張紅梅，翟 文，金海軍**，丁小濤，余紀(jì)柱

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所，上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201403；2東華理工大學(xué)化學(xué)生物與材料科學(xué)學(xué)院，南昌330013）

黃瓜（Cucumis sativus L.）是世界上重要的蔬菜作物之一，也是遺傳研究的一個(gè)模式植物［1］。近年來(lái)，由于栽培品種遺傳背景逐漸狹窄，品種間的遺傳多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同屬的甜瓜［2］。利用多態(tài)性豐富的種質(zhì)資源，拓展黃瓜作物的遺傳多樣性對(duì)黃瓜遺傳育種及生產(chǎn)有著十分重要的意義。傳統(tǒng)的育種方法很難滿足黃瓜遺傳改良發(fā)展的需求，目前分子標(biāo)記是進(jìn)行黃瓜種質(zhì)遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析的有效工具［3］。RAPD、AFLP、SSR［4-6］等現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在黃瓜遺傳育種中得到了應(yīng)用。核心種質(zhì)庫(kù)能夠以最小的種質(zhì)資源數(shù)目，最大程度地代表資源總體的遺傳變異，可大幅減少資源研究的人力和物力，是研究物種遺傳多樣性和人工馴化的理想材料［7-8］。構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)的方法有聚類法、抽樣法、最大化法（Maximum strategy，M策略）等［5］。M策略能夠最大限度地保留等位基因數(shù)目，即選擇具有高豐度等位基因且低遺傳冗余的材料［9-10］。采用M策略預(yù)測(cè)核心種質(zhì)的最佳抽樣比例，目前已在水稻［11］、蘋果［9］、咖啡［10］等作物中廣泛應(yīng)用。

基于全基因組重測(cè)序開發(fā)的InDel（Insertion-deletion）插入缺失標(biāo)記與其他標(biāo)記反映的基因組信息不同，具有分布廣、多態(tài)性強(qiáng)、密度高、變異穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)［12］，在黃瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的評(píng)價(jià)［13］、品種純度［14］、親緣關(guān)系鑒定［13］、核心種質(zhì)資源構(gòu)建［15］、遺傳圖譜的構(gòu)建、苦味［16］和白粉?。?7］等重要性狀定位以及分子育種上都有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究擬應(yīng)用分布于黃瓜7條染色體上的InDel標(biāo)記，在23份有代表性的黃瓜種質(zhì)中分析其遺傳多樣性，結(jié)合表型特點(diǎn)構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)，以期為黃瓜種質(zhì)資源的鑒定和利用提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 供試材料

挑選23份不同地理來(lái)源的黃瓜自交系種質(zhì)為研究材料，其中有13個(gè)來(lái)自亞洲（日本、韓國(guó)和中國(guó)），8個(gè)來(lái)自歐洲、2個(gè)（加工型黃瓜）來(lái)自美國(guó)，其性狀特點(diǎn)如表1所示。所有材料均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所收集。

表1 23個(gè)黃瓜種質(zhì)的性狀特點(diǎn)Table1 Morphological characteristics of 23 cucumber germplasms

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 23個(gè)黃瓜種質(zhì)的表型性狀鑒定

2016年2月26日，將23個(gè)黃瓜種質(zhì)各分別播種30個(gè)單株，在苗期調(diào)查白粉病和霜霉病的病情指數(shù)，在結(jié)果期調(diào)查商品瓜的瓜形、瓜長(zhǎng)、瓜直徑、瓜色、瓜刺顏色，測(cè)量結(jié)果取平均值。白粉病和霜霉病發(fā)病率的調(diào)查方法是分別用含量為1×105個(gè)/mL和5 000—7 000個(gè)/mL的懸浮孢子液，在濕度80%、白天26℃/夜晚18℃環(huán)境下分別接種黃瓜幼苗葉片，將發(fā)病級(jí)別分為0—5級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)［18-19］。

1.2.2 InDel標(biāo)記分析

在黃瓜生長(zhǎng)的幼苗期取葉片，混合取樣。試驗(yàn)材料基因組DNA提取采用CTAB法［20］。PCR反應(yīng)體系為20μL，其中DNA模板50 ng，10×Buffer 2μL，Mg2+1.25 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上游引物（10μmol/L）0.5μL，下游引物0.4μmol/L，Taq酶1.2 U，ddH2O補(bǔ)足至20μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，33個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃保存。使用8%（W/V）聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電壓150 V，電泳時(shí)間45 min。銀染顯色后照相保存。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用NTSYS-pc2.1軟件中的SAHN程序計(jì)算相似性系數(shù)，用UPGMA方法繪制聚類圖，主成分分析應(yīng)用軟件中的Decenter和Eigen模塊并繪圖，應(yīng)用Structure 2.3.4軟件［21］進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，混合模型群體數(shù)目（K值）設(shè)置為2—8，對(duì)每個(gè)K值對(duì)應(yīng)的Var［ln P（D）］值的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算，MCMC（Markov Chain Monte Carlo）設(shè)置10萬(wàn)次迭代，初始burn-in次數(shù)為10萬(wàn)，基于數(shù)學(xué)模型確定群體分組，并計(jì)算個(gè)體相應(yīng)的Q值。應(yīng)用Mstrat軟件［22］，用M（M method）和R（Random）兩種方法預(yù)測(cè)核心種質(zhì)最佳樣本，設(shè)置參數(shù)為20次重復(fù)（Replicates），每次重復(fù)20次迭代次數(shù)（Maximum iterations），每次遞增1個(gè)樣本（Step）數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 InDel分子標(biāo)記

挑選均勻分布于基因組的93對(duì)InDel引物［22］，對(duì)23份有代表性的黃瓜種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，篩選到66對(duì)InDel引物（表2）有多態(tài)性且有較清晰的目標(biāo)產(chǎn)物，多態(tài)性比率為71%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，這66對(duì)引物共獲得121個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，說(shuō)明這批InDel標(biāo)記基因組的覆蓋度高，而且多態(tài)性強(qiáng)，能夠較好地應(yīng)用于黃瓜遺傳多樣性分析。

表2 InDel標(biāo)記在黃瓜基因組中的分布Table 2 Distribution of InDelmarkers in cucumber genome

2.2 23份黃瓜種質(zhì)的遺傳多樣性分析

對(duì)23份黃瓜種質(zhì)的遺傳相似性系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，相似性系數(shù)在0.23—0.95，平均值為0.56，主要分布在0.3—0.4區(qū)間和0.7—0.8區(qū)間內(nèi)，分別占總數(shù)的24.1%和24.9%。遺傳相似性系數(shù)低于0.6的有137對(duì)組合，占全部組合的比率是54%，說(shuō)明這些材料的遺傳多樣性較好。

將23份黃瓜種質(zhì)進(jìn)行聚類分析表明（圖1），在遺傳相似性系數(shù)0.61處，23份材料分為三大類群，P1有12個(gè)種質(zhì)，主要來(lái)源于亞洲，包括北京、上海、遼寧、日本和韓國(guó)；P2有10個(gè)種質(zhì)，大多來(lái)自歐洲，還包含美國(guó)加工型黃瓜；來(lái)源于廣東的14號(hào)種質(zhì)被單獨(dú)地分到P3，是來(lái)自南方的種質(zhì)，商品瓜表現(xiàn)為短棒形、白刺、抗白粉病和霜霉病。

應(yīng)用主成分分析方法（PCA）對(duì)23個(gè)黃瓜種質(zhì)的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，第一、第二主成分貢獻(xiàn)率分別為41%和35%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為75%，能反應(yīng)23個(gè)變量的主要信息。繪制PCA的2D聚類圖可以看出，P1與P2、P3被明顯地分開，說(shuō)明它們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。P1中來(lái)源于亞洲的材料遺傳多樣性較豐富，如7號(hào)、8號(hào)來(lái)自上海的種質(zhì)與這個(gè)亞群中其他種質(zhì)遺傳差異較大（圖2）。P3的親緣關(guān)系在P1和P2之間，更接近P1（圖2）。

圖1 23份黃瓜種質(zhì)的UPGMA聚類分析Fig.1 UPGMA cluster analysis of 23 cucumber germp lasm s

圖2 23份黃瓜種質(zhì)的PCA分析Fig.2 PCA analysis of 23 cucumber germ p lasm s

遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示：K值為3時(shí)得到最佳分組。如圖3所示，該結(jié)果與聚類和主成分分析得到的結(jié)果一致，P3遺傳結(jié)構(gòu)中有42.9%的遺傳成分與P1相似，P2（歐美種質(zhì)）和P1（亞洲種質(zhì)）這兩個(gè)亞群之間遺傳差異明顯，基因交流較少?？偟膩?lái)說(shuō)，3個(gè)遺傳多樣性分類分析方法的結(jié)果大致相同。

圖3 23份黃瓜種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)分析的3個(gè)亞群Fig.3 Three subgroups of genetic structure analysis of 23 cucumber germplasms

2.3 基于M 策略構(gòu)建黃瓜核心種質(zhì)資源庫(kù)

利用InDel標(biāo)記分析的結(jié)果，對(duì)核心種質(zhì)最佳樣本量進(jìn)行預(yù)測(cè)，并構(gòu)建黃瓜的核心種質(zhì)庫(kù)。將23份黃瓜種質(zhì)的基因數(shù)據(jù)輸入Mstrat軟件，先模擬核心種質(zhì)庫(kù)不同取樣大小時(shí)等位基因的覆蓋度。如圖4所示，M方法和R方法分析得到結(jié)果基本一致，當(dāng)取樣群體為1—5時(shí)，所包含的等位基因數(shù)呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，到5時(shí)即可涵蓋約230個(gè)基因，為黃瓜遺傳變異的87%；此后增幅減緩，并在取樣量為9時(shí)接近閾值，因此將核心種質(zhì)庫(kù)的群體大小確定為9。建庫(kù)過(guò)程重復(fù)20次，將各種質(zhì)資源按在上述模擬結(jié)果中出現(xiàn)的次數(shù)排序，選取出現(xiàn)次數(shù)較多的9份種質(zhì)構(gòu)成黃瓜核心種質(zhì)庫(kù)，包含材料編號(hào)為2、14、3、6、7、17、22、9、13。

圖4 黃瓜核心種質(zhì)庫(kù)大小模擬Fig.4 Simulating the size of cucumber core germplasm bank

3 結(jié)論與討論

針對(duì)黃瓜栽培種遺傳基礎(chǔ)狹窄、遺傳多樣性較低等問(wèn)題，目前較為有效的方法是利用分子標(biāo)記進(jìn)行種質(zhì)資源的遺傳分析。王佳等［23］利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行了多態(tài)性檢測(cè)，雖不能按照生態(tài)型將現(xiàn)有黃瓜種質(zhì)資源完全聚類，但總體而言，可以將其分為雌性型和普通型兩大類。李錫香等［24］利用RAPD技術(shù)對(duì)黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行了鑒定與分類，聚類分析結(jié)果能將不同來(lái)源國(guó)的種質(zhì)較好地區(qū)分，但并不能很好地區(qū)分中國(guó)種質(zhì)來(lái)源地不同的生態(tài)類型。李翔等［25］利用EST-SSR標(biāo)記對(duì)39份云南地方黃瓜材料進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)云南地方黃瓜種質(zhì)資源多樣性較豐富，聚類分析和主坐標(biāo)分析所獲結(jié)果基本一致，為云南黃瓜種質(zhì)資源保存與利用提供了依據(jù)。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，InDel標(biāo)記作為一種高通量遺傳標(biāo)記，具有分布廣、重復(fù)性好、檢測(cè)方便、呈共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于植物遺傳多樣性分析、高密度遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、種子純度鑒定和分子標(biāo)記輔助育種等研究領(lǐng)域［5］。在水稻遺傳育種中，相比于RAPD、RFLP等傳統(tǒng)分子標(biāo)記，InDel標(biāo)記技術(shù)在水稻秈粳屬性鑒定中準(zhǔn)確率高，且快捷簡(jiǎn)便［26］。張圣平等［16］研究獲得的InDel標(biāo)記與Bt緊密相連，遺傳距離為0.8 cM，可應(yīng)用于黃瓜果實(shí)無(wú)苦味MAS育種。蘭青闊等［14］基于InDel標(biāo)記用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)種子純度進(jìn)行了鑒定，提高了鑒定的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，并且更加高通量和自動(dòng)化。本研究應(yīng)用基于黃瓜重測(cè)序開發(fā)的InDel標(biāo)記，分析了23份黃瓜種質(zhì)的遺傳多樣性，UPGMA進(jìn)化樹聚類方法、主成分分析和群體遺傳分析結(jié)果大致相同，將其分為三大類群。P1來(lái)源于亞洲，都是華南類型黃瓜。P2來(lái)源于歐洲和美國(guó)，大部分屬于歐洲類型黃瓜，包含歐洲長(zhǎng)黃瓜和歐洲短黃瓜，但22號(hào)和23號(hào)是兩個(gè)加工型黃瓜，從表型看應(yīng)屬于華南類型，但從親緣關(guān)系上與歐洲類型更為接近，說(shuō)明其遺傳背景具有歐洲類型黃瓜基因。P3包含1個(gè)來(lái)源于廣東的種質(zhì)，從表型看屬于華南類型，從親緣關(guān)系看更接近P1，但與P1的親緣關(guān)系有一定的差距，說(shuō)明其遺傳基礎(chǔ)比較豐富，遺傳背景復(fù)雜。P1和P2分別屬于華南類型和歐洲類型，所以遺傳差異明顯。研究結(jié)果很好地反映了黃瓜種質(zhì)間的形態(tài)相似性和地理區(qū)域的差異。

核心種質(zhì)是以最少的種質(zhì)樣品來(lái)最大程度地代表一個(gè)物種種質(zhì)資源的遺傳多樣性，以方便種質(zhì)資源的保存、管理及進(jìn)一步的評(píng)價(jià)、利用。為了能夠獲得黃瓜核心種質(zhì)的樣本量，研究者利用多種方法來(lái)構(gòu)建核心種質(zhì)資源庫(kù)。郭大龍等［27］應(yīng)用M策略、遺傳距離法和Core hunter法構(gòu)建葡萄的核心種質(zhì)資源，M策略構(gòu)建的核心種質(zhì)能保留核心種質(zhì)全部的等位基因。鄧學(xué)斌等［28］應(yīng)用5種不同的方法（Mstrat、Random、REMC、SBS和SFS）構(gòu)建了番茄10種初始核心種質(zhì)資源，發(fā)現(xiàn)Mstrat是構(gòu)建加工番茄亞群核心種質(zhì)的最佳方法。Random隨機(jī)抽樣法得到的核心種質(zhì)雖能有效保留原始種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)，但等位基因代表性較差［29］；REMC、SBS和SFS方法雖可100%覆蓋等位基因，但其核心群體結(jié)構(gòu)代表性卻較差［30-31］。采用Mstrat方法構(gòu)建遺傳背景狹窄的加工番茄亞群的核心種質(zhì)，兼顧了群體結(jié)構(gòu)和等位基因覆蓋度［11］。本研究利用InDel標(biāo)記分析的結(jié)果，應(yīng)用M策略將9份黃瓜種質(zhì)確定為核心種質(zhì)，能夠最大程度地覆蓋群體的等位基因。除此之外，進(jìn)行核心種質(zhì)構(gòu)建時(shí)也加入了表型數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)，各種質(zhì)在表型上的多樣性也是建庫(kù)質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，這9份核心種質(zhì)包含了華南類型和歐洲類型，白刺、褐刺以及光滑無(wú)刺型，歐洲類型長(zhǎng)黃瓜、歐洲類型短黃瓜以及加工黃瓜等，所以本研究構(gòu)建的9份核心種質(zhì)能夠很大范圍地覆蓋基因型和表型的變異。本研究所使用的試驗(yàn)材料是經(jīng)過(guò)多代純化形成的遺傳多樣性豐富和遺傳穩(wěn)定的黃瓜自交系，更有利于核心種質(zhì)在科研和育種中的直接利用。