劉雋東 遲南南 徐建博 張?zhí)煊?楊 義 汪鳳山

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院1 藥劑科，2 消化二科，3 重癥醫(yī)學(xué)科，黑龍江省佳木斯市 154002，電子郵箱：liujundong19831@163.com)

胰腺癌是一種較難治愈的惡性腫瘤，近年來其患病率逐年升高[1]。由于胰腺癌臨床癥狀不明顯，起病隱匿，疾病早期無明顯體征，因此，多數(shù)患者確診時(shí)疾病已發(fā)展至中晚期，手術(shù)切除率較低，導(dǎo)致預(yù)后較差，5年生存率極低[2]。另外，術(shù)后腫瘤的轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)也是胰腺癌治療失敗或?qū)е滤劳龅脑蛑籟3]。尋找胰腺癌新型綜合治療手段，改善患者預(yù)后，成為目前研究的熱點(diǎn)。小白菊內(nèi)酯(parthenolide，PTL)是提取自菊科植物小白菊的一種倍半萜內(nèi)酯類物質(zhì)，具有減輕頭痛、緩解炎癥等功效，臨床上多用于治療風(fēng)濕、偏頭痛等疾病[4]。近年研究表明，PTL與伏立諾他聯(lián)用可顯著抑制乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡和自噬[5]。Yu等[6]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PTL作用后，人口腔鱗癌細(xì)胞中含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，從而抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但PTL對胰腺癌細(xì)胞的影響尚不清楚。本研究采用不同濃度的PTL作用于人胰腺癌細(xì)胞系SW1990細(xì)胞，觀察PTL對SW1990細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并初步探討其機(jī)制，旨在探討PTL應(yīng)用于胰腺癌治療的可能。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源及主要試劑與儀器 人胰腺癌細(xì)胞系SW1990細(xì)胞(批號：TCHu201)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。PTL(純度≥98%，批號：P0667-25MG)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：HSRT100)、TRIzol試劑(批號：T9424)均購自美國Sigma公司；L-15培養(yǎng)基(批號：41300039)購自美國Thermo公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒(批號：P0011)、蛋白提取試劑盒(批號：P0025)、細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒(批號：C0037)、Transwell小室均購自上海碧云天公司；AceQ qPCR SYBR? Green Master Mix(批號：R123-01)、胰蛋白酶(批號：25300054)均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；羊抗兔IgG二抗以及兔源一抗周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)抗體、E-鈣黏素抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2抗體、MMP-9抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(批號：ab199728、ab76055、ab92536、ab73734、ab8245)均購自美國Abcam公司；酶標(biāo)儀(型號：ELx800TM)、熒光定量PCR儀(型號：IQ5)、流式細(xì)胞儀(型號：CytoFLEX)均購自美國Bio-Rad公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及PTL干預(yù)濃度的篩選 復(fù)蘇SW1990細(xì)胞，用含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，將SW1990細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種至96孔板。培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的PTL(5、10、20、40、80 μmol/L)20 μL處理SW1990細(xì)胞，對照組加入等體積0.9% NaCl溶液。分別于干預(yù)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h后，向各組細(xì)胞加入CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，離心收集SW1990細(xì)胞，采用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在450 nm波長下的吸光度(A)值。計(jì)算不同濃度PTL對SW1990細(xì)胞的生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率(%)=(1-APTL處理組/A對照組)×100%。每個(gè)濃度設(shè)置3復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取PTL干預(yù)細(xì)胞的適宜濃度。

1.3 細(xì)胞分組及干預(yù) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，采用0.25%胰蛋白酶消化后，以1×106個(gè)/孔接種至6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約80%時(shí)，根據(jù)1.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果將細(xì)胞分為對照組、10 μmol/L PTL組、20 μmol/L PTL組、40 μmol/L PTL組。對照組加入20 μL的0.9% NaCl溶液，其余各組加入相應(yīng)濃度的PTL。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.4 平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測SW1990細(xì)胞增殖情況 干預(yù)48 h后，收集各組SW1990細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后接種至含有6 mL的L-15培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(每個(gè)培養(yǎng)皿含1 000個(gè)細(xì)胞)中，于37℃、5% CO2、90%相對濕度的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待長出肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí)(2～4 d)，取出并計(jì)數(shù)每個(gè)培養(yǎng)皿中細(xì)胞克隆數(shù)目，計(jì)算SW1990細(xì)胞克隆形成率?？寺⌒纬陕?(細(xì)胞克隆數(shù)目/1 000)×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測SW1990細(xì)胞遷移能力 干預(yù)48 h后，收集各組SW1990細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔接種至6孔板，待細(xì)胞長滿后，采用200 mL槍頭于6孔板內(nèi)側(cè)垂直劃痕，輕輕吸盡舊培養(yǎng)基，以磷酸緩沖液洗去劃落的細(xì)胞，加入無血清L-15培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、90%相對濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。48 h后置于倒置顯微鏡下拍照，并比較0 h、48 h時(shí)，SW1990細(xì)胞劃痕兩側(cè)的間距，依此評價(jià)SW1990細(xì)胞遷移能力，劃痕間距=0 h劃痕兩側(cè)的間距-48 h時(shí)劃痕兩側(cè)的間距。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測SW1990細(xì)胞侵襲能力 PTL干預(yù)48 h后，收集各組SW1990細(xì)胞，加入無血清L-15培養(yǎng)基制作細(xì)胞懸液，接種于加有50 μL基質(zhì)膠(2.0 mg/mL)的Transwell小室上層(3 000個(gè)細(xì)胞/孔)，按照文獻(xiàn)[7]中的方法進(jìn)行操作。小室風(fēng)干后，置于500 μL的 0.1%結(jié)晶紫溶液中染色，于顯微鏡下拍照，統(tǒng)計(jì)遷移至Transwell下室的SW1990細(xì)胞數(shù)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測CDK4、E-鈣黏素、MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá) 按1.3方法處理細(xì)胞48 h后，采用TRIzol法提取各組SW1990細(xì)胞總RNA，檢測其濃度和質(zhì)量，按照試劑盒說明書操作反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用AceQ qPCR SYBR? Green Master Mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系：10 μmol/L上下游引物0.5 μL，SYBR? Green Master Mix 5 μL，50 ng/μL cDNA 1 μL，無菌ddH2O 3.0 μL，總計(jì)10 μL。反應(yīng)條件：95℃ 90 s；95℃ 30 s；62℃ 30 s；72℃ 20 s；40個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法計(jì)算CDK4、E-鈣黏素、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達(dá)量。引物均由上海生工生物公司合成，序列見表1。

表1 CDK4、E-鈣黏素、MMP-2、MMP-9及GAPDH引物序列

1.8 蛋白免疫印跡法檢測CDK4、E-鈣黏素、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平 按1.3方法處理細(xì)胞48 h后，采用蛋白裂解液裂解SW1990細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白并測定蛋白總質(zhì)量。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入兔源一抗CDK4抗體、E-鈣黏素抗體、MMP-2抗體、MMP-9抗體、GAPDH抗體(1 ∶500)，4℃孵育作用過夜；加入二抗羊抗兔IgG(1 ∶4 000)，室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光試劑處理后，經(jīng)Tanon軟件拍攝圖像并進(jìn)行半定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用行LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTL對SW1990細(xì)胞增殖的影響 PTL干預(yù)細(xì)胞36 h后，與對照組相比，各干預(yù)時(shí)間點(diǎn)，10、20、40 μmol/L PTL均能抑制細(xì)胞增殖，見圖1。干預(yù)48 h后，PTL對SW1990細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為(37.15±2.34)μmol/L。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度PTL干預(yù)下SW1990細(xì)胞增殖抑制率

2.2 PTL對SW1990細(xì)胞平板克隆形成、遷移能力、侵襲能力的影響 對照組、10 μmol/L PTL組、20 μmol/L PTL組、40 μmol/L PTL組SW1990細(xì)胞克隆形成率及侵襲能力依次降低，劃痕間距依次增大(均P<0.05)，見表2及圖2～3。

表2 PTL對SW1990細(xì)胞平板克隆形成、遷移能力、侵襲能力的影響(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與10 μmol/L PTL組比較，#P<0.05；與20 μmol/L PTL組比較，DP<0.05。

圖2 各組SW1990細(xì)胞的遷移能力

圖3 各組SW1990細(xì)胞的侵襲能力

2.3 PTL對SW1990細(xì)胞CDK4、E-鈣黏素、MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 PTL作用48 h后，對照組、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L PTL組SW1990細(xì)胞CDK4、E-鈣黏素、MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白相對表達(dá)水平均依次降低(均P<0.05)，見表3～4及圖4。

圖4 SW1990細(xì)胞CDK4、E-鈣黏素、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)情況

表3 各組SW1990細(xì)胞CDK4、E-鈣黏素、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達(dá)水平比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與10 μmol/L PTL組比較，#P<0.05；與20 μmol/L PTL組比較，DP<0.05。

表4 各組SW1990細(xì)胞CDK4、E-鈣黏素、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)水平比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與10 μmol/L PTL組比較，#P<0.05；與20 μmol/L PTL組比較，DP<0.05。

3 討 論

胰腺癌是惡性程度較高的惡性腫瘤，其發(fā)生與高脂飲食、遺傳及環(huán)境因素有關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前外科手術(shù)是根治胰腺癌的唯一方法，然而由于胰腺癌的早期診斷困難，確診時(shí)患者病情已發(fā)展至中晚期，錯(cuò)過手術(shù)機(jī)會，此時(shí)化療是主要的治療方式[8]。目前臨床采用吉西他濱作為胰腺癌化療的一線藥物，但其毒副作用大且治療效果不佳[9]。因此，尋找有效、安全的胰腺癌治療藥物具有重要意義。胰腺癌SW1990細(xì)胞系源自一名Ⅱ期胰腺腺癌患者，已被廣泛應(yīng)用于胰腺癌的研究[10]。本研究結(jié)果顯示，PTL干預(yù)SW1990細(xì)胞36 h后，各干預(yù)時(shí)間點(diǎn)，20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L PTL均能抑制胰腺癌細(xì)胞系SW1990細(xì)胞的增殖，而干預(yù)48 h后，PTL對SW1990細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為(37.15±2.34)μmol/L，故本研究選擇10、20、40 μmol/L PTL干預(yù)SW 1900細(xì)胞為48 h。

PTL是分離自菊科植物小白菊等的一種天然倍半萜內(nèi)酯類物質(zhì)，具有抑制炎癥、抗腫瘤等藥理活性[11]。Kim等[12]發(fā)現(xiàn)，PTL可通過上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞的促凋亡蛋白的表達(dá)，如p53細(xì)胞色素等，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究結(jié)果顯示，對照組、10 μmol/L PTL組、20 μmol/L PTL組、40 μmol/L PTL組細(xì)胞的克隆形成率均依次降低(均P<0.05)，提示PTL可抑制人胰腺癌細(xì)胞增殖能力，具有抗腫瘤作用，且呈一定的劑量依賴性。

細(xì)胞是人體的基本組成單元，細(xì)胞增殖是一個(gè)多基因協(xié)同調(diào)控的過程，哺乳動(dòng)物的細(xì)胞生長周期分為G1、S、G2、M 4個(gè)時(shí)期，其中G0/G1期的正常啟動(dòng)是細(xì)胞周期正常增殖的關(guān)鍵[13]。細(xì)胞接到信號后，在生長因子等的持續(xù)作用下，激活一系列信號通路，CDK4/6作用于受體結(jié)合域蛋白，使其磷酸化，進(jìn)而作用于下游目標(biāo)蛋白，促使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，開始染色體的復(fù)制，完成有絲分裂過程[14-15]。本研究中，各濃度PTL組SW1990細(xì)胞CDK4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對照組，且呈劑量依賴性(P<0.05)，提示PTL對SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用可能與抑制CDK4蛋白表達(dá)有關(guān)。

腫瘤的發(fā)生由多因素共同參與，疾病過程復(fù)雜，當(dāng)機(jī)體受到致癌物刺激后，單一細(xì)胞基因表達(dá)失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常，侵襲能力增加，呈浸潤式生長，引起癌變[16]。本研究中，各濃度PTL組SW1990細(xì)胞劃痕的間距大于對照組、侵襲至Transwell下室的細(xì)胞數(shù)量少于對照組(均P<0.05)，提示PTL可抑制人胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的病理狀態(tài)，主要表現(xiàn)為失去上皮細(xì)胞特性而具有肌成纖維細(xì)胞特性[17]。在細(xì)胞發(fā)生EMT過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物，如E-鈣黏素表達(dá)減少，間充質(zhì)標(biāo)志物，如α-平滑肌動(dòng)蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞間的黏附作用降低[18-19]。MMP-2和MMP-9屬于Ⅳ型膠原酶原，對細(xì)胞外基質(zhì)的降解具有重要作用[20]，與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究中，PTL各處理組SW1990細(xì)胞E-鈣黏素、MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白相對表達(dá)水平均低于對照組，且呈劑量依賴性(P<0.05)。提示PTL可能通過抑制SW1990細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏素蛋白及侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)，從而抑制人胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。

綜上所述，PTL可能通過調(diào)控CDK4、E-鈣黏素、MMP-2及MMP-9等蛋白的表達(dá)，從而抑制人胰腺癌細(xì)胞系SW1990細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，以發(fā)揮抗腫瘤的作用。