朱吉風(fēng)，張俊英，楊立勇，蔣美艷，江建霞，李延莉，王偉榮，周熙榮

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所，上海201403）

甘藍型油菜（Brassica napus L.）是我國第一大油料作物，也是我國唯一的冬性油料作物。我國油菜常年種植面積約665萬hm2，年均總產(chǎn)量約1 327萬t，位居世界第一［1-2］。近年來，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整、農(nóng)村勞動力的轉(zhuǎn)移以及農(nóng)業(yè)機械化的發(fā)展，免耕直播技術(shù)逐漸成為油菜種植的主要方式。播種后，種子發(fā)芽迅速、整齊是作物高產(chǎn)的保證［3-4］。種子萌發(fā)受遺傳、水分、氧氣、溫度等多重因素的影響［4-6］，其中，溫度是影響種子萌發(fā)極為重要的環(huán)境因子之一［7-8］。溫度適宜促進種子萌發(fā)，溫度過低則導(dǎo)致種子萌發(fā)時間延長、萌發(fā)率和出苗率急劇下降，影響出苗整齊度和作物后期生長發(fā)育，降低作物最終產(chǎn)量［5-6，9］。

我國冬油菜主要種植于長江流域，該區(qū)域主要種植模式為稻油輪作。隨著前茬水稻生育期延長以及油菜直播面積不斷增加，油菜晚播、遲播成為必然［10］。晚播油菜種子萌發(fā)易受低溫脅迫［5］，嚴重影響油菜出苗整齊度以及產(chǎn)量。種植耐低溫發(fā)芽新品種是保證油菜在晚直播栽培模式下安全生產(chǎn)的最經(jīng)濟有效的手段。然而，生產(chǎn)上耐低溫發(fā)芽種質(zhì)缺乏，耐低溫發(fā)芽遺傳研究不足，相關(guān)基因尚未克隆，嚴重阻礙了油菜耐低溫發(fā)芽的育種進展。因此，篩選耐低溫發(fā)芽種質(zhì)、發(fā)掘功能基因、開展油菜耐低溫分子育種意義重大。

油菜耐低溫發(fā)芽種質(zhì)鑒定是獲得耐低溫發(fā)芽種質(zhì)資源、發(fā)掘相關(guān)基因、開展油菜耐低溫育種的基礎(chǔ)。合適的低溫處理條件是開展上述研究的關(guān)鍵，不同的溫度處理條件嚴重影響著種子的發(fā)芽情況以及鑒定結(jié)果。本研究選用5個溫度梯度對78份油菜種質(zhì)進行種子發(fā)芽速率鑒定和評價，通過比較油菜種質(zhì)在不同低溫條件下發(fā)芽速率的差異，探索油菜種子發(fā)芽的敏感溫度，同時篩選出不同溫度條件下的耐低溫發(fā)芽種質(zhì)資源，以期為大規(guī)模進行油菜耐低溫發(fā)芽資源鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

78份甘藍型油菜種質(zhì)由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，其中常規(guī)品種7份，包括該院自選品種3份和從國內(nèi)其他單位引進的品種4份；自交系71份，包括該院自選自交系54份和從國內(nèi)其他單位引進的雜交種經(jīng)自交選育的后代種質(zhì)17份；以甘藍型油菜耐低溫發(fā)芽品種‘秦油7號’［12］為低溫發(fā)芽耐性對照。

1.2 試驗方法

選取當(dāng)年收獲、大小均勻、飽滿、無病害油菜種子各450粒，放入鋪有無菌濾紙、內(nèi)徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，每皿30粒種子，重復(fù)3次，加入10 mL無菌蒸餾水，放入溫度分別為20℃、15℃、10℃、8℃以及6℃的恒溫培養(yǎng)箱（BINDERMKF240）中進行發(fā)芽試驗，待‘秦油7號’試驗種子全部發(fā)芽時調(diào)查記錄每份材料各重復(fù)的發(fā)芽數(shù)，發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)為胚根長度大于2 mm［10］。隨后，將未發(fā)芽種子移至適溫（20℃）條件下繼續(xù)培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計并記錄發(fā)芽數(shù)，以排除無活力種子的影響，并計算相對發(fā)芽率作為油菜種子耐低溫發(fā)芽指標(biāo)，參照油菜、水稻等作物的低溫發(fā)芽耐性評價標(biāo)準(zhǔn)［11-12］，將油菜種子耐低溫發(fā)芽特性分為4級：相對發(fā)芽率＞80%為耐低溫型（R）、相對發(fā)芽率60%—80%為中間型（MR）、相對發(fā)芽率20%—60%為冷敏型（S）、相對發(fā)芽率≤20%為高冷敏型（HS）。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

相對發(fā)芽率=低溫發(fā)芽種子數(shù)/供試種子發(fā)芽總數(shù)×100%

式中：供試種子發(fā)芽總數(shù)=低溫發(fā)芽種子數(shù)+低溫未發(fā)芽種子移至20℃的發(fā)芽種子數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理，利用SAS 9.2軟件對甘藍型油菜種質(zhì)資源在不同溫度下的相對發(fā)芽率進行方差分析，并采用Duncan新復(fù)極差法對不同溫度下的種子發(fā)芽率進行多重比較，分析溫度間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子發(fā)芽活力檢測結(jié)果

供試油菜種質(zhì)在20℃條件下培養(yǎng)3 d后的種子發(fā)芽率基本一致，其中發(fā)芽率為100%的最多，有66份，占供試油菜種質(zhì)的84.6%；發(fā)芽率在90%以上的有11份，占供試油菜種質(zhì)的14.1%；發(fā)芽率不足90%的僅有1份，占供試油菜種質(zhì)的1.3%，說明所選油菜種質(zhì)的種子發(fā)芽活力較強。

2.2 不同溫度處理間油菜種子的發(fā)芽率比較

由表1可見，不同溫度處理間供試油菜種子發(fā)芽率的P＜0.001，說明供試油菜種質(zhì)的種子發(fā)芽率在5種不同溫度之間存在極顯著差異。

通過多重比較發(fā)現(xiàn)：油菜種子在常溫條件下和低溫條件下的相對發(fā)芽率差異顯著，說明溫度降低后，供試油菜種質(zhì)的種子平均發(fā)芽率顯著降低；供試油菜種質(zhì)的種子相對發(fā)芽率在10℃與15℃之間差異不顯著、在6℃與8℃之間差異亦不顯著，而在10℃、15℃處理分別與6℃、8℃處理之間的差異均達到顯著水平（表2），說明供試油菜種質(zhì)的種子發(fā)芽率受10℃以下低溫脅迫的影響顯著。

表1 供試油菜種質(zhì)種子發(fā)芽率間的差異顯著性分析Table1 Significant difference analysis of seed germ ination rate among tested rape germplasms

表2 供試油菜種質(zhì)在不同溫度下的相對發(fā)芽率比較Table 2 Comparison of relative germ ination rate of tested rape germplasms at different temperatures

2.3 不同油菜種質(zhì)的耐低溫發(fā)芽力比較

統(tǒng)計分析78份油菜種質(zhì)在低溫脅迫下的發(fā)芽情況（表1）發(fā)現(xiàn)，材料間的種子相對發(fā)芽率差異極顯著（P=0.0007＜0.001），說明在所有低溫處理下，供試油菜種質(zhì)之間的發(fā)芽率存在極顯著差異。

通過比較不同低溫條件下供試油菜種質(zhì)間的種子發(fā)芽率差異發(fā)現(xiàn)，在8℃低溫條件下，不同油菜種質(zhì)間的種子發(fā)芽率方差變異范圍最大（表3），表明在8℃低溫條件下，不同油菜種質(zhì)間的種子發(fā)芽率差異最大，耐低溫評價結(jié)果可靠。

表3 不同低溫脅迫下油菜種質(zhì)的相對發(fā)芽率方差分析Table 3 Variance analysis of relative germ ination rate of rape germ p lasm s under different low temperature stress

2.4 不同低溫處理下油菜種子的發(fā)芽情況

如圖1和表4所示，在不同溫度處理下，78份油菜種質(zhì)的相對發(fā)芽率差異明顯。在10℃及以上溫度條件下，大多數(shù)供試油菜種質(zhì)仍具有較強的種子發(fā)芽力，如在15℃和10℃條件下，種子相對發(fā)芽率超過80%的油菜種質(zhì)各為50份和45份，分別占供試油菜種質(zhì)的64.1%和57.7%。但當(dāng)處理溫度低于10℃時，低溫發(fā)芽耐性油菜種質(zhì)總數(shù)顯著減少。當(dāng)溫度降至8℃時，耐低溫發(fā)芽油菜種質(zhì)僅有9份，其中7份耐低溫發(fā)芽油菜種質(zhì)在6℃條件下的相對發(fā)芽率≥90%，進一步表明8℃低溫條件下對油菜種質(zhì)的耐低溫特性評價結(jié)果可靠。

2.5 甘藍型油菜耐低溫發(fā)芽種質(zhì)篩選

通過分析78份供試油菜種質(zhì)的低溫發(fā)芽特性發(fā)現(xiàn)，12份油菜種質(zhì)對溫度極敏感，這些油菜種質(zhì)在15℃條件下的種子相對發(fā)芽率已降至20%以下，表現(xiàn)出高冷敏性（表4）。

根據(jù)8℃低溫條件下油菜種質(zhì)的相對發(fā)芽率，對供試油菜種質(zhì)進行低溫發(fā)芽耐性等級劃分，結(jié)果表明：在78份油菜種質(zhì)中，共篩選出耐低溫發(fā)芽油菜種質(zhì)9份，占供試油菜種質(zhì)的11.5%；中間型9份，占供試油菜種質(zhì)的11.5%；冷敏型14份，占供試油菜種質(zhì)的18.0%；高冷敏型46份，占供試油菜種質(zhì)的59.0%（表4）。所有低溫發(fā)芽耐性油菜種質(zhì)的相對發(fā)芽率處于94%—100%，其中3個耐低溫發(fā)芽油菜種質(zhì)（‘秦油7號’選系、86155選系和3183）在不同溫度下的相對發(fā)芽率一直穩(wěn)定在100%。

圖1 油菜種質(zhì)在不同溫度條件下的相對發(fā)芽率分布Fig.1 Relative germ ination rate distribution of rape germ plasms at different tem peratures

表4 不同處理溫度下篩選的油菜種質(zhì)Table 4 Rape germplasms screened at different temperatures

（續(xù)表4）

3 討論

種子發(fā)芽率受自身因素影響而有所差異，本試驗選用相對發(fā)芽率作為種子在低溫條件下的耐性指標(biāo)，可減少由種子自身引起的誤差，同時排除了無活力種子在耐低溫評價上的干擾。

萌發(fā)期鑒定耐低溫發(fā)芽材料時，前人多選用10℃/5℃或15℃/10℃（12 h/12 h）［5，12］。本研究將低溫處理條件細化，鑒定油菜種質(zhì)在20℃、15℃、10℃、8℃以及6℃條件下的種子發(fā)芽情況。本研究表明，在20℃條件下，供試油菜種質(zhì)的種子幾乎全發(fā)芽，隨溫度降低，供試種質(zhì)的種子發(fā)芽時間明顯延長，種子的相對發(fā)芽率顯著降低，當(dāng)溫度低于10℃時，多數(shù)材料的種子不發(fā)芽或發(fā)芽率顯著降低，這與前人報道的10℃以下低溫顯著降低油菜種子發(fā)芽率一致［13-14］。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，供試材料的耐低溫發(fā)芽性在15℃和10℃之間差異不顯著，在8℃和6℃之間差異不顯著，但在10℃上下溫度間差異顯著，初步表明大多油菜種子的低溫發(fā)芽臨界溫度可能在10℃左右。因不同供試油菜種質(zhì)在8℃下的種子相對發(fā)芽率存在較大差異，初步認為在8℃條件下對油菜種質(zhì)進行耐低溫評價所得結(jié)果較為可靠。

長江流域直播油菜播種時間一般在國慶之后，隨前茬作物收獲時間的推遲，部分主產(chǎn)區(qū)油菜的播種時間推遲到10月下旬或11月上旬［13］，期間該地區(qū)可能會遭遇冷空氣影響，導(dǎo)致該區(qū)域最低氣溫驟降至10℃以下。如近些年上海郊區(qū)在10月下旬或11月上旬每年均經(jīng)歷1—2次低溫寒潮，最低溫度降至8—10℃，因此，篩選出萌發(fā)期耐8℃及以下低溫的油菜種質(zhì)對避免油菜萌發(fā)期遭遇低溫脅迫意義重大。本研究在8℃處理條件下，篩選出耐低溫發(fā)芽種質(zhì)9份，這些耐低溫種質(zhì)在8℃條件發(fā)芽4 d，種子發(fā)芽率可高達90%以上，其中3份耐低溫油菜種質(zhì)（‘秦油7號’選系、86155選系和3183）的低溫相對發(fā)芽率高達100%，說明供試材料中存在強耐低溫特性的油菜種質(zhì)。本研究篩選出的耐低溫油菜種質(zhì)，可為培育萌發(fā)期耐低溫油菜新品種和挖掘低溫耐性基因提供種質(zhì)資源。