馬懷義，賀學(xué)鋒，張曉燕,馬雄,丁耀錄,馬玲

(1.甘肅民族師范學(xué)院,甘肅 合作 747000；2.甘肅省甘南藏族自治州食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,甘肅 合作 747000; 3.甘肅省甘南藏族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,甘肅 合作 747000)

小葉黑柴胡(BupleurumsmithiiWolff var.parvifolium)為傘形科柴胡屬多年生草本植物，常作為柴胡藥用，喜溫光，耐寒性較強(qiáng)，主要分布于甘肅、青海、寧夏等地區(qū)海拔2 700～3 700 m的山坡草地及林下[1-2].化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，小葉黑柴胡植株中含有柴胡皂甙、黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、甾醇、多糖、揮發(fā)油等化合物[3-5].藥理學(xué)研究表明，小葉黑柴胡根具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝、增強(qiáng)免疫功效[6-7]；莖葉中黃酮類(lèi)化合物對(duì)動(dòng)物膽汁淤積性、化學(xué)性、免疫性肝損傷具有保護(hù)作用[8]；柴胡皂苷具有抗癲癇、抑制肝臟癌細(xì)胞增殖的功能[9].

近年來(lái)，對(duì)小葉黑柴胡的研究主要集中在栽培生理特性[10]、皂苷含量測(cè)定[11-12]、藥理作用[13]等方面，而在產(chǎn)量與品質(zhì)形成機(jī)制方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道.甘南地區(qū)位于青藏高原東北緣，屬高寒陰濕區(qū)，大部分地區(qū)海拔3 000 m以上，較適宜于小葉黑柴胡的生長(zhǎng).為了探明該植物在甘南地區(qū)的生長(zhǎng)適應(yīng)性及其活性物質(zhì)的積累，本研究以野生小葉黑柴胡根、莖和葉為試驗(yàn)材料、對(duì)其生物量、總黃酮、酚、皂苷類(lèi)及抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定與分析，旨在為種植區(qū)域選擇、大面積栽培推廣及其品質(zhì)評(píng)價(jià)提供一定的理論基礎(chǔ)與技術(shù)參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生小葉黑柴胡于2018年10月中旬采自甘肅省合作市當(dāng)周草原(N 34°57′17″，E 102°53′13″，海拔3 000 m)，根、莖和葉經(jīng)流水沖洗后，陰干備用.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取液的制備 取陰干的根、莖和葉，粉碎后過(guò)80目篩；準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g粉末置于70%乙醇(30 mL)離心管中，37 ℃、150 r/min遮光振蕩提取72 h，然后5 000 r/min離心15min；連續(xù)提取3次，收集上清液，用70%乙醇定容至100 mL，用于總黃酮、酚、皂苷類(lèi)及抗氧化能力的測(cè)定.

1.2.2 總黃酮、酚、皂苷類(lèi)化合物含量的測(cè)定總黃酮類(lèi)化合物含量的測(cè)定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法[14-15]，總酚類(lèi)化合物含量的測(cè)定采用福林酚試劑法[16-17]，總皂苷類(lèi)化合物含量的測(cè)定采用紫外分光光度法[18].

1.2.3 抗氧化能力的測(cè)定抗氧化能力采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和鐵離子還原/氧化能力(FRAP)[19-20]2種方法綜合評(píng)價(jià).

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，單因素(one-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 單株的根、莖、葉生物量

植物的形態(tài)建成和單株不同器官生物量的積累受基因和環(huán)境因子共同調(diào)控，生長(zhǎng)于3 000 m以上地區(qū)的野生小葉黑柴胡不同器官生物量的積累如圖1所示，莖的干質(zhì)量(0.34 g/株)顯著高于根(0.14 g/株)和葉(0.15 g/株)(P<0.05)，分別為根、葉干質(zhì)量的2.43和2.67倍，而根和葉之間無(wú)顯著差異(P>0.05).

2.2 根、莖、葉總黃酮類(lèi)化合物的含量

黃酮類(lèi)化合物在不同植物物種、品種和植株個(gè)體間分布不同，在同一植株的不同組織器官中分布也不盡相同，如圖2所示，生長(zhǎng)于高海拔地區(qū)的野生小葉黑柴胡根、莖和葉總黃酮類(lèi)化合物含量存在較大差異；葉中含量(274.36 mg/g)分別為莖和根的2.23和8.60倍(圖2-A)；莖和葉中單株含量較高，達(dá)到42 mg/株以上，顯著高于根(P<0.05，圖2-B).

圖1 甘南野生小葉黑柴胡單株根、莖、葉的干質(zhì)量Figure 1 Comprison of root，stem and leaf dry weight on a per plant basis of wild B.smithii located in Gannan region

圖2 甘南野生小葉黑柴胡根、莖和葉中黃酮類(lèi)含量(A)和單株不同器官含量(B)的比較Figure 2 Comprison of flavonoids contents in root，stem and leaf on a dry weight (A) and per plant basis (B) of wild B.smithii located in Gannan region

2.3 根、莖和葉總酚類(lèi)化合物的含量

因不同植物物種和個(gè)體的基因型不同，生存環(huán)境的差異，導(dǎo)致植株體不同器官對(duì)外界逆境適應(yīng)和抵抗能力不同，次生代謝酚類(lèi)化合物的合成與分布也不相同.生長(zhǎng)于高海拔地區(qū)的野生小葉黑柴胡根、莖和葉總含量如圖3所示存在較大差異；葉中含量(387.77 mg/g)分別為莖和根的1.84和8.87倍(圖3-A)；莖中單株含量最高(71.70 mg/株)，分別為葉和根的1.25和11.87倍(圖3-B).

2.4 根、莖和葉總皂苷類(lèi)化合物的含量

皂苷類(lèi)化合物是植物次生代謝的一類(lèi)重要化合物，不同物種，同一物種的不同品種以及環(huán)境條件都會(huì)導(dǎo)致不同植株個(gè)體，同一植株個(gè)體不同的器官合成不同的皂苷類(lèi)化合物，其含量也不盡相同.生長(zhǎng)于高海拔地區(qū)的野生小葉黑柴胡根、莖和葉總皂苷類(lèi)化合物含量如圖3所示，根、莖和葉存在較大差異；根中含量(13.75 mg/g)分別為莖和葉的2.95和1.61倍(圖4-A)；單株根中含量也最高(1.9 mg/株)，分別為莖和葉的1.19和1.50倍(圖4-B).

2.5 小葉黑柴胡根、莖和葉抗氧化能力

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，生長(zhǎng)于高海拔地區(qū)的野生小葉黑柴胡根、莖和葉不同器官中次生代謝物黃酮類(lèi)，酚類(lèi)和皂苷類(lèi)含量不盡相同，可能導(dǎo)致不同組織器官的抗氧化能力也不同，為了確證這一推斷，進(jìn)行了根、莖和葉浸提液的抗氧化能力分析，結(jié)果如圖5所示，根、莖、葉提取液自由基抑制率和FRAP值均表現(xiàn)為葉>莖>根，且達(dá)到顯著水平(P<0.05)，葉抑制率(92.43%)和FRAP值(7 137.89 μmol/L)分別為莖、根的1.06、5.94倍(圖5-A)和1.34、12.91倍(圖5-B).

3 討論

很多研究已經(jīng)表明，植物的生長(zhǎng)發(fā)育及其代謝產(chǎn)物(初級(jí)和次級(jí))是在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中與環(huán)境(生物的和非生物的)相互作用的結(jié)果，代謝產(chǎn)物在植物提高自身生態(tài)適應(yīng)性方面充當(dāng)著重要角色，其種類(lèi)與積累易受到生長(zhǎng)環(huán)境(如光、溫和水等)的調(diào)控[21-22].植物次級(jí)代謝不同于初級(jí)代謝，不僅存在種屬特異性，而且同一種或一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物在同一科屬植物體內(nèi)也存在差異性，且限制于特定的細(xì)胞、組織和器官[22-24].

圖3 甘南野生小葉黑柴胡根、莖和葉中總酚類(lèi) (A)和單株不同器官含量(B)的比較Figure 3 Comprison of phenolics contents in root，stem and leaf on a dry weight (A) and per plant basis (B) of wild B.smithii located in Gannan region

圖4 甘南野生小葉黑柴胡根、莖和葉中總皂苷類(lèi)含量(A)和單株不同器官含量(B)的比較Figure 4 Comprison of saikosaponins contents in root，stem and leaf on a dry weight (A) and per plant basis (B) of wild B.smithii located in Gannan region

圖5 甘南野生小葉黑柴胡根、莖和葉提取液抑制率(A)和FRAP值(B)的比較Figure 5 Comprison of inhibition rate(A) and FRAP value (B) in root，stem and leaf of wild B.smithii located in Gannan region

周亞福等[18]通過(guò)對(duì)紫花大葉柴胡不同器官(根、莖、葉)結(jié)構(gòu)與活性成分柴胡皂苷和黃酮類(lèi)化合物的積累關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)根、莖、葉中柴胡黃酮類(lèi)化合物和總皂苷干質(zhì)量含量均呈現(xiàn)為葉>根>莖.湯芳玲等[25]通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地(青海省、內(nèi)蒙)小葉黑柴胡不同器官(根莖結(jié)合部、莖、葉)中黃酮化合物含量進(jìn)行比較與分析，發(fā)現(xiàn)隨地上部分升高黃酮化合物干重含量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)；該研究結(jié)果中根、莖和葉黃酮和酚類(lèi)化合物干重含量均表現(xiàn)為葉>莖>根，與湯芳玲等[25]研究結(jié)果基本一致；而單株不同器官含量則呈現(xiàn)為莖>葉>根.這說(shuō)明品種和環(huán)境因素對(duì)柴胡屬植物生長(zhǎng)及其次級(jí)代謝產(chǎn)物在不同器官中的分布與積累具有顯著的影響.本研究中野生小葉黑柴胡生長(zhǎng)于甘南藏自治州草原地帶(海拔3 000 m)，具有低溫、強(qiáng)光照和紫外線輻射等的特點(diǎn)，可能使得黃酮和酚類(lèi)化合物以及總皂苷含量和單株不同器官含量在根、莖、葉中存在較大差異.

研究證明，黃酮類(lèi)化合物具有吸收紫外線、減少輻射對(duì)植物的傷害，并促進(jìn)紫外吸收物生物合成的功能[26]；酚類(lèi)化合物可使植株對(duì)低溫、輻射等逆境脅迫起到防御作用[27].馬金娥等[28]研究認(rèn)為，不同居群、同一居群夏蠟梅不同器官(根、莖、枝和葉)中黃酮類(lèi)化合物種類(lèi)和含量存在較大差異，其中位于頂層、光照強(qiáng)度大的居群下黃酮類(lèi)化合物含量較高.李正華[29]研究認(rèn)為，氣溫降低可提高楊樹(shù)葉片中酚類(lèi)化合物的含量.本研究小葉黑柴胡中黃酮和酚類(lèi)類(lèi)化合物含量由形態(tài)學(xué)上端至上形態(tài)學(xué)下端 (葉>莖>根)的降低可能與器官受到的強(qiáng)光照與低溫有一定的相關(guān)性.

本研究對(duì)甘南高原野生小葉黑柴胡不同器官(根、莖、葉)生物量、主要活性物質(zhì)(黃酮和酚類(lèi))以及抗氧化能力進(jìn)行了檢測(cè)分析，研究結(jié)果可為小葉黑柴胡高海拔區(qū)域種植栽培、各器官開(kāi)發(fā)與利用提供一定的理論基礎(chǔ).而對(duì)于小葉黑柴胡高海拔區(qū)的產(chǎn)量形成與活性成分積累的生理生化和分子機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入的研究.