biāo)準(zhǔn)法只要1/3～1/2的時(shí)間，在30 min內(nèi)就可以獲得反應(yīng)結(jié)果。筆者的方法檢測(cè)速率高與我們?cè)O(shè)計(jì)的引物中加入了環(huán)引物（loop primer）有關(guān)，但是筆者設(shè)計(jì)的引物只有l(wèi)oop-backward primer，沒(méi)有l(wèi)oop-forward primer，所以筆者最佳反應(yīng)時(shí)間是45 min，還有可以提高的空間。

結(jié)? ? 論：本研究開(kāi)發(fā)出一種可視化、快速和廣譜檢測(cè)蔓枯病菌的LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增）方法，具有簡(jiǎn)單，靈敏和特異性的優(yōu)點(diǎn)。筆者開(kāi)發(fā)的LAMP方法快速、靈敏、可視化、操作簡(jiǎn)單，在實(shí)際生產(chǎn)中具有多種用途，例如可潛在應(yīng)用于蔓枯病田間診斷檢測(cè)和病害控制，瓜類(lèi)種子檢疫，以及在育種過(guò)程評(píng)價(jià)瓜類(lèi)品種對(duì)蔓枯病抗性。該診斷工具的前瞻性應(yīng)用于早期和準(zhǔn)確地診斷葫蘆科作物中蔓枯病菌，也可以減少大量殺菌劑的使用，從而有益于保護(hù)環(huán)境。因此，這項(xiàng)研究代表了開(kāi)發(fā)基于LAMP方法的葫蘆科作物早期病害侵染檢測(cè)系統(tǒng)的成功嘗試。