梁晶晶，袁莉剛，李琪

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070)

睪丸細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)由將不同細胞緊密聯(lián)系在一起的多糖和蛋白質(zhì)網(wǎng)構(gòu)成，包括生精小管基膜和管周細胞間基質(zhì)，多種分子通過細胞骨架傳遞細胞間信息從而控制細胞分化、粘附、增殖及基因表達[1].LN是基膜的主要成分之一，由位于基膜的上皮細胞和內(nèi)皮細胞合成[2]；且LN在腫瘤轉(zhuǎn)移及信息傳遞等發(fā)揮重要功能.LN為粘連糖蛋白家族的細胞粘附分子，在生精小管大量表達，參與精子發(fā)生過程中的緊密連接重構(gòu)作用和暫時性連接的形成[3].免疫組化顯示，LN在黑背豺基底膜顯示強烈的免疫染色，表明其可能與間質(zhì)細胞、小葉周肌樣細胞和血管平滑肌細胞的形成有關(guān)[4]；LN在正常人睪丸的間質(zhì)和生精小管基底膜亦有表達[5].LN在雙峰駝生精小管基膜下毛細血管較強陽性表達，在支持細胞、間質(zhì)細胞及管周肌樣細胞均有陽性表達[6].研究表明，LN在老齡牦牛睪丸Sertoli細胞和肌樣細胞表達與青年牦牛相似，有助于老齡牦牛精子生成[7].因此，LN作為睪丸ECM的重要成分，在生精過程及間質(zhì)細胞發(fā)育等多方面發(fā)揮功能.

藍狐(Alopexlagopus)，犬科北極狐屬，典型的季節(jié)性繁殖經(jīng)濟動物，主要分布于北冰洋沿岸各國，具有很高的經(jīng)濟價值和研究價值，其在10月齡時進入性成熟，保持高繁殖能力7 a.季節(jié)變化引起動物睪丸形態(tài)和精子發(fā)生改變，長日照可促進生精細胞的產(chǎn)生，北極狐群的交配季節(jié)取決于氣候條件，通常從二月中旬至四月下旬，一年發(fā)情一次[8].Madekurozwa等[4]應用免疫組織化學研究表明，黑背豺睪丸組織中LN和細胞骨架蛋白隨繁殖季節(jié)變化明顯.袁莉剛等[18]發(fā)現(xiàn)LN合成與不同繁殖季節(jié)牦牛睪丸間質(zhì)細胞分泌功能變化相關(guān)；本研究通過H.E染色、免疫組織化學SP(streptavidin-perosidase)法及免疫熒光法比較不同繁殖期藍狐睪丸LN定位及分布特征，揭示睪丸LN與生精細胞發(fā)育微環(huán)境、季節(jié)性繁殖之間的相互關(guān)系，旨在為藍狐的生殖研究提供參考，進一步認識層連粘蛋白在調(diào)節(jié)細胞粘著、轉(zhuǎn)移、生長及運動方面的功能及其生理意義.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017年3月中旬于張掖市藍狐養(yǎng)殖場經(jīng)睪丸摘除手術(shù)采集發(fā)情期藍狐睪丸3對，又于當年11月用此法采集休情期藍狐睪丸3對.

1.2 試驗方法

1.2.1 主要藥品試劑 H.E染液；LN兔抗羊多克隆抗體由北京博奧森生物制品有限公司提供；免疫組化試劑盒(sp-0023)由美國ZYMED公司生產(chǎn)，北京博奧森生物制品有限公司提供；DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)和APES防脫片(ZLI-9502)由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供.

1.2.2 樣品固定與切片制備 新鮮組織用10%福爾馬林固定液固定，切成0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm小塊，流水沖洗48 h后經(jīng)不同梯度酒精脫水，二甲苯透明，組織浸蠟后常規(guī)石蠟切片包埋，LKB8800型超薄切片機切片(4 μm)制備切片，H.E常規(guī)染色，中性樹膠固封.

1.2.3 免疫組織化學法 石蠟切片常規(guī)脫蠟，酒精梯度分化；30 g/L H2O2水溶液封閉過氧化物酶10 min，正常山羊血清白蛋白孵育15 min后；每張切片滴加50 μL兔多克隆抗鼠LN-IgG (稀釋度1∶400)，37 ℃孵育4 h，PBS振洗后每張切片滴加50 μL生物素標記山羊抗兔IgG工作液，后加50 μL辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育滴加新鮮配制DAB顯色液，常規(guī)脫水透明、封片.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

切片在NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統(tǒng)進行照相，免疫組織化學染色隨機選取5張切片，每張切片隨機選取6張不重復視野(400×)采用半定量的形式對染色結(jié)果的分布密度進行描述-：無陽性表達；+/-：偶有陽性表達；+：陽性表達；++：中等強度陽性表達；+++：強陽性表達；++++：高密度強陽性.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同繁殖季節(jié)藍狐睪丸組織結(jié)構(gòu)特點

光鏡下由H.E染色可見，繁殖期藍狐睪丸生精上皮為6～8層細胞構(gòu)成，腔內(nèi)游離面可見大量成熟精子，生精小管外周偶見小血管(圖1-A).繁殖間期生精小管由3～5層生精細胞構(gòu)成，管腔內(nèi)無精子，生精小管固外周有梭形管周肌樣細胞圍繞(圖1-B).統(tǒng)計結(jié)果表明(圖2)，繁殖期藍狐生精小管支持細胞數(shù)量平均為(26.5±4.2)個，生精小管平均直徑為( 62.857±5.95)μm，間質(zhì)細胞數(shù)目為(54±2.1)個.繁殖間期生精小管內(nèi)支持細胞平均數(shù)為(11.9±2.2)個，生精小管平均直徑為(84.820±2.81)μm；間質(zhì)細胞數(shù)目為(36±1.1)個.二者相比較，繁殖期藍狐生精小管直徑較繁殖間期顯著增大(P<0.05)，而繁殖期支持細胞數(shù)量及間質(zhì)細胞數(shù)量亦明顯多于繁殖間期，差異極顯著.

A、C：繁殖期藍狐睪丸組織；A：H.E染色，標尺示20 μm；C：LN免疫熒光染色，標尺示20 μm；B、D：繁殖間期藍狐睪丸組織；B：H.E染色，標尺示20 μm；D：LN免疫熒光染色，標尺示20 μm；Pc:管周肌樣細胞;Ps:初級精母細胞;SA:小動脈;Sc:Sertoil細胞;Sg:精原細胞;ST:生精小管;Ley:睪丸間質(zhì)細胞;BC:毛細血管.A、C:The structure of Alopex lagopus testicle in breeding season；A：The hematoxylin-eosin staining,bar=20 μm;C:The LN immunofluorescent staining,bar=20 μm;B、D：The structure of Alopex lagopus testicle in non-breeding season;B：The hematoxylin-eosin staining,bar=20 μm;D:The LN immunofluorescent staining,bar=20 μm;Pc:Peritublar Myoid cells;Ps:Primary spermatcyte;SA:Small artery;SC:Sertoli's cells；Sg:Spermatophore;ST:Spermatogenic tubule;Ley:Leydig cells;BC：Blood capillary.圖1 不同繁殖季節(jié)藍狐睪丸H.E及免疫熒光染色Figure 1 The hematoxylin-eosin staining and immunofluorescence staining of Alopex lagopus testicles in different breeding seasons

免疫熒光結(jié)果表明(圖1-C、1-D，表1)，LN在繁殖期藍狐睪丸間質(zhì)細胞、生精小管基膜、管周肌樣細胞呈強陽性表達，支持細胞弱陽性表達(圖1-C)，繁殖間期LN僅在管周肌樣細胞及小血管壁呈陽性表達，間質(zhì)細胞表達減弱(圖1-D).

*同一數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)；**同一數(shù)據(jù)間差異極顯著(P<0.01).* means significant difference between groups(P<0.05)；** means extreme significant difference between groups(P<0.01).圖2 不同繁殖季節(jié)藍狐睪丸生精小管直徑及間質(zhì)細胞和生精小管內(nèi)支持細胞平均個數(shù)統(tǒng)計Figure 2 Statistical map of the average number of leydig cells and sertoli cells in the seminiferous tubules of Alopex lagopus and the diameter of spermatogenic tubules in the Alopex lagopus testicles in different breeding seasons

2.2 LN在不同繁殖季節(jié)藍狐睪丸組織分布特點

免疫組化顯示,LN在繁殖期藍狐睪丸生精小管基膜,支持細胞及各級生精細胞陽性表達明顯,間質(zhì)細胞及小血管為強陽性表達(圖3-A，3-B)，繁殖期陰性對照無表達(圖3-C).繁殖間期LN在生精上皮基本無表達，肌樣細胞陽性表達明顯,小血管管壁為強陽性表達,間質(zhì)細胞表達減弱(圖3-D，3-E)，繁殖間期陰性對照無表達(圖3-F).

2.3 LN在不同繁殖期藍狐睪丸免疫組織化學檢測結(jié)果對比分析

免疫組織化學平均吸光度統(tǒng)計結(jié)果顯示，繁殖期藍狐睪丸顯著高于繁殖間期，統(tǒng)計學差異極顯著(圖4).

表1 LN在不同繁殖季節(jié)藍狐睪丸組織的表達特點

A～C：繁殖期藍狐睪丸組織；A：LN免疫組化染色，標尺示50 μm；B：LN免疫組化染色，標尺示10 μm；C：免疫組化陰性對照，標尺示20 μm；D ～F：繁殖間期藍狐睪丸組織；D：LN免疫組化染色，標尺示50μm；E：LN免疫組化染色，標尺示20 μm；F：免疫組化陰性對照，標尺示20 μm；Pc:管周肌樣細胞;Ps:初級精母細胞;SA:小動脈;Sc:Sertoil細胞;Sg:精原細胞;ST:生精小管;Ley:睪丸間質(zhì)細胞;BC:毛細血管.A～C:The structure of Alopex lagopus testicle in breeding season；A：The LN immunohistochemical staining,bar=50 μm；B：The LN immunohistochemical staining,bar=10 μm;C：The immunohistochemical staining negative control,bar=20 μm;D～F:The structure of Alopex lagopus testicle in non-breeding season;D：The LN immunohistochemical staining,bar=50 μm;E：The LN immunohistochemical staining,bar=20 μm;F:The immunohistochemical staining negative control,bar=20 μm;Pc：peritublar myoid cells；Ps:primary spermatcyte；SA：small artery；SC：sertoli's cells；Sg：spermatophore；ST：spermatogenic tubule；ley：leydig cells；BC：blood capillary.圖3 LN在不同繁殖季節(jié)藍狐睪丸免疫組化染色Figure 3 Immunohistochemistry of Alopex lagopus testicles in different breeding seasons

3 討論與結(jié)論

季節(jié)性繁殖是動物適應自然選擇而形成只在特定季節(jié)繁殖的現(xiàn)象，受生存環(huán)境的限制而具有了季節(jié)性繁殖的特征[9].日本田鼠在繁殖間期生精小管由支持細胞、精原細胞、精母細胞和退化脫落的圓形精子組成；恢復期開始有精子發(fā)生；至活躍期生精小管管腔直徑最大，內(nèi)部有大量精子[10].性成熟恒河猴睪丸生精上皮細胞在繁殖期較非繁殖期豐富[11].作為典型季節(jié)性繁殖的魚類，巴西條帶兔脂鯉在生殖季節(jié)(12月/ 1月和2月/ 3月)性腺指數(shù)和生精小管直徑較大，回歸和休眠期(4月/5月和6月/7月)顯著降低[12].研究表明，藍狐睪丸質(zhì)量和體積的變化都與季節(jié)性有關(guān)，休情期藍狐睪丸生精小管排列較為疏松間距較大，生精上皮細胞較發(fā)情期松散.不同繁殖期睪丸生殖上皮季節(jié)性發(fā)育主要變化是1倍體細胞(主要是精細胞和成熟的精子)的比率從3月的90%急劇下降到了12月的78%以下[13].澳大利亞鴯鹋在繁殖期生精上皮大量增生，細胞層次多，管腔漸大，有大量精子分布，而在非繁殖期生精上皮細胞排列緊密，管直徑小，未見成熟精子[14]；與此相一致，本研究中繁殖期藍狐睪丸生精小管與繁殖間期相比，生精上皮細胞層數(shù)變化顯著，生精小管平均直徑顯著增加，表明生精小管的大小及生精上皮的發(fā)育隨季節(jié)性繁殖變化明顯；季節(jié)性繁殖動物睪丸在繁殖期與間期的膨大和縮小亦可能是普遍存在的現(xiàn)象.

*同一數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)；**同一數(shù)據(jù)間差異極顯著(P<0.01).* means significant difference between groups(P<0.05)；** means extreme significant difference between groups(P<0.01).圖4 不同繁殖季節(jié)成年藍狐睪丸LN表達統(tǒng)計比較Figure 4 The comparison of LN expression in the testicle of adult Alopex lagopus between breeding and non-breeding seasons

睪丸細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)包括生精小管基膜和管周細胞間基質(zhì)部分，主要包括Ⅰ型和Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、制動素和蛋白多糖等多種蛋白和因子，在精原細胞自我更新及精子發(fā)生等方面發(fā)揮著重要作用[15].不同種屬哺乳動物睪丸基膜中的LN在管周肌樣細胞發(fā)育時出現(xiàn)，并參與基膜及血管壁構(gòu)成，在支持細胞構(gòu)成血睪屏障過程及生精細胞的各個階段發(fā)揮功能[16].Gao等[17]研究發(fā)現(xiàn)LN在雞、鴨、鴿子和兔定位于生精小管基底膜和管周肌樣細胞，且在血管強表達.與此相一致，本研究中LN在繁殖期與繁殖間期在生精小管基底膜均呈現(xiàn)強陽性反應，表明LN可能通過基膜和血管發(fā)揮作用.免疫組化研究表明，不同繁殖季節(jié)南非黑背豺睪丸LN均主要表達于生精小管基膜，血管平滑肌細胞以及間質(zhì)細胞[4].本研究中，繁殖期及繁殖間期藍狐睪丸LN在管周肌樣細胞及血管壁細胞為強陽性表達，提示不同繁殖期LN在藍狐生精小管基膜的表達變化不明顯.

支持細胞調(diào)節(jié)睪丸的分化和發(fā)育，是維持成年睪丸功能的關(guān)鍵.不同種屬動物睪丸基膜中的LN及COIV在管周肌樣細胞發(fā)育時出現(xiàn)，且在支持細胞分化以及維持分化的各個階段發(fā)揮功能.LN的存在促進了支持細胞的粘附和轉(zhuǎn)移[18]；體外研究表明，大鼠支持細胞能夠合成層粘連蛋白和IV型膠原[5].免疫組化顯示，LN在不同繁殖期牦牛睪丸的支持細胞均為陽性表達[19].睪丸內(nèi)的支持細胞可以分泌雄激素結(jié)合蛋白，并與間質(zhì)細胞分泌的睪丸酮結(jié)合，維持精子的發(fā)育，亦可決定成年小鼠睪丸的生殖細胞和間質(zhì)細胞數(shù)量[20].本研究中繁殖期生精小管內(nèi)支持細胞平均數(shù)量較繁殖間期顯著增加，LN在繁殖期支持細胞陽性表達，而在繁殖間期表達不明顯，提示LN在不同繁殖期的表達變化與繁殖間期支持細胞數(shù)量變化有關(guān)，亦可能參與調(diào)解繁殖間期睪酮的分泌.

研究表明睪丸組織LN合成與不同繁殖季節(jié)間質(zhì)細胞分泌功能變化相關(guān)[18].體外研究證實間質(zhì)細胞通過調(diào)節(jié)LN等ECM成分的合成以應對其激素合成的變化[21].LN在繁殖季節(jié)黑背豺的睪丸細胞間質(zhì)為免疫組化強表達.季節(jié)性繁殖雄性動物，睪丸酮在非繁殖季節(jié)減少，野生浣熊犬睪丸3bHSD、P450c17免疫定位及染色強度隨季節(jié)變化局部粘附分子的表達降低，同時誘導生殖細胞生成減少[22].LN在繁殖期牦牛睪丸表達強于繁殖間期，與高寒低氧環(huán)境中牦牛間質(zhì)細胞分泌功能變化相關(guān)[18].與本研究中LN在睪丸間質(zhì)的表達及生殖細胞的變化相一致，且繁殖間期間質(zhì)細胞數(shù)量極顯著低于繁殖期，提示LN可能與睪丸間質(zhì)細胞數(shù)量及睪酮的分泌有關(guān).

綜上所述，不同繁殖期藍狐睪丸生精小管結(jié)構(gòu)差異明顯，季節(jié)性變化顯著.LN在生精小管基膜表達受動物季節(jié)性繁殖的影響不明顯，藍狐睪丸LN表達變化與支持細胞和間質(zhì)細胞數(shù)量變化相一致，LN表達強弱可能與不同繁殖季節(jié)間質(zhì)細胞及支持細胞發(fā)育及功能變化相關(guān)，有待于進一步分析.