覃保瑜 劉 紅 黃 鴻 姚彥冰 方 丹 夏 寧

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附院老年病學(xué)內(nèi)分泌代謝科，南寧市 530021，電子郵箱：qinby100@163.com；2 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會，南寧市 530021)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，在我國有20%～40%的糖尿病患者并發(fā)DN[1]。DN與心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也是導(dǎo)致終末期腎臟病的主要基礎(chǔ)疾病[1]。臨床上DN的防治措施是早期診斷、早期治療，目前早期DN是以微量白蛋白尿(microalbuminuria,MA)[即尿白蛋白與肌酐比值(urine albumin-to-creatinine ratio,UACR)值為30～300 mg/g]為診斷標(biāo)志物。但MA的診斷價值仍有不足：對于合并MA的糖尿病患者，在10年后僅有30%～45%的患者發(fā)展為大量白蛋白尿，30%的患者出現(xiàn)自然轉(zhuǎn)陰，與腎病隨病程的進(jìn)展不符；糖尿病腎小球的病理改變常在出現(xiàn)MA之前；部分糖尿病患者已出現(xiàn)腎功能不全但其尿白蛋白水平正常[2-3]。因此，尋找早期DN的新診斷標(biāo)志物一直為臨床所關(guān)注。近年來，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)成為研究疾病診斷標(biāo)志物的重要方法，通過對組間差異蛋白的分析，可篩選出早期DN新的尿蛋白標(biāo)志物[4]。直接以糖尿病患者尿液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)實驗，易受所入選病例質(zhì)量等多種因素干擾而影響實驗結(jié)果[5]。本研究應(yīng)用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)篩選早期DN大鼠的尿蛋白標(biāo)志物，為下一步臨床驗證研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級Wistar大鼠16只和動物飼料均由廣西醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供(動物許可證號：SCXK桂2011-0002)，10月齡，雄性，體重(280±20)g，自由攝食和飲水，20℃室溫飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素、ProteoPrep? Blue Albumin & IgG Depletion去高豐度蛋白試劑盒(批號：S0130、PROTBA)購自Sigma公司；超濾離心管購自Millipore公司(批號：UFC903024)；蛋白酶抑制劑混合片購自Roch公司(批號：04693124001)；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒購自江蘇碧云天公司(批號：P0006)；2-D Clean-Up試劑盒(批號：80648451)、EttanTMMDLC型多維液相色譜系統(tǒng)購自GE Healthcare公司；配備電噴霧電離源的Finnigan LTQ線性離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)購自Thermo Fisher Scientific公司；胎球蛋白A酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒購自Abcam公司(批號：ab205074)。

1.3 糖尿病模型的制備 適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將16只大鼠分為正常對照組和糖尿病模型組，各8只。禁食12 h，糖尿病模型組大鼠腹腔注射小劑量(25 mg/kg) 鏈脲佐菌素(鏈脲佐菌素溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中，pH 4.5)，72 h后測鼠尾端末梢血糖并連續(xù)監(jiān)測1周，8只糖尿病模型大鼠隨機(jī)血糖均持續(xù)≥16.7 mmol/L，提示糖尿病模型建模成功。正常對照組大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。

1.4 尿液標(biāo)本收集 成模1周后收集糖尿病模型組大鼠的尿標(biāo)本，測UACR，此后每隔4周測1次UACR，至第24周時測UACR達(dá)30～300 mg/g。依據(jù)UACR結(jié)果，將大鼠糖尿病成模前、成模后1周、成模后24周分別設(shè)為非糖尿病(non diabetes,ND)期、正常白蛋白尿(normal albuminuria,NA)期、MA期，分別收集24 h尿液。用代謝籠收集正常尿標(biāo)本，取2 mL尿液，采用免疫比濁法測定尿白蛋白，用酶法測定尿肌酐，計算UACR；收集24 h尿液后，8 000 r/min、 4℃離心10 min，去沉淀，收集上清，放入蛋白酶抑制劑混合片(1片藥配10 mL尿液)，-80℃冰箱保存。

1.5 非標(biāo)記定量技術(shù)分析NA期和MA期尿液差異蛋白 本部分實驗在中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院中科新生命實驗室研究人員的指導(dǎo)下完成。(1)尿標(biāo)本超濾離心和濃縮[6]：于冰箱取出尿標(biāo)本，冰上凍融后移入截留3000分子量的15 mL超濾離心管，加去離子水，4 500 r/min、4℃離心45 min，重復(fù)3次。為避免尿液中高豐度蛋白和非蛋白雜質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾，分別用去高豐度蛋白試劑盒和2-D Clean-Up試劑盒，以層析法去除尿液樣品中高豐度的白蛋白和球蛋白，以及鹽分、脂類、酚類和核酸等非蛋白雜質(zhì)，嚴(yán)格按說明書操作。采用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。處理后的尿標(biāo)本分裝成10 μg一管，-80℃冰箱保存。(2)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳粗分離蛋白和膠內(nèi)酶解[7]：取20 μg處理后的尿樣品上樣后，經(jīng)由12.5%分離膠和5%濃縮膠組成的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，考馬斯亮藍(lán)R250染色，掃描。每個泳道切成8份，取每份凝膠樣品，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)膠內(nèi)酶解，酶解后樣品合并成4份。(3)液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜:胰酶酶解肽段經(jīng)多維液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行反相高效液相色譜分離，將2 h梯度洗脫出的蛋白肽段經(jīng)LTQ離子阱進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，每個樣品的酶解產(chǎn)物質(zhì)譜分析各重復(fù)3次。(4)非標(biāo)記差異定量分析：原始文件用DeCyder MSTM2.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，對蛋白質(zhì)譜的峰面積進(jìn)行非標(biāo)記差異定量分析，采用t檢驗，以P<0.05篩選差異肽段分子；用BioWorks軟件的SEQUEST算法鑒定多肽分子，采用的過濾參數(shù)為當(dāng)Charge+1時Xcorr≥1.9，當(dāng)Charge+2時Xcorr≥2.2，當(dāng)Charge+3時Xcorr≥3.75，其中DelCN≥0.1。利用Swiss-Prot/TrEMBL數(shù)據(jù)庫(https://www.uniport.org/)和NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，查詢差異肽段分子所對應(yīng)的(大鼠)蛋白質(zhì)。采用BuildSummary軟件對所有鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行整合和比較，輸出搜庫結(jié)果，篩選出專一性肽段數(shù)≥2的蛋白列表。利用MA期與NA期兩期間差異肽段所鑒定的差異表達(dá)蛋白的相對比值來分析尿蛋白的表達(dá)變化，為減少假陽性，本實驗將相對比值≥2為表達(dá)顯著上調(diào)蛋白質(zhì)，相對比值≤0.6為表達(dá)顯著下調(diào)蛋白質(zhì)。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法確認(rèn)尿蛋白標(biāo)志物 選取MA期表達(dá)顯著上調(diào)的感興趣的尿蛋白質(zhì)胎球蛋白A做進(jìn)一步確認(rèn)試驗，采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢查，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，所得濃度(μg/L)以隨機(jī)尿肌酐水平(g/L)校正，比較各組尿胎球蛋白A/尿肌酐比值。

1.7 腎組織病理學(xué)檢測 建模24周后，兩組大鼠經(jīng)隔夜空腹后，以10%水合氯醛麻醉后處死，取左腎部分皮質(zhì)，采用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片行糖原染色，組織病理學(xué)檢測，光鏡下觀察兩組大鼠腎組織的病理變化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NA期和MA期大鼠尿液的差異表達(dá)蛋白 本研究每組尿蛋白樣品均經(jīng)液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜重復(fù)3次，其結(jié)果經(jīng)DeCyder MS軟件轉(zhuǎn)化為二維圖譜，經(jīng)比對顯示具有高度相似性，說明實驗數(shù)據(jù)重復(fù)性好，適合非標(biāo)記定量分析。成功鑒定的尿蛋白179個，篩選出專一性肽段數(shù)≥2的蛋白共51個。其中，與NA期比較，MA期表達(dá)顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)共15個，表達(dá)顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)共12個。見表1。

表1 專一性肽段數(shù)≥2的51個表達(dá)差異蛋白質(zhì)信息

續(xù)表1

2.2 MA期候選尿蛋白標(biāo)志物的確認(rèn) 與NA期比較，在MA期除尿微量白蛋白外，以尿胎球蛋白A表達(dá)上調(diào)較顯著(相對比值=3.13)，因此選取尿胎球蛋白A作MA期大鼠的候選尿蛋白標(biāo)志物，進(jìn)一步作確認(rèn)實驗。結(jié)果顯示，ND期、NA期、MA期的尿胎球蛋白A/尿肌酐比值分別為(0.26±0.08 )μg/g、(0.31±0.09)μg/g、(0.59±0.15)μg/g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.564，P<0.05),其中MA期的尿胎球蛋白A/尿肌酐比值均高于NA期、ND期(均P<0.05)。

2.3 腎組織病理學(xué)檢查 以正常對照組大鼠腎組織作為對照，光鏡下，糖尿病模型組MA期大鼠腎小球增大，毛細(xì)血管基底膜增厚，系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增多，可見腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，部分腎小管擴(kuò)張或灶狀萎縮，間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤，呈早期DN的病理改變。見圖1～2。

圖1 正常對照組大鼠腎組織(PAS染色,×400)圖2 MA期大鼠腎組織(PAS染色,×400)

3 討 論

生物標(biāo)志物常用于疾病診斷(包括臨床療效判斷)，它可以是蛋白質(zhì)、核酸、糖化合物、脂類化合物及小分子物質(zhì)等。動物和人體尿液富含蛋白質(zhì)，其來源于全身循環(huán)和泌尿系局部組織，蘊含機(jī)體豐富的生物學(xué)信息。尿液采集簡單、無創(chuàng)、來源豐富，是研究腎病理想的生物標(biāo)志物來源。蛋白質(zhì)組學(xué)可通過“組學(xué)”方法分析生物體液內(nèi)所含的蛋白質(zhì)信息，基于質(zhì)譜(MS)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是目前尿液生物標(biāo)志物研究的熱點。通過定量技術(shù)比較兩組或多組間的差異蛋白，從而篩選標(biāo)志物是蛋白標(biāo)志物研究的最新方法，常用的技術(shù)路線是蛋白樣品經(jīng)過液相色譜分離后聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜分析，借助相關(guān)軟件，應(yīng)用生物信息學(xué)等技術(shù)分析和鑒定蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組的定量技術(shù)主要分為標(biāo)記(主要是同位素)定量技術(shù)和非標(biāo)記定量技術(shù)，非標(biāo)記定量技術(shù)具有靈敏、快速、可用于多組間比較等特點，與標(biāo)記定量技術(shù)相比較，其成本低、程序簡單，且不以降低可信度為代價[5]。

本研究中尿蛋白組學(xué)的分離及質(zhì)譜技術(shù)路線為：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳聯(lián)合液相色譜-電噴霧分離蛋白后，連接LTQ離子阱質(zhì)譜進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，然后采用非標(biāo)記定量技術(shù)分析結(jié)果。最終成功鑒定的尿蛋白179個，其中專一性肽段數(shù)≥2的蛋白51個，與NA期比較，在MA期胎球蛋白A、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、激肽原-1、S100-A8蛋白、α-1-酸糖蛋白、a-1微球蛋白、維生素D結(jié)合蛋白等15個尿蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而尿調(diào)素、α-3型Ⅳ型膠原、凝膠溶素等12個尿蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。而光鏡下可見MA期腎臟組織呈早期DN的病理改變，因此這些表達(dá)差異的尿蛋白應(yīng)被視為早期DN候選尿蛋白標(biāo)志物，值得進(jìn)一步研究。

近年來，相繼有有關(guān)DN尿蛋白標(biāo)志物的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究報道。其中，Schlatzer等[8]比較糖尿病大鼠2個月病程組和糖尿病初發(fā)組尿差異蛋白，發(fā)現(xiàn)2個月病程組的胎球蛋白A、激肽原-1、S100-A8蛋白、α-1-抗蛋白酶等尿蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，尿調(diào)素、前表皮生長因子、激肽釋放酶-1、載脂蛋白A1等尿蛋白表達(dá)顯著下調(diào)；Siwy等[9]報告，與2型糖尿病患者的正常MA期比較，MA期的胎球蛋白A、激肽釋放酶-1、α-1-抗蛋白酶、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白等尿蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；Marikanty等[10]發(fā)現(xiàn)，與2型糖尿病患者的正常MA期比較，MA期的胎球蛋白A、α-1-酸糖蛋白、β-2-微球蛋白、胱抑素B及轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白等尿蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。但由于尿蛋白含量非常豐富，而蛋白質(zhì)組實驗的研究設(shè)計、樣品制備、蛋白分離和質(zhì)譜的儀器平臺、生物信息學(xué)等均與蛋白鑒定結(jié)果密切相關(guān)，這些客觀因素均會影響各個研究結(jié)果的一致性。將本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，尿胎球蛋白A在糖尿病患者和糖尿病大鼠的MA期或早期DN表達(dá)均顯著上調(diào)。胎球蛋白A是一種多功能糖蛋白，分子量約64 KD，主要由肝臟合成并分泌進(jìn)入外周循環(huán)。血漿胎球蛋白A水平升高與胰島素抵抗、糖尿病及動脈粥樣硬化等相關(guān)[11-12]，而其低水平與血管鈣化和炎癥相關(guān)[13]。但血漿胎球蛋白A能否作為DN等微血管并發(fā)癥的標(biāo)志物尚存爭議[14]。經(jīng)質(zhì)譜和生物信息學(xué)方法鑒定的蛋白質(zhì)，需經(jīng)特異性的蛋白質(zhì)抗原-抗體結(jié)合試驗(如酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫印跡法等)進(jìn)行確認(rèn)，因此本研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗對尿胎球蛋白A進(jìn)行確認(rèn)檢測，結(jié)果顯示，早期DN尿胎球蛋白A水平明顯增高，提示尿胎球蛋白A或可作為早期DN的診斷標(biāo)志物。糖尿病患者尿胎球蛋白A升高可能與肝臟的合成分泌增多、腎小球基底膜損傷及腎小管的重吸收變化有關(guān)[15]，但具體機(jī)制未明。

本研究用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)篩選出早期DN大鼠的尿蛋白標(biāo)志物，其中尿胎球蛋白A對早期DN的診斷價值值得進(jìn)一步研究。