劉 陽(yáng)，張 力，覃劍暉

( 1.銅仁學(xué)院 農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州 銅仁 554300； 2.銅仁市碧江區(qū)滑石鄉(xiāng)人民政府，貴州 銅仁 554300； 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070 )

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，水環(huán)境日益遭到破壞，污染嚴(yán)重，各種重金屬離子進(jìn)入水循環(huán)，影響水生生物的的生存環(huán)境，隨著生物富集作用進(jìn)一步影響人類的健康[1]。重金屬鎘(Cd)是一種銀白色有光澤的金屬，有韌性和延展性，毒性強(qiáng)，半衰期長(zhǎng)達(dá)10～35年[2]。目前，鎘污染是當(dāng)今世界所面臨的一個(gè)嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，被鎘污染的空氣和植物對(duì)人體危害嚴(yán)重，這使其受到廣泛關(guān)注，在美國(guó)毒物管理委員會(huì)制定危害人類健康的名單上排名第六[3-4]。鎘的來(lái)源主要有兩種，一種存在于自然界中，作為副產(chǎn)品從硫鎘礦中提煉出來(lái)，另一種來(lái)源于人類的利用，如殺菌劑、殺蟲(chóng)劑、油漆、顏料等排入湖、河、棄置場(chǎng)和農(nóng)田，造成鎘污染。目前鎘污染已成為一個(gè)全球性的威脅[5]。

水體是魚(yú)類賴以生存的環(huán)境，魚(yú)類可以直接作為水體的指示生物，重金屬鎘主要通過(guò)兩種方式進(jìn)入魚(yú)類，一種通過(guò)鰓呼吸作用，通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入身體組織尤其是肝臟；另一種通過(guò)直接攝食方式進(jìn)入體內(nèi)，但食物中攜帶鎘的含量較低，對(duì)魚(yú)類損傷較小[6]。魚(yú)類雖然對(duì)鎘的吸收蓄積力很強(qiáng)，但會(huì)隨水環(huán)境中鎘的含量、受脅迫時(shí)間及富集部位的不同而有所差異，有國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，低濃度鎘處理30 d，虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的游速、生長(zhǎng)、日常氧消耗無(wú)明顯變化，高濃度鎘處理96 h，虹鱒的死亡率明顯提高[7]。

食蚊魚(yú)(Gambusiaaffinis)隸屬于鳉形目、花鳉科、食蚊魚(yú)屬，因嗜吃蚊子幼蟲(chóng)而得名[8]，它又名大肚魚(yú)、柳條魚(yú)、大眼叮當(dāng)，原產(chǎn)美國(guó)東南部、墨西哥及古巴，目前已經(jīng)成為全球性的入侵物種之一，適應(yīng)性強(qiáng)，生活于河溝、池塘、沼澤、水稻田等各種水體中[9],食蚊魚(yú)因其體形小，繁殖能力強(qiáng)，周期短等特性符合魚(yú)類毒性試驗(yàn)的要求，所以經(jīng)常被應(yīng)用在毒性試驗(yàn)中，是一種較為理想的環(huán)境污染指示生物，而目前國(guó)內(nèi)對(duì)食蚊魚(yú)在毒理學(xué)方面的研究較少。

當(dāng)生物體接觸鎘的脅迫后，因機(jī)體保護(hù)作用，會(huì)誘導(dǎo)一系列抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)抗鎘的毒性，脅迫的生物標(biāo)記分子主要是金屬硫蛋白(MT)、熱休克蛋白(HSPs)以及細(xì)胞色素氧化酶1A(CYP1A)等[10]。筆者主要探討了鎘對(duì)食蚊魚(yú)熱休克蛋白70(HSP70)、熱休克蛋白90(HSP90)、CYP1A以及MT基因表達(dá)的影響，通過(guò)多個(gè)角度綜合探討鎘對(duì)食蚊魚(yú)的毒性作用機(jī)制以及為防治鎘污染提供科學(xué)依據(jù)，拓展食蚊魚(yú)在環(huán)境毒理科學(xué)研究中的應(yīng)用范圍，也為其成為模式生物提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

食蚊魚(yú)購(gòu)于上海中環(huán)花鳥(niǎo)市場(chǎng)，體質(zhì)量(2.80±0.05) g，體長(zhǎng)(4.30±0.20) cm。在實(shí)驗(yàn)室條件，自然光照，用曝氣48 h以上的自來(lái)水暫養(yǎng)7 d，溫度(20±2) ℃，pH 7.8±0.2。選擇體色正常，游動(dòng)無(wú)異常，無(wú)疾病的食蚊魚(yú)進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)開(kāi)始前24 h停止投喂，馴養(yǎng)開(kāi)始48 h后記錄死亡率，若小于5%則符合GB/T 13267—91《水質(zhì)物質(zhì)對(duì)淡水魚(yú)(斑馬魚(yú))急性毒性測(cè)定方法》的要求。

1.2 試驗(yàn)試劑

總RNA提取試劑(RNAiso Plus)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser)、DL 2000 DNA Maker、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自Takara公司；DEPC濃縮液購(gòu)自TIANGEN公司；氯化鎘、異丙醇、無(wú)水乙醇、氯仿、氯化鈣等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

根據(jù)急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果[11]，試驗(yàn)以(0、1/40、1/20和1/10的96 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度)進(jìn)行染毒，鎘的質(zhì)量濃度分別為0、0.564、1.128、2.255 mg/L，設(shè)4個(gè)處理組，每個(gè)處理組均設(shè)3個(gè)平行，取暫養(yǎng)2周的健康食蚊魚(yú)進(jìn)行試驗(yàn)，每組放入20尾食蚊魚(yú)，在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，水溫(24±2) ℃，pH 7.8±0.2，光暗比12 h∶12 h，試驗(yàn)持續(xù)7 d，定期投喂并吸出殘?jiān)囼?yàn)期間魚(yú)無(wú)死亡。

1.4 取樣與樣品處理

試驗(yàn)開(kāi)始后的第1、3、5、7 d每組隨機(jī)抽取3尾試驗(yàn)魚(yú)，清洗表面，于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行冰上解剖，取其肝臟，置于-80 ℃冰箱中保存，以供后續(xù)HSP70、HSP90、MT、CYP1A和β-Actin基因表達(dá)的測(cè)定。

1.5 總RNA的提取

取-80 ℃冰箱中保存的樣品，嚴(yán)格按照Takara公司RNAiso Plus試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser)的步驟進(jìn)行操作，以上一步提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.7 特異性引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已報(bào)道的HSP70(序列號(hào)KF800737)、HSP90(序列號(hào)KF800736)、MT(序列號(hào)AB455145.1)、CYP1A(序列號(hào)AB371607.1)和β-Actin(序列號(hào)KP284099.1)基因序列，按照引物設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)食蚊魚(yú)HSP70、 HSP90、MT、CYP1A和β-Actin基因的特異性引物(表1)，由上海生工生物公司合成。

表1 熒光定量PCR所用引物序列

1.8 熒光定量PCR

將各個(gè)樣品cDNA稀釋10倍作為新的模板，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行β-Actin和目的基因的擴(kuò)增，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

反應(yīng)體系為25 μL：依次加入SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×) 12.5 μL、PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL、PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL、DNA模板2 μL、dH2O 9.5 μL。

反應(yīng)程序?yàn)槿椒ǎ?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。并收集熒光信號(hào)，使β-Actin和目的基因擴(kuò)增效率接近100%。

1.9 數(shù)據(jù)處理

得到的Ct數(shù)據(jù)，利用2-△△Ct法，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，△△Ct=(Ct目的基因-Ct0平均)-(Ctβ-Actin-Ct0平均)進(jìn)行計(jì)算，其數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件作圖，并進(jìn)行單因素方差分析和Duncan′s多重比較數(shù)值的差異顯著性分析[圖中*、**分別表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)、差異極顯著(P<0.01)]。

2 結(jié) 果

2.1 Cd2+脅迫對(duì)食蚊魚(yú)肝組織HSP70基因表達(dá)的影響

Cd2+對(duì)食蚊魚(yú)肝組織HSP70基因表達(dá)的影響見(jiàn)圖1。在1、3、7 d時(shí)，各處理組在相同時(shí)間內(nèi)隨Cd2+暴露質(zhì)量濃度的升高，肝組織HSP70基因表達(dá)量逐漸上調(diào)，并且差異顯著(P<0.01)。1.128、2.255 mg/L處理組，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，肝組織HSP70基因表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01)，且趨于穩(wěn)定；HSP70基因表達(dá)量峰值出現(xiàn)在第1 d的2.255 mg/L處理組；0.564 mg/L處理組隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，HSP70表達(dá)量無(wú)明顯差異。

2.2 Cd2+脅迫對(duì)食蚊魚(yú)肝組織HSP90基因表達(dá)的影響

Cd2+對(duì)食蚊魚(yú)肝組織HSP90基因表達(dá)的影響見(jiàn)圖2。1.128、2.255 mg/L處理組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，HSP90基因表達(dá)量總體表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)，且差異極顯著(P<0.01),但0.564 mg/L處理組的HSP90基因表達(dá)水平無(wú)明顯差異；在相同暴露時(shí)間下，隨Cd2+暴露質(zhì)量濃度的升高，HSP90基因表達(dá)水平總體表現(xiàn)也為顯著上調(diào)(P<0.01)。

2.3 Cd2+脅迫對(duì)食蚊魚(yú)肝組織MT基因表達(dá)的影響

Cd2+對(duì)食蚊魚(yú)肝組織MT基因表達(dá)的影響見(jiàn)圖3。不同質(zhì)量濃度處理組隨時(shí)間延長(zhǎng)，MT基因表達(dá)量總體表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)，且差異顯著(P<0.01)；1 d和3 d時(shí)，隨著Cd2+暴露質(zhì)量濃度的升高，MT基因表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)，5 d和7 d時(shí)，隨著Cd2+暴露質(zhì)量濃度的升高，MT基因表達(dá)水平先升后降，且逐漸達(dá)到穩(wěn)定(P<0.05)。

圖2 Cd2+暴露對(duì)食蚊魚(yú)肝組織HSP90基因的影響

圖3 Cd2+暴露對(duì)食蚊魚(yú)肝組織MT基因的影響

2.4 Cd2+脅迫對(duì)食蚊魚(yú)肝組織CYP1A基因表達(dá)的影響

Cd2+對(duì)食蚊魚(yú)肝組織CYP1A基因表達(dá)的影響見(jiàn)圖4。不同質(zhì)量濃度處理組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，CYP1A基因表達(dá)量總體表現(xiàn)為逐漸下調(diào)；1 d時(shí)，隨著Cd2+暴露質(zhì)量濃度的升高，CYP1A基因表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)，且達(dá)到峰值，3 d和7 d時(shí)，CYP1A基因表達(dá)水平變化不大，5 d時(shí)，CYP1A基因表達(dá)水平被顯著抑制(P<0.01)。

圖4 Cd2+暴露對(duì)食蚊魚(yú)肝組織CYP1A基因的影響

3 討 論

目前，重金屬污染已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，尤其是對(duì)水生生物。以往的研究表明，水體中的重金屬對(duì)水生生物產(chǎn)生嚴(yán)重影響，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失[12-13]，特別是重金屬鎘，既是致癌物質(zhì)，又是一種內(nèi)分泌干擾物[14-15]。在本研究中，食蚊魚(yú)經(jīng)過(guò)鎘處理后，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)肝組織中HSP70、HSP90、MT和CYP1A基因水平的變化情況，以了解重金屬鎘脅迫對(duì)食蚊魚(yú)基因表達(dá)的影響。

3.1 Cd2+脅迫對(duì)食蚊魚(yú)肝組織HSP70基因表達(dá)的影響

當(dāng)生物體遇到外界不良刺激，如紫外線、機(jī)械損傷、重金屬、酸、氧化劑等脅迫因子時(shí)，機(jī)體為抵抗外界不良刺激生物體第一反應(yīng)會(huì)合成一系列抗逆相關(guān)基因和蛋白，這些變化指標(biāo)就可以作為生物化學(xué)標(biāo)記，檢測(cè)有機(jī)體在不利條件時(shí)的變化。在環(huán)境毒理學(xué)中，熱休克蛋白經(jīng)常被作為生物標(biāo)志物[16]，當(dāng)細(xì)胞受到很大環(huán)境壓力時(shí)，它的第一反應(yīng)就是合成更多的熱休克蛋白[17]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著Cd2+暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，食蚊魚(yú)肝組織HSP70基因表達(dá)量先升后降，并且差異顯著。黃姑魚(yú)(Nibeaalbiflora)經(jīng)過(guò)低溫刺激后，隨著刺激的時(shí)間增加，HSP70的表達(dá)量先增后減，直至達(dá)到穩(wěn)定[18]。真鯛(Pagrosomusmajor)尾鰭纖維原細(xì)胞經(jīng)鎘和銅的暴露處理4 h，其體內(nèi)HSP70基因水平明顯增加[17]。Ryan等[16]研究表明，魚(yú)類細(xì)胞經(jīng)過(guò)鎘和銅的暴露處理后，HSP70基因表達(dá)被嚴(yán)重誘導(dǎo)，HSP70基因水平在暴露結(jié)束后才恢復(fù)至正常的表達(dá)量，HSP70基因水平的變化受環(huán)境壓力的影響。劉迪秋等[19]研究鎘處理后對(duì)鯽魚(yú)(Carassiusauratus)肝臟組織中基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其肝臟組織中HSP27、HSP47、HSP60、HSP70、HSP90、MT-B、CYP1A基因的表達(dá)屬于中間型，GPx 4a、HSP30及GR基因的表達(dá)屬于完全的抑制型。重金屬鎘脅迫唐魚(yú)(Tanichthysalbonubes)96 h后，不同的基因表達(dá)差異顯著，肝臟中HSP70基因表達(dá)水平無(wú)顯著變化，而肝臟中HSP60基因表達(dá)水平受到顯著誘導(dǎo)作用，但不同組織中的HSP70基因水平差異顯著，鰓中HSP70基因水平表現(xiàn)為先升后降[17]。

3.2 Cd2+脅迫對(duì)食蚊魚(yú)肝組織HSP90基因表達(dá)的影響

食蚊魚(yú)經(jīng)過(guò)Cd2+處理后，在相同時(shí)間下，1.128、2.255 mg/L處理組HSP90基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，并且達(dá)到峰值，而0.564 mg/L處理組HSP90基因的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。以往的研究表明，HSP90基因的表達(dá)水平在不同物種或者不同重金屬暴露下差異很大。如用10 mg/L鎘溶液處理鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)，其腎臟中HSP90a基因表達(dá)水平先升后降，但肝臟中HSP90a表達(dá)水平卻顯著上升[20]。唐魚(yú)在經(jīng)過(guò)重金屬鎘暴露后，鰓和肝臟組織中HSP90基因的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，表現(xiàn)為下降趨勢(shì)[17]。而在本研究中，重金屬暴露后HSP90基因的表達(dá)被顯著誘導(dǎo)，這與斑馬魚(yú)(Daniorerio)[21]和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)[22]的研究結(jié)果相似。HSP90表達(dá)水平上升，可能是生物遇到毒物時(shí)，HSP90基因協(xié)助變性的蛋白質(zhì)進(jìn)行修復(fù)，保護(hù)機(jī)體。

3.3 Cd2+脅迫對(duì)食蚊魚(yú)肝組織MT基因表達(dá)的影響

MT是可溶性金屬結(jié)合蛋白，富含較多半胱氨酸的短肽，對(duì)多種金屬具有高度親和性[23]，因此能選擇性結(jié)合銅、鎘、鋅等金屬離子。MT基因已被廣泛用作重金屬處理的生物標(biāo)記物，尤其是鎘[24]。在本試驗(yàn)中，所有的Cd2+處理組的食蚊魚(yú)肝組織中的MT基因表達(dá)量與對(duì)照相比均差異顯著，隨著暴露的時(shí)間延長(zhǎng)，MT基因的表達(dá)量顯著上升后下降。在之前的研究中也觀察到類似的現(xiàn)象，如鎘處理后在大鼠肝組織的MT基因顯著上升達(dá)到高峰，然后下降[25]，也與虹鱒[26]和羅非魚(yú)(Oreochromis)[27]經(jīng)過(guò)刺激后MT基因變化相似。一定量的重金屬誘導(dǎo)MT基因的表達(dá)量增加，但隨時(shí)間延長(zhǎng)，重金屬在肝臟中快速堆積，超過(guò)其耐受，可能破壞MT基因表達(dá)量和重金屬之間的穩(wěn)定。

3.4 Cd2+脅迫對(duì)食蚊魚(yú)肝組織CYP1A基因表達(dá)的影響

CYP1A是一個(gè)典型的生物標(biāo)志物，環(huán)境污染物和藥物會(huì)影響其活性，目前CYP1A被廣泛應(yīng)用在毒理學(xué)試驗(yàn)中[28-29]。本研究結(jié)果表明，Cd2+脅迫初始時(shí)，CYP1A基因的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著上調(diào)，但隨處理時(shí)間的增加，其表達(dá)水平又被顯著抑制。Huang等[30]報(bào)道，類固醇激素處理雌性食蚊魚(yú)，肝臟CYP1A基因的表達(dá)量顯著減少。事實(shí)上，經(jīng)過(guò)有毒物質(zhì)處理的食蚊魚(yú)，其CYP1A基因表達(dá)水平的抑制可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的解毒能力。因此據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)，Cd2+可以調(diào)節(jié)CYP1A基因表達(dá)水平，為需要監(jiān)測(cè)Cd2+的區(qū)域的生物作標(biāo)志物。

本試驗(yàn)的結(jié)果表明，鎘暴露對(duì)食蚊魚(yú)的HSP70、HSP90、MT和CYP1A基因較為敏感，這為食蚊魚(yú)作為潛在的試驗(yàn)動(dòng)物提供了依據(jù)，拓展了其在環(huán)境毒理學(xué)中的研究。此外，重金屬暴露質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間也會(huì)影響生物標(biāo)記物的基因表達(dá)水平，監(jiān)測(cè)過(guò)程中不能只單純利用一個(gè)指標(biāo)，綜合各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，才能得到可靠、符合事實(shí)的結(jié)果。