宋甜甜，張赫男，吳 迪，李巧珍，劉艷芳，周 帥，汪雯翰，楊 焱*

（1上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200234；2國家食用菌工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海201403）

猴頭菌［Hericium erinaceus（Bull.）Pers.］是我國珍貴的食藥兼用菌［1］，在中醫(yī)藥領(lǐng)域有著悠久歷史［2］，其多糖成分具有免疫調(diào)節(jié)［3］、抗炎、抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化、提高機(jī)體耐缺氧能力、增加心肌血液輸出量、降血糖、保肝護(hù)肝及治療胃潰瘍、胃炎的功效。猴頭菌多糖作為猴頭菌中的主要功效成分，其顯著的免疫調(diào)節(jié)作用備受研究者和市場關(guān)注。猴頭菌多糖可來源于子實體，也可來源于發(fā)酵菌絲體，液體發(fā)酵可以在較短的時間內(nèi)獲得大量的菌絲體及其發(fā)酵產(chǎn)物，生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、成本低、工藝設(shè)備簡單。深層發(fā)酵法還能夠突破猴頭菌生長的環(huán)境限制因素，提供充足的養(yǎng)料供生物活性物質(zhì)積累，可持續(xù)滿足市場對猴頭菌及猴頭菌多糖的需求［4］。優(yōu)良的菌株是獲得優(yōu)質(zhì)發(fā)酵菌絲體的前提，隨著人們對食用菌營養(yǎng)價值和藥用價值認(rèn)識的提高，以及食用菌產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的增加，食用菌育種工作也成為研究熱點。其中，雜交育種是食用菌新品種選育中使用最廣泛、收效最明顯的傳統(tǒng)育種手段，雜交育種利用不同遺傳類型之間的交配使遺傳基因重新組合創(chuàng)造出兼有雙親優(yōu)點的新品種［5］。本研究團(tuán)隊前期利用雜交育種技術(shù)選育獲得了3株高產(chǎn)多糖的優(yōu)勢猴頭菌株，其液體發(fā)酵生物量及菌絲體多糖含量較兩親本菌株提升率穩(wěn)定，是進(jìn)行猴頭菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)良菌株。多糖含量提高的菌株在多糖的結(jié)構(gòu)特征和活性方面有何變化值得深入研究。本試驗擬對雜交選育獲得的猴頭菌高產(chǎn)多糖菌株液體發(fā)酵菌絲體胞內(nèi)多糖的理化性質(zhì)、基本結(jié)構(gòu)特征及體外刺激巨噬細(xì)胞釋放NO的活性進(jìn)行系統(tǒng)研究，比較雜交菌株與出發(fā)菌株發(fā)酵菌絲體多糖的理化性質(zhì)和活性差異，探究內(nèi)在相關(guān)性，為猴頭菌的育種及產(chǎn)品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

猴頭菌親本菌株0605和刺長，以及雜交育種選育出的高產(chǎn)多糖菌株15、91、611，均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

馬鈴薯葡萄糖肉湯（購自美國BD公司）；酵母自溶粉（購自安琪酵母股份有限公司）；葡萄糖、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、無水乙醇（均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和單糖標(biāo)準(zhǔn)品為德國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶為美國Gibo公司產(chǎn)品；青霉素、鏈霉素為美國Amersco公司產(chǎn)品；細(xì)菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）為德國Sigma公司產(chǎn)品。RAW 264.7細(xì)胞株（小鼠巨噬細(xì)胞株）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫ATCC（American Type Culture Collection）。

SA-1480-2型超凈無菌工作臺（上海上凈凈化設(shè)備有限公司）；高壓滅菌鍋SS-325型（日本TOMY公司）；酶標(biāo)儀Biotek-Synergy HT型（美國Bio-Tek公司）；ZWY-2102雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；Centrifuge 5810R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorff公司）；Waters e2695高效液相系統(tǒng)（美國Waters公司）；八角度激光光散射儀及粘度檢測器（美國Wyatt公司）；ICS2500離子色譜儀（美國Dionex公司）。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：取39 g PDA粉末溶于1 L蒸餾水中，pH自然。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖肉湯24 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，1 L蒸餾水，于滅菌鍋中121℃滅菌35 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母自溶粉10 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，1 L蒸餾水，于滅菌鍋中121℃滅菌35 min。

1.4 猴頭菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：取兩親本菌株（0605、刺長）和雜交菌株（15、91、611）的平板菌塊12塊（每塊大小0.5 cm×0.5 cm），分別接種于種子培養(yǎng)基中。在26℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)10 d，即得種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液以10%（V/V）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。在26℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)8 d，紗布過濾收集菌絲體，并用蒸餾水洗滌3次，冷凍干燥，得干燥菌絲體。

1.5 發(fā)酵菌絲體多糖含量測定

各猴頭菌發(fā)酵菌絲體經(jīng)粉碎過20 mm孔徑篩，準(zhǔn)確稱取1.000 g，置于50 mL具塞離心管內(nèi)。5 mL蒸餾水浸潤樣品，緩慢加入20 mL無水乙醇，使乙醇終體積分?jǐn)?shù)（下同）為80%，懸緊蓋子，渦旋振蕩混勻，超聲提取30 min。提取結(jié)束后，4 000 r·min-1離心10 min，棄上清液。用10 mL 80%的乙醇洗滌沉淀，離心。用蒸餾水將沉淀轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，加入50 mL蒸餾水，裝上磨口的空氣冷凝管，于沸水浴中提取2 h。冷卻至室溫，過濾，將上清轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，殘渣洗滌2—3次，洗滌液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加水定容。此溶液為樣品的多糖含量（質(zhì)量比）測定液，對其進(jìn)行多糖含量測定。

1.6 猴頭菌發(fā)酵菌絲體多糖組分的制備

分別準(zhǔn)確稱取各猴頭菌液體發(fā)酵干燥菌絲體20.00 g，按料液比1∶20（W/V）加入蒸餾水，100℃提取2 h，取上清，提取2次，合并提取液，按料液比1∶3（W/V）濃縮。上清添加無水乙醇至終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到20%，4℃冰箱中靜置12 h，10 000×g離心，沉淀用20%乙醇洗多次，醇洗時劇烈振蕩，直到上清清澈無色。收集沉淀，加足夠多蒸餾水并加熱，保證沉淀充分溶解，90℃水浴揮醇2 h，直到無乙醇?xì)馕?。抽濾除去不溶雜質(zhì)后減壓旋蒸濃縮樣品，冷凍干燥，獲得的多糖按猴頭菌名稱0605、刺長、15、91、611依次命名為H1P20、HCP20、H15P20、H91P20、H611P20；向20%醇沉后上清中加適量無水乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為60%，獲得的多糖依次命名為H1P60、HCP60、H15P60、H91P60、H611P60，共制備得到10個多糖組份樣品。

1.7 多糖相對分子質(zhì)量分布測定

1.7.1 樣品的制備和處理

制備流動相：0.05 mol·L-1的NaH2PO4和0.15 mol·L-1的0.02%（質(zhì)量比）疊氮鈉（pH 7.0）。分別準(zhǔn)確稱量多糖樣品5 mg，用1 mL流動相溶解，配制成質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的溶液。12 000×g離心20 min，上清液過0.22μm的水相微孔膜，使用HPSEC-MALLS-RI聯(lián)用分析。色譜分析條件：色譜柱溫用柱溫箱恒定在35℃；分析柱選TSK PWXL6000和TSK PWXL3000凝膠色譜柱串聯(lián)分析，流速為0.5 mL·min-1；激光檢測器光源波長為623.8 nm。多糖在溶液中的折光指數(shù)增量（dn/dc）按照0.146 mL·g-1計算［6］。

1.7.2 數(shù)據(jù)處理

使用Astra（version 6.1.1，Wyatt Technology，Santa Barbara，CA）數(shù)據(jù)分析軟件對光散射數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析，計算相對分子質(zhì)量［7］。

1.8 單糖組成分析

采用高效陰離子交換色譜法測定不同菌株菌絲體分級醇沉多糖組分的單糖組成：取2 mg多糖樣品于耐高溫的V型反應(yīng)瓶中，加入3 mL濃度為2 mol·L-1的三氟乙酸（TFA），110℃油浴加熱，水解4 h，冷卻至室溫后，40℃下氮氣吹干，然后加入3 mL甲醇，吹干，重復(fù)以上操作4—5次以完全除去TFA。用超純水將反應(yīng)瓶中的樣品溶解并定容至100 mL，取1 mL溶液12 000×g離心15 min，取上清，測定水解產(chǎn)物中的單糖組成。

標(biāo)準(zhǔn)品：D-Gal、D-Glc、D-Ara、L-Fuc、L-Rha、D-Man、D-Xyl、D-Fru、Rib、D-GluA和D-GalA混標(biāo)。

色譜條件：ICS2500離子色譜儀裝備CarboPac TMPA-20陰離子交換柱（150 mm×3 mm i.d.），脈沖安倍檢測器，進(jìn)樣量25μL，流速0.45 mL·min-1，柱溫30℃，流動相為超純水和0.25 mol·L-1的NaOH［8］。

1.9 紅外光譜分析

取2 mg左右的樣品與KBr粉末研磨混合均勻，壓片后在400—4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜分析［9］。

1.10 體外刺激巨噬細(xì)胞釋放NO的活性試驗

稱取一定量透析過（相對分子質(zhì)量3 500，透析3 d）的猴頭菌多糖樣品于滅過菌的Eppendoff離心管中，在無菌工作臺上用PBS溶液配成5 mg·mL-1的樣品母液，18 000×g離心30 min，將上清轉(zhuǎn)入滅菌管中，用RPMI-1640培養(yǎng)基將樣品分別稀釋至50μg·mL-1、100μg·mL-1、200μg·mL-1、500μg·mL-1，參照喬艷茹等［10］的方法測定巨噬細(xì)胞RAW 264.7的NO產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交菌株和親本菌株發(fā)酵菌絲生物量和多糖含量

如表1所示，雜交菌株15、91和611的液體發(fā)酵生物量較出發(fā)菌株0605均有明顯的提升，提升率分別為17.28%、22.62%和29.23%；雜交菌株611較親本菌株刺長生物量的提升率為11.48%；各雜交菌株發(fā)酵菌絲體多糖含量較出發(fā)菌株0605和刺長均有明顯提升，其中雜交菌株15菌絲體多糖含量較出發(fā)菌株0605提升了111.62%，較刺長提升了107.98%。結(jié)果表明，經(jīng)單核體雜交育種可篩選獲得猴頭菌液體發(fā)酵生物量和多糖含量高的優(yōu)良菌株。

表1 各菌株生物量與菌絲體多糖含量Table 1 Biomass and polysaccharide content ofmycelium of each strain

2.2 雜交選育對猴頭菌發(fā)酵菌絲體多糖相對分子質(zhì)量分布的影響

如圖1所示，雜交菌株15、91菌絲體20%醇沉多糖組分與親本菌株的液相指紋圖譜趨勢較一致，洗脫時間為32—34 min時，H611P20多糖組分液相指紋圖譜與親本菌株刺長的HCP20多糖組分有明顯差異，與親本菌株0605的H1P20多糖組分的Peak1一致，但與Peak2有明顯差異。各多糖組分的相對分子質(zhì)量分布情況顯示（表2、表3），雜交菌株H15P20和H611P20的Peak1相對分子質(zhì)量較大，可達(dá)1×107左右，與親本菌株H1P20多糖組分相對分子質(zhì)量相似，而雜交菌株H91P20與親本菌株刺長HCP20多糖組分相對分子質(zhì)量接近。雜交菌株20%醇沉多糖組分的大相對分子質(zhì)量組分Peak1占比在兩親本之間；而在60%醇沉多糖組分中，雜交菌株與親本菌株糖組分之間無明顯差異。結(jié)果表明，傳統(tǒng)雜交育種獲得的雜交后代菌株多糖相對分子質(zhì)量分布可能與某一親本菌株相近或介于兩親本菌株之間。

圖1 猴頭菌菌絲體20%、60%醇沉多糖組分HPSEC-MALLS-RI圖譜Fig.1 HPSEC-MALLS-RI chromatogram s of 20%and 60%ethanol precipitated polysaccharides from Hericium erinaceus m ycelium

表2 親本菌株和雜交菌株猴頭菌20%醇沉多糖的相對分子質(zhì)量分布范圍Table 2 M olecular weight distribution of 20%ethanol precipitated polysaccharides from Hericium erinaceus mycelium of parent strains and hybrid strains

表3 親本菌株和雜交菌株猴頭菌60%醇沉多糖的相對分子質(zhì)量分布范圍Table 3 M olecular weight distribution of 60%ethanol precipitated polysaccharides from Hericium erinaceus mycelium of parent strains and hybrid strains

2.3 雜交育種對猴頭菌發(fā)酵菌絲體多糖的單糖組成影響

由表4可見，猴頭菌雜交菌株的發(fā)酵菌絲體多糖組分的單糖組成與親本菌株基本一致，多糖組分中單糖的比例介于兩親本之間。20%醇沉多糖由半乳糖、葡萄糖和少量甘露糖構(gòu)成，親本菌株HCP20中的葡萄糖比例高于H1P20，雜交菌株多糖組分H15P20、H91P20、H611P20中葡萄糖的比列在兩親本之間；H15P20中半乳糖的比例較兩親本有所增加，H611P20中的單糖組成更接近親本H1P20，半乳糖比例略下降，甘露糖比例略提高；60%醇沉多糖組分主要含有葡萄糖，雜交菌株H611P60相比兩親本多糖組分中的葡萄糖比例略下降，甘露糖比例提高。雜交菌株多糖組分H15P60、H91P60的葡萄糖、甘露糖比例較兩親本菌株多糖組分H1P60、HCP60均分別略降低和略提高。雜交菌株的60%醇沉糖組分的木糖比例較兩親本菌株均有提高。總體來看，雜交選育的高產(chǎn)多糖菌株發(fā)酵菌絲體多糖組分的單糖組成較親本菌株變化不大。

表4 各醇沉多糖組分的單糖組成Table 4 M onosaccharide com position of ethanol precipitated polysaccharides

2.4 紅外光譜分析

由圖2可見，猴頭菌菌絲體20%、60%醇沉多糖組分在400—4 000 cm-1掃描范圍具有多糖的典型吸收峰。H1P20、HCP20、H15P20、H91P20、H611P20在3 400 cm-1處寬拉伸強(qiáng)峰為糖環(huán)上羥基的振動吸收峰，在2 930 cm-1附近有強(qiáng)的—CH3、—CH2、—CH等C—H伸縮振動吸收峰，在1 657 cm-1附近為結(jié)合水引起的吸收峰或為的伸縮振動峰［11］，3 400 cm-1、2 930 cm-1、1 657 cm-13處吸收峰是多糖化合物的特征吸收［12］。在紅外光譜中1 041 cm-1和1 161 cm-1處有兩個伸縮峰，說明該糖組分含有鍵［13］；H1P60、HCP60、H15P60、H91P60、H611P60除了含有多糖化合物具有的特征吸收峰之外，在1 008—1 161 cm-1之間存在3個峰，這是由于吡喃環(huán)拉伸引起的，由此可以推斷糖環(huán)中存在吡喃糖苷類型［8］。猴頭菌菌絲體20%、60%醇沉多糖組分在1 740 cm-1處均無吸收峰，說明不含有醛酸。雜交菌株糖組分與親本菌株0605相同糖組分的紅外吸收光譜無明顯差異，與親本菌株刺長20%醇沉多糖組分在2 925 cm-1、1 041 cm-1處的吸收值有細(xì)微差異。紅外光譜結(jié)果說明，雜交育種方式?jīng)]有引起猴頭菌多糖基本結(jié)構(gòu)明顯變化。

圖2 猴頭菌20%、60%醇沉多糖組分的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectrum of 20%and 60%ethanol precipitated polysaccharides from m ycelia of Hericium erinaceus

2.5 體外刺激巨噬細(xì)胞釋放NO的活性試驗

如圖3所示，20%醇沉多糖組分體外免疫活性隨著濃度的增大呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，其中雜交菌株H15P20的活性顯著高于其他菌株20%醇沉多糖組分，且呈顯著的濃度依賴性，與陽性對照組相比有明顯優(yōu)勢。60%醇沉組分中H1P60、H2P60、H91P60、H611P60體外刺激RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放NO的量較高，且較低濃度就顯示出了較明顯的刺激巨噬細(xì)胞的活性；而H15P60免疫活性相對較低。這也說明雜交菌株15菌絲體的活性多糖組分在大相對分子質(zhì)量部分；而雜交菌株91和611菌絲體的活性多糖組分在中小相對分子質(zhì)量部分。結(jié)合表5中各糖組分糖含量數(shù)據(jù)可知，H15P20免疫活性較高可能與其菌絲體多糖含量較高有關(guān)，同時與H15P20中含有較高比例的半乳糖和葡萄糖有關(guān)。

圖3 猴頭菌菌絲體20%、60%醇沉多糖對RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放NO的影響Fig.3 Effect of 20%and 60%ethanol precipitated polysaccharides from Hericium erinaceus m ycelium on NO release from RAW 264.7 megalophages

表5 各菌株多糖組分得率與糖含量Table 5 Polysaccharide component yield and sugar content of each strain %

3 討論

猴頭菌是一種珍稀的食藥兩用真菌，傳統(tǒng)應(yīng)用以食療藥用為主，與其相關(guān)的育種研究工作較少。近年來，隨著生活水平的提高，消費者對猴頭菌的關(guān)注度增加，市場需求量逐漸擴(kuò)大。液體發(fā)酵具有周期短、可控性強(qiáng)的特點，但由于猴頭菌菌株退化、原料來源不穩(wěn)定，產(chǎn)品中活性成分含量不高。為提高猴頭菌產(chǎn)品中的活性多糖含量，獲得優(yōu)質(zhì)種源，本課題組前期分別采用傳統(tǒng)雜交育種、原生質(zhì)體融合、ARTP誘變育種技術(shù)選育了具有高產(chǎn)多糖和較高生物活性的優(yōu)勢猴頭菌菌株。

研究發(fā)現(xiàn)，通過ARTP誘變技術(shù)可選育獲得高產(chǎn)多糖的猴頭菌菌株，其發(fā)酵菌絲體生物量和多糖含量較出發(fā)菌株有明顯提升，體外免疫活性顯著增強(qiáng)［14］；分析誘變菌株菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，主要是大分子多糖組分發(fā)生了變化，其活性的提高與大相對分子質(zhì)量多糖組分比例增加、單糖組成中葡聚糖、甘露糖比例增加的結(jié)構(gòu)特征改變有一定的相關(guān)性［15］。本研究所用猴頭菌株為雜交育種篩選得到的高產(chǎn)多糖優(yōu)勢菌株，液體發(fā)酵生物量和菌絲體多糖含量較出發(fā)菌株0605和刺長均有明顯提升，說明篩選得到的雜合菌株集合了親本菌株高生物量和高多糖含量的穩(wěn)定遺傳優(yōu)勢。猴頭菌發(fā)酵菌絲體多糖不同組分結(jié)構(gòu)特征分析表明，雜交菌株多糖相對分子質(zhì)量分布及所占比例與某一親本菌株相近或介于兩親本菌株之間；雜交菌株H15P20中半乳糖的比例較兩親本有所增加，H611P20中的單糖組成更接近親本H1P20且半乳糖比例略下降、甘露糖比例略提高；雜交菌株多糖組分與親本菌株的紅外吸收光譜無明顯差異。ARTP誘變對20%醇沉多糖組分相對分子質(zhì)量分布和單糖組成比例產(chǎn)生的變化可能與育種原理有關(guān)，ARTP誘變可使遺傳物質(zhì)多樣性損傷，引起微生物SOS修復(fù)機(jī)制，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)在分子水平發(fā)生變化［16］。雜交育種屬于自然選育方式之一，自發(fā)突變率低，其高產(chǎn)菌株的代謝產(chǎn)物可能不會發(fā)生根本性變化，但優(yōu)勢菌株會穩(wěn)定表現(xiàn)其兩親本菌株的優(yōu)勢或其中一親本菌株的優(yōu)良遺傳特性。雜交育種未大幅影響或改變控制大相對分子質(zhì)量多糖合成的基因及代謝通路。本研究考察了優(yōu)勢高產(chǎn)多糖雜交菌株和親本菌株發(fā)酵菌絲體各多糖組分對RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放NO的影響，以及雜交育種對多糖體外免疫活性的影響。不同菌株菌絲體20%、60%醇沉多糖組分體外免疫活性表現(xiàn)不同，其中HCP20、H15P20、H1P60、H2P60、H91P60、H611P60體外刺激RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放NO的量較高，推測與其多糖含量及單糖組成中半乳聚糖、甘露聚糖的比例有關(guān)［15］。Bhatia等［17］研究表明，半乳糖高比例對免疫細(xì)胞有刺激作用，在3.0μg·mL-1時，半乳甘露聚糖可增加核因子κB（NF-κB）誘導(dǎo)的熒光素酶在THP-1中的表達(dá)。本研究表明，優(yōu)選的3株高產(chǎn)多糖雜交菌株菌絲體多糖均具有免疫活性，但在活性多糖的相對分子質(zhì)量分布上有差異，未來可根據(jù)實際應(yīng)用進(jìn)行菌株的選擇。

通過以上研究可知，雜交育種對猴頭菌菌絲體多糖相對分子質(zhì)量、單糖組成及多糖基本結(jié)構(gòu)影響較小，對生物量和糖含量影響較明顯。這可能與雜交選育是通過基因自由組合、交換或其他方式產(chǎn)生不同于親本基因的雜交過程有關(guān)［5］。本研究表明，雜交優(yōu)良菌株表現(xiàn)出了穩(wěn)定的綜合遺傳優(yōu)勢，多糖結(jié)構(gòu)特性未發(fā)生明顯改變，但多糖含量大幅提高，活性也得到明顯提升。與誘變育種相比，雜交選育同樣可得到高產(chǎn)多糖的優(yōu)良菌株，且具有較強(qiáng)的方向性和可操作性，并且遺傳穩(wěn)定。不同育種技術(shù)各有其優(yōu)缺點，可針對食用菌實際生產(chǎn)需求采用不同育種手段，為猴頭菌的深加工優(yōu)質(zhì)原料來源和開發(fā)利用提供優(yōu)良種源。