陶騰州，李秉鈞，趙 業(yè)，王昕宇

(煙臺大學(xué) 海洋學(xué)院，山東 煙臺 264005 )

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是由除蟲菊酯合成的新型第三代農(nóng)藥，作為一類高效、廣譜、低毒的殺蟲劑，目前己廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)滅害及水產(chǎn)養(yǎng)殖中[1-2]，是傳統(tǒng)有機磷、有機氯等水產(chǎn)殺蟲劑的理想替代品。近年來，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致殘留農(nóng)藥通過地表徑流、雨水沖刷、生活廢水等途徑進入水環(huán)境，這直接或間接地破壞了近海養(yǎng)殖水環(huán)境，并對其中水生生物的生存造成嚴重威脅[3-5]，因此有必要開展擬除蟲菊酯對水生生物的毒性研究。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)屬棘皮動物門、刺參科、仿刺參屬，是一種營底棲、碎屑食性的溫帶海洋性物種[6-7]。由于自然分布和地理環(huán)境限制，北方仿刺參養(yǎng)殖主要分布于山東、河北、遼寧等地沿海[8]，相關(guān)研究表明，在黃渤海海區(qū)沉積物中存在擬除蟲菊酯殘留[9]，其中溴氰菊酯(106.6 μg/kg)、氯氰菊酯(87.7 μg/kg)，會對海域內(nèi)仿刺參生存造成潛在威脅。目前國內(nèi)外有關(guān)仿刺參毒性的研究主要集中于重金屬、抗生素、有機磷等方面[10-12]，而擬除蟲菊酯對仿刺參的毒性效應(yīng)研究卻鮮有報道。本試驗以重要的海水養(yǎng)殖物種仿刺參幼參作為研究對象，探討3種擬除蟲菊酯(溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯)對仿刺參的急性毒性效應(yīng)，確定3種擬除蟲菊酯對仿刺參的安全用量和毒性等級，旨在為科學(xué)的評估仿刺參養(yǎng)殖環(huán)境提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗藥劑

試驗仿刺參幼參平均體質(zhì)量(2.03±0.42) g，平均體長(3.16±0.62) cm，購自煙臺某育苗場，為人工繁殖飼養(yǎng)6月齡的幼參。幼參在室內(nèi)50 L塑料箱內(nèi)暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)期間日換水1次，隔日投喂餌料1次。試驗開始1 d前停止投喂餌料，隨機分組用于試驗。

溴氰菊酯乳液由拜耳杭州作物科學(xué)有限公司生產(chǎn),質(zhì)量濃度為25 g/L。試驗所用氯氰菊酯、氰戊菊酯均由南京羅邁美試劑公司提供，純度均為96%，先以丙酮配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的母液，使用時稀釋至所需質(zhì)量濃度，每24 h更新1次試驗藥液。

1.2 試驗海水

試驗用海水取自煙臺近海，經(jīng)砂濾除雜質(zhì)，pH 7.47，溶解氧水平7.56 mg/L，鹽度31.65，水溫20.2 ℃，置于消毒玻璃缸中待用。

1.3 急性毒性試驗方法

1.3.1 試驗梯度設(shè)置

參照《水生生物檢測手冊》中半靜水毒性試驗法[13]，根據(jù)預(yù)試驗所得質(zhì)量濃度范圍，采用等對數(shù)間距法計算設(shè)置仿刺參幼參急性試驗的質(zhì)量濃度梯度(溴氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯的預(yù)設(shè)質(zhì)量濃度梯度分別為0.07、0.10、0.14、0.21、0.30 mg/L，0.55、0.68、0.85、1.05、1.30 mg/L，0.75、0.98、1.27、1.65、2.15 mg/L)。每組藥物質(zhì)量濃度設(shè)置3個平行組，并添加一組空白對照組[其中氯氰菊酯和氰戊菊酯增設(shè)丙酮(助溶劑體積比為2‰)對照組]，其他試驗條件與毒性處理組完全一致。

1.3.2 試驗管理

在室溫靜水條件下，在3 L玻璃燒杯中進行急性毒性試驗，每組燒杯中養(yǎng)殖水體為3 L并放入暫養(yǎng)幼參10頭。試驗期間不投喂不充氣，保持水溫為19.5～21.5 ℃，每隔24 h全量換水1次，保持各組擬除蟲菊酯質(zhì)量濃度與原始預(yù)設(shè)質(zhì)量濃度一致，并對燒杯進行保鮮膜密封處理。試驗期間每隔4 h(夜間除外)觀察1次幼參狀態(tài)并記錄掛壁個數(shù)和死亡個數(shù)(幼參死亡的判定以沉入燒杯底部、管足無吸附能力、對輕微刺激無反應(yīng)、放入自然海水不能復(fù)活為準[14])，及時清除死亡個體保證水質(zhì)免受污染。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與計算

各試驗組取3個平行組的平均值計算死亡率和附壁率。其中死亡率按下式進行校正：

P=(P′-C)/(100-C)

式中，P為經(jīng)校正后的試驗組的死亡率(%)，C為對照組死亡率(%)，P′為試驗組取平行組平均值的死亡率(%)。

附壁率是用來評價幼參附著能力和活動情況的參數(shù)，按下式計算：

AR=NA/10×100%

式中，AR為附壁率(%)，NA為附著在燒杯壁上的幼參

數(shù)(頭)。

采用SPSS 18.0軟件Probit回歸分析，用概率單位法做出質(zhì)量濃度對數(shù)—概率單位線性方程，并計算出3種擬除蟲菊酯藥物對幼參的24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度(LC50)及95%置信區(qū)間。安全質(zhì)量濃度(SC)按下式計算[15]：

SC=96 h LC50×0.1

2 結(jié) 果

2.1 3種擬除蟲菊酯對仿刺參幼參死亡率的影響

在3種擬除蟲菊酯藥物對仿刺參幼參急性毒性試驗過程中，空白對照組和助溶劑對照組幼參均未出現(xiàn)死亡；通過試驗數(shù)據(jù)分析，得到各時間段質(zhì)量濃度對數(shù)與概率單位的回歸方程(表1)，并計算出3種藥物作用下仿刺參幼參的半致死質(zhì)量濃度及相應(yīng)95%置信區(qū)間(表1)。其中，溴氰菊酯、氯氰菊酯、及氰戊菊酯對仿刺參幼參的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為0.110、0.787、1.189 mg/L，表明3種擬除蟲菊酯對仿刺參幼參的毒性存在較大差異。同時，不同質(zhì)量濃度擬除蟲菊酯下幼參的死亡呈現(xiàn)出不同的模式(圖1),如溴氰菊酯組，中低質(zhì)量濃度(0.05～0.08 mg/L)處理組幼參的死亡個數(shù)較少，而高質(zhì)量濃度(0.12～0.30 mg/L)處理組死亡率迅速增加(圖1a)；氯氰菊酯試驗組，48 h時各藥物質(zhì)量濃度中幼參死亡率相比24 h增加較大(圖1b)。根據(jù)96 h半致死質(zhì)量濃度，計算出3種擬除蟲菊酯對仿刺參幼參的安全質(zhì)量濃度分別為0.011、0.079、0.119 mg/L，根據(jù)OECD1992年的化合物對水生生物毒性分級標準[16]可知，溴氰菊酯和氯氰菊酯對仿刺參幼參的毒性分級為極毒，氰戊菊酯對仿刺參幼參的毒性分級為高毒。

表1 3種擬除蟲菊酯對仿刺參幼參急性毒性作用及安全質(zhì)量濃度分析

注：回歸方程中，x表示質(zhì)量濃度(mg/L)的對數(shù)，y表示死亡率(%).

圖1 3種不同質(zhì)量濃度擬除蟲菊酯處理下仿刺參幼參的死亡率

2.2 3種擬除蟲菊酯對仿刺參幼參附壁率的影響

與死亡率相似，幼參附壁率隨處理時間和擬除蟲菊酯質(zhì)量濃度增大而降低(圖2)。試驗期間，對照組仿刺參附壁率為96%～100%，變化不大，而不同藥物處理下的附壁率則呈現(xiàn)差異表現(xiàn)。在氯氰菊酯中(圖2b)，附壁率在24 h后下降緩慢，而在48 h后均出現(xiàn)明顯下降；在氰戊菊酯中(圖2c)，附壁率在中低質(zhì)量濃度組(0.75～0.98 mg/L)中下降緩慢，而高質(zhì)量濃度組藥物(1.27～2.51 mg/L)處理后明顯下降。

圖2 3種不同質(zhì)量濃度擬除蟲菊酯處理下仿刺參幼參的附壁率

2.3 3種擬除蟲菊酯對仿刺參幼參的中毒癥狀和死亡狀態(tài)的影響

不同種類擬除蟲菊酯脅迫情況下的幼參的中毒癥狀和死亡特征呈現(xiàn)一定的相似和差異表現(xiàn)(表2)。受試幼參在接觸3種藥物以后，在藥物刺激下出現(xiàn)了不同程度吐腸現(xiàn)象，且幼參在死亡后身體呈僵硬狀態(tài)。溴氰菊酯和氯氰菊酯試驗組受試幼參在接觸藥物后，存在較嚴重幼參吐腸情況，數(shù)量隨質(zhì)量濃度增大呈上升趨勢，且在死亡幼參皮膚表面存在化皮現(xiàn)象；氰戊菊酯試驗組仿刺參幼參在受藥物刺激后只在高質(zhì)量濃度組(1.27～2.51 mg/L)存在輕微吐腸情況，死亡幼參皮膚表面未見明顯化皮。

表2 不同種類擬除蟲菊酯處理下仿刺參幼參中毒癥狀及死亡特征

3 討 論

3.1 3種藥物對仿刺參幼參的毒性評價

3.1.1 溴氰菊酯

3種擬除蟲菊酯中溴氰菊酯對仿刺參幼參的毒性最強，96 h半致死質(zhì)量濃度為0.110 mg/L，根據(jù)水生生物毒性分級為極毒物質(zhì)。現(xiàn)有研究中溴氰菊酯對魚、蝦、貝類的毒性研究較為全面，且發(fā)現(xiàn)其對不同種類生物的毒性效應(yīng)存在較大差異。Koprucu等[17]報道了溴氰菊酯對鯉魚(Cyprinuscarpio)的96 h半致死質(zhì)量濃度為0.213 μg/L；吳楠等[18-19]研究表明，溴氰菊酯對克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的肌細胞和中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的血細胞DNA造成損傷；鐘碩良等[20]報道，溴氰菊酯對文蛤(Meretrixmeretrix)和菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為0.27 mg/L和0.06 mg/L。對比上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溴氰菊酯對甲殼類、魚類的毒性較強，對仿刺參等無脊椎動物次之，對軟體動物的影響較低。

3.1.2 氯氰菊酯

氯氰菊酯對仿刺參幼參的毒性較溴氰菊酯弱，96 h半致死質(zhì)量濃度為0.787 mg/L，根據(jù)水生生物毒性分級，為極毒物質(zhì)。相比于其他水生生物而言，仿刺參對氯氰菊酯的敏感程度較低。Das等[21]對南亞野鯪(Labeorohita)進行氯氰菊酯的急性毒性試驗，得出96 h半致死質(zhì)量濃度為0.14 mg/L；譚曉珍等[22]研究發(fā)現(xiàn)，氯氰菊酯對櫛孔扇貝(Chlamysfarreri) 96 h半致死質(zhì)量濃度為0.24 mg/L；Burredge等[23]對美洲螯龍蝦(Homarusamericanus)成體使用氯氰菊酯脅迫后,得到其96 h半致死質(zhì)量濃度為0.04 μg/L。本試驗中氯氰菊酯對仿刺參幼參96 h半致死質(zhì)量濃度為0.787 mg/L，可見不同種類動物對氯氰菊酯的敏感性是不同的，一般為蝦類>魚類>貝類，仿刺參幼參對氯氰菊酯的敏感性低于其他水生生物。

3.1.3 氰戊菊酯

與上述兩種藥物相比，氰戊菊酯對仿刺參幼參的毒性最弱，96 h半致死質(zhì)量濃度為1.189 mg/L，根據(jù)水生生物毒性分級，為高毒物質(zhì)。與其他水生生物相比，仿刺參幼參對氰戊菊酯的敏感程度較低。吳琴瑟等[24]報道了氰戊菊酯對幾種對蝦的毒性試驗，發(fā)現(xiàn)氰戊菊酯質(zhì)量濃度為0.6 mg/L時，所有蝦類在85 min內(nèi)全部死亡；蔣金花等[25]研究發(fā)現(xiàn)，氰戊菊酯對斑馬魚(Daniorerio)仔魚、幼魚和成魚的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為3.40、18.30、4.87 μg/L；譚曉珍等[22]的研究表明，氰戊菊酯對櫛孔扇貝的96 h半致死質(zhì)量濃度為1.742 mg/L。本試驗中，氰戊菊酯對仿刺參幼參的96 h半致死質(zhì)量濃度為1.189 mg/L，對比發(fā)現(xiàn)，氰戊菊酯對蝦類和魚類的毒性要遠大于對以仿刺參和貝類為代表的無脊椎動物。

3.2 仿刺參幼參死亡狀態(tài)分析

本試驗選取了3種實際生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛的擬除蟲菊酯作為試驗藥物[26]，以海洋無脊椎動物的代表性經(jīng)濟物種仿刺參作為受試動物。由于生物早期發(fā)育階段是對藥物脅迫最為敏感的階段，因此本試驗選取6月齡的仿刺參幼參作為受試對象。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，3種擬除蟲菊酯類藥物導(dǎo)致幼參死亡后身體均會呈現(xiàn)僵硬狀態(tài)。擬除蟲菊酯類藥物作為一種神經(jīng)毒劑[27]，可作用于神經(jīng)膜鈉離子通道，干擾神經(jīng)傳導(dǎo)[28]，造成肌肉的持續(xù)收縮，推測這是造成仿刺參幼參死亡后身體呈僵硬狀態(tài)的原因之一。相關(guān)研究表明，擬除蟲菊酯類藥物能抑制鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)鰓組織中的Na+/K+-ATP酶活性[29]，從而導(dǎo)致其鰓上皮細胞脫落死亡等癥狀，這一現(xiàn)象與本試驗溴氰菊酯和氯氰菊酯組受試幼參死亡后出現(xiàn)的化皮癥狀相似，而氰戊菊酯試驗組中死亡幼參未見明顯化皮。仿刺參幼參對這3種不同類型擬除蟲菊酯的響應(yīng)模式很可能與其致毒作用機制不同有關(guān)，具體原因有待后續(xù)試驗深入研究。

本研究采用的急性毒性試驗只能反映藥物對于受試動物死亡情況的影響，無法全面反映藥物的其他毒性特征，因此需進一步開展擬除蟲菊酯對仿刺參的致毒機制研究。結(jié)合近年來黃渤海海岸帶沉積物中的擬除蟲菊酯調(diào)查數(shù)據(jù)[8]，對比本試驗結(jié)果中溴氰菊酯和氯氰菊酯的半致死質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)黃渤海沉積物中的2種擬除蟲菊酯殘留對仿刺參幼參暫時沒有明顯毒性作用。在自然海水環(huán)境中，其他環(huán)境因素(如重金屬、營養(yǎng)鹽)的存在均可能影響擬除蟲菊酯藥物的生物毒性，各成分之間可能存在拮抗、疊加或協(xié)同作用，因此擬除蟲菊酯與其他環(huán)境污染物的聯(lián)合毒性有必要進一步研究探索。

4 結(jié) 論

(1) 3種擬除蟲菊酯對仿刺參幼參96 h半致死質(zhì)量濃度分別為0.110 mg/L(溴氰菊酯)、0.787 mg/L(氯氰菊酯)、1.189 mg/L(氰戊菊酯)。

(2) 3種擬除蟲菊酯藥物對仿刺參幼參的毒性效應(yīng)存在差異，毒性依次為溴氰菊酯>氯氰菊酯>氰戊菊酯。

(3) 3種擬除蟲菊酯對仿刺參幼參的安全質(zhì)量濃度分別為0.011 mg/L(溴氰菊酯)、0.079 mg/L(氯氰菊酯)、0.119 mg/L(氰戊菊酯)，按照水生生物毒性分級，溴氰菊酯和氯氰菊酯對仿刺參幼參為極毒物質(zhì)，氰戊菊酯對仿刺參幼參為高毒物質(zhì)。