吳 思，孫崢嶸

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院生物樣本庫，沈陽 110004)

宮頸癌位居全球女性癌癥相關(guān)死亡誘因的第四位，也是發(fā)展中國家第二大常見癌癥[1-2]。臨床及流行病學相關(guān)研究表明，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)有關(guān)，以HPV16亞型最常見，約50%的宮頸癌前病變與HPV16相關(guān)[3]。目前，尚無有效的宮頸癌治療手段，因此，對宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機制的進一步研究十分重要。持續(xù)感染高危型HPV16會導致一系列癌前病變，最終導致宮頸癌發(fā)生。HPV16通過調(diào)控宿主細胞基因組的遺傳和表觀遺傳影響宿主細胞的正常生理狀況，進而誘發(fā)癌變[4]。部分女性接觸高危型HPV16后，僅成為HPV攜帶者，表現(xiàn)為一過性感染，而不發(fā)展為宮頸癌。因此，不能將HPV16全基因組DNA檢測作為臨床診斷宮頸癌的檢測指標，需要繼續(xù)尋找特異性更高的檢測指標[5]。

DNA甲基化是修飾DNA的一種方式，不改變基因組DNA，僅改變表觀遺傳表現(xiàn)，是細胞維持基因穩(wěn)定和調(diào)節(jié)基因表達的主要因素[6]。宮頸癌等疾病患者的癌細胞DNA甲基化發(fā)生異常改變，表明DNA甲基化可能與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[7-9]?，F(xiàn)對HPV16 DNA甲基化對宮頸癌發(fā)生發(fā)展的影響予以綜述，探討其潛在分子機制及遺傳學改變，旨對宮頸癌預防及治療提供新的思路。

1 HPV16 DNA甲基化與宮頸上皮內(nèi)瘤變

HPV、乙型肝炎病毒等腫瘤相關(guān)DNA病毒的DNA甲基化與病毒基因表達、免疫應答以及致腫瘤性等病毒生物學行為相關(guān)[10-11]。與真核細胞DNA甲基化作用類似，病毒DNA甲基化可調(diào)控病毒復制及轉(zhuǎn)錄，進而影響病毒的遺傳表現(xiàn)。DNA甲基化指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，胞嘧啶環(huán)的第5位加入一個甲基基團，從而形成5-甲基胞嘧啶的過程。5-甲基胞嘧啶主要位于緊鄰鳥嘌呤上游的DNA序列中，可形成甲基化CpG二核苷酸。當宮頸組織細胞發(fā)生瘤變時，細胞基因組甲基化模式紊亂，表現(xiàn)出全部或特定基因組甲基化的改變，其中，CpG位點的DNA甲基化主要影響基因的表達。研究表明，DNA甲基化與細胞異常增生有關(guān)，可導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且CpG的甲基化水平可作為定量分類器準確區(qū)分重度宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸原位癌[12]。HPV基因組中沒有經(jīng)典的CpG位點，但存在高密度CpG區(qū)域，且特定的高甲基化E1 CpG可能增加了HPV16陽性重度宮頸上皮內(nèi)瘤變進展為宮頸原位癌的可能性，可見HPV不同區(qū)域CpG位點的甲基化具有重要的生物學意義[13]。 HPV可利用宿主細胞器進行轉(zhuǎn)錄和復制，其生命周期與宿主細胞的分化密切相關(guān)。在W12E細胞系中進行的HPV16基因組的CpG甲基化分析表現(xiàn)出一種新的甲基化模式，即E2反應性轉(zhuǎn)錄模板中的CpG二核苷酸的全部胞嘧啶甲基化或E2蛋白結(jié)合位點中的CpG二核苷酸的特異性胞嘧啶甲基化，且此模式的甲基化可以抑制HPV16 E2蛋白的轉(zhuǎn)錄激活[14]。研究認為，病毒可能利用宿主細胞某種保護性機制使病毒逃避宿主免疫的識別，并維持感染，此機制包括宿主將正鏈病毒DNA作為異源DNA，并通過靶向病毒DNA的外部修飾抑制基因轉(zhuǎn)錄，或病毒可能通過恢復人甲基轉(zhuǎn)移酶的外部修飾和(或)組蛋白去乙酰酶對染色質(zhì)的重塑而策略性地調(diào)控病毒自身基因表達[4]。病毒整合廢除了抑制致癌基因E6和E7表達的E2基因，導致感染上皮細胞的廣泛增殖和惡性轉(zhuǎn)化。宮頸癌E6和E7區(qū)域中免疫刺激性CpG基序內(nèi)的病毒DNA甲基化的過度表達提示，HPV16在此類CpG基序的宮頸癌發(fā)病機制中起免疫逃避作用[15]。采用焦磷酸測序法測量HPV DNA甲基化的研究表明，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33和HPV45的L1/L2區(qū)域基因的高甲基化與宮頸癌發(fā)生相關(guān)[16]。HPV基因組中，高水平CpG甲基化與宮頸癌前病變相關(guān)，尤其是HPV衣殼L1和L2基因中的甲基化水平[17]。Chaiwongkot等[18]的研究證明，HPV可誘導轉(zhuǎn)化感染過程中的L1基因的甲基化，并可作為預測宮頸癌快速進展的潛在生物標志物。

流行病學和臨床研究中的HPV甲基化主要集中在HPV16型。HPV16基因結(jié)構(gòu)是雙鏈環(huán)狀DNA，長度約為8 000 bp，分子量為5×106，包含長調(diào)控區(qū)(long control region，LCR)、早期區(qū)(E1、E2、E4、E5、E6、E7區(qū))和晚期區(qū)(L1、L2區(qū))。LCR是病毒的主要調(diào)控區(qū)，有多個調(diào)控元件(如啟動子、增強子及多種細胞轉(zhuǎn)錄因子)的結(jié)合位點，可對病毒基因的復制、轉(zhuǎn)錄進行調(diào)節(jié)，見圖1。既往研究顯示，HPV16型LCR的甲基化程度與宮頸上皮內(nèi)瘤變2/3的發(fā)生風險增加相關(guān)，但目前相關(guān)研究結(jié)果仍不一致[19-25]。有研究證明，感染HPV16受試者基因的甲基化程度可隨宮頸組織病理分級的升高而增加，并經(jīng)常觀察到浸潤性宮頸癌患者宮頸病變組織的高甲基化，表明基因高甲基化可能降低蛋白質(zhì)的表達，并參與宮頸癌的發(fā)生[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者存在最高比例的LCR CpG甲基化，無癥狀感染HPV者的甲基化水平次之，宮頸上皮內(nèi)瘤變患者LCR的甲基化比例最低[21]。Mirabello等[22]通過評估HPV16 L1基因的焦磷酸測序和特定CpG的甲基化水平發(fā)現(xiàn)，甲基化水平升高可增加HPV16陽性人群發(fā)生宮頸癌的風險。但也有研究認為，隨著宮頸病變的進展，LCR CpG甲基化的比例呈下降趨勢；或LCR或LCR中E2結(jié)合位點的CpG甲基化程度與宮頸病變嚴重程度呈負相關(guān)[23]。上述研究觀察結(jié)果不一致的原因尚未完全明確，可能與甲基化檢測技術(shù)(通常不足以檢測低豐度的DNA甲基化)的差異和/或樣本量較小有關(guān)。

LCR：長調(diào)控區(qū)；5′LCR：長調(diào)控區(qū)基因5′端；Central：中央?yún)^(qū)；3′LCR：長調(diào)控區(qū)基因3′端；Enhancer：增強子；Promoter：啟動子；Repl Orig：復制起始點

圖1 HPV16基因組LCR區(qū)15個CpG位點圖

2 HPV16 DNA甲基化與病毒轉(zhuǎn)錄的相關(guān)性

甲基化相關(guān)的HPV16轉(zhuǎn)錄沉默的數(shù)據(jù)主要來源于體外研究。研究顯示，HPV16 LCR的CpG二核苷酸在SiHa細胞中處于非甲基化狀態(tài)，但在被轉(zhuǎn)錄激活的僅有一個或極少數(shù)拷貝HPV16基因組的CaSki細胞中的甲基化程度很高[26]。與SiHa細胞(1～2拷貝/細胞)相比，CaSki細胞中存在超量的HPV16基因組(>500 拷貝/細胞)，兩種細胞系的E6/E7轉(zhuǎn)錄本數(shù)量類似。E6/E7致癌基因的轉(zhuǎn)錄主要受不同細胞轉(zhuǎn)錄因子與位于HPV16基因組LCR轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的結(jié)合和相互作用的調(diào)節(jié)[27]。有研究顯示，位于增強子fp5e結(jié)合位點或啟動子HpaⅡ結(jié)合位點的CpG二核苷酸的甲基化作用能夠阻止功能性轉(zhuǎn)錄復合物的形成[28-29]。研究發(fā)現(xiàn)，某些核蛋白可與轉(zhuǎn)錄激活因子競爭位于LCR fp5e和Hpa Ⅱ以外的甲基化CpGs位點，并通過HDAC實現(xiàn)甲基化相關(guān)修復作用誘導更緊密的染色體構(gòu)型，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制[29-30]。此外，HPV16中的E2蛋白可與其LCR同源結(jié)合位點構(gòu)成調(diào)節(jié)環(huán)，并根據(jù)調(diào)節(jié)環(huán)的不同位點激活或抑制早期基因的轉(zhuǎn)錄[31]。體外研究發(fā)現(xiàn)，增強子內(nèi)以E2為主以及異源輸入的E6/E7病毒蛋白能夠誘導顯著的再甲基化，并在一定程度上導致啟動子區(qū)域自身的甲基化或與染色體閉合相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制[29]。

通過LCR中CpG的甲基化模式可更好地反映基因沉默情況。但關(guān)于HPV16自然感染CpG甲基化對病毒基因轉(zhuǎn)錄影響的報道較少。Park等[32]對9例口腔鱗狀細胞癌患者的RNA標本進行研究證實，HPV16基因組中LCR的超甲基化與可檢測到的E6/E7表達水平相關(guān)。此外，其他小樣本研究也得到了類似的結(jié)論[33-34]。Vinokurova和von Knebel Doeberitz[35]對HPV16感染宮頸組織樣本的微分裂細胞甲基化的分析證明，來自損傷或轉(zhuǎn)化細胞的HPV16基因組任何位置的甲基化均與鱗狀上皮分化的各階段相關(guān)。由此可見，廣泛病毒基因的甲基化可以阻止病毒基因的表達，使細胞中的病毒基因組處于非激活狀態(tài)，且不引發(fā)任何病理效應?；谝延凶C據(jù)的內(nèi)在聯(lián)系推測，HPV16基因組甲基化可能是早期病毒致瘤基因參與宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)展的敏感指標。明確CpG甲基化與自然感染狀態(tài)下HPV16轉(zhuǎn)錄的關(guān)系，將有助于更好地了解HPV相關(guān)宮頸病變的發(fā)生機制。

3 HPV16 DNA甲基化與病毒載量的相關(guān)性

HPV載量反映了病毒的活躍程度，病毒載量和DNA甲基化均為HPV感染后宮頸鱗狀細胞癌發(fā)生過程的特異性分子事件。目前研究的含HPV16的宮頸癌細胞系有SiHa細胞和CaSki細胞，前者細胞中僅含有2個具有轉(zhuǎn)錄活性的病毒基因拷貝，而后者細胞中含有較多的病毒基因拷貝，但僅有1個整合于14號染色體的拷貝具有轉(zhuǎn)錄活性。細胞學實驗證實，HPV16基因拷貝數(shù)與甲基化水平相關(guān)，HPV16基因拷貝的CaSki細胞中啟動子和增強子的CpG位點甲基化水平明顯高于SiHa細胞，且CaSki細胞中多余的沉默拷貝可在5-氮雜胞嘧啶核苷的作用下重新獲得轉(zhuǎn)錄活性[36-38]。除影響細胞啟動子和增強子甲基化外，還可通過調(diào)節(jié)E2、E6/E7的甲基化水平調(diào)控病毒的復制和轉(zhuǎn)錄，使細胞表現(xiàn)出穩(wěn)定的基因型，可見HPV16的表達可能取決于病毒啟動子、增強子和E2基因的甲基化狀態(tài)[34]。既往研究也證明，由HPV16感染引起的宮頸病變中的E2區(qū)域也會發(fā)生不同程度的甲基化，其中癌細胞E2區(qū)域甲基化的程度最高，但其在宮頸癌前病變細胞與正常宮頸細胞的甲基化水平的差異不大，故E2基因甲基化水平可用來區(qū)分正常細胞、癌前病變細胞與宮頸癌細胞[21]。在組織學實驗中，Mirabello等[22]采用實時定量聚合酶鏈反應檢測237例 HPV感染者的HPV16載量，并采用焦磷酸測序法定量檢測HPV16 L1區(qū)和LCR 66個位點的甲基化水平，未發(fā)現(xiàn)病毒載量與甲基化之間的相關(guān)性。已知HeLa細胞和C4-Ⅰ細胞是HPV18型宮頸癌的主要細胞系，其中HeLa細胞為宮頸腺癌細胞系，含有較多的HPV18基因拷貝，其含量約為50個，而C4-Ⅰ細胞中整合的HPV18基因拷貝含量極少[39]。與HPV16感染不同，感染HPV18的HeLa和C4-Ⅰ細胞中的HPV18 DNA啟動子和增強子區(qū)域均為低甲基化，但在HeLa細胞HPV18 L1區(qū)的甲基化水平顯著高于C4-Ⅰ細胞。通過對宮頸脫落細胞HPV-18 L1基因進行甲基化特異性聚合酶鏈反應定量檢測的實驗研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者HPV-18 L1基因始終處于高甲基化狀態(tài)，但無癥狀患者的HPV-18 L1基因常為低甲基化或未甲基化狀態(tài)。在宮頸癌前病變中，L1偶發(fā)高甲基化，且疾病嚴重程度與L1高甲基化程度相關(guān)[39]。此結(jié)果在組織學實驗中也得到了證實，對HPV18感染的宮頸癌組織標本和無癥狀感染者的宮頸組織標本進行L1/L2片段甲基化水平檢測發(fā)現(xiàn)，80%的癌組織標本的L1區(qū)存在甲基化，且明顯高于無癥狀感染組；病毒整合后，L1區(qū)甲基化可促使其余HPV18基因拷貝喪失活性[40-41]。綜上所述，L1基因甲基化可作為篩查HPV18感染所致宮頸病變的指標。HPV16和HPV18是宮頸癌的常見病毒感染類型，兩者LCR的轉(zhuǎn)錄元件和轉(zhuǎn)錄因子相同。大量研究發(fā)現(xiàn)，HPV16和HPV18的DNA甲基化模式不同，其甲基化模式可調(diào)節(jié)病毒表達，并在病毒整合過程中發(fā)揮重要作用[13,22,39]。HPV的DNA甲基化及病毒載量可能存在一定關(guān)聯(lián)，但其生物學意義的關(guān)聯(lián)尚不清楚。

4 結(jié) 語

目前，尚無準確快捷的HPV感染檢測方法。HPV DNA檢測的敏感性很高，但診斷宮頸癌的特異性較巴氏涂片檢測低。與液基薄層細胞學檢測技術(shù)相比，HPV檢測的假陽性率較高。高危HPV DNA重復篩選獲得了較高的宮頸癌診斷敏感性和特異性，但隨訪費用較高，不易廣泛使用。近年來，已明確了HPV DNA甲基化修飾在宮頸癌發(fā)生中的重要作用。HPV DNA甲基化檢測可能成為具有潛在應用價值的區(qū)分感染結(jié)局的生物標志物，有助于探索病毒基因組和生命周期以及與宿主的相互作用，更全面地了解HPV感染導致的疾病過程、更準確地檢測臨床癌前病變、更個性化地識別和管理具有真正進行性致癌潛力的病變。HPV DNA甲基化檢測不僅可以豐富其他生物標志物的早期診斷和預后評估標志，提高臨床檢測的敏感性和特異性，還可改善宮頸癌放療和化療的敏感性，為新藥開發(fā)提供幫助。