王雪松，張鴻偉,，張曉梅,林黎明,徐杰*,薛長湖

(1. 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 青島 266003； 2. 青島海關(guān)檢驗檢疫技術(shù)中心， 青島 266000)

仿刺參(ApostichopusJaponicus)自古以來名列“海八珍”之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值及營養(yǎng)價值[1]。磷脂(phospholipid，PL)是仿刺參脂質(zhì)組成的重要成分之一，可分為甘油磷脂與鞘磷脂，其基本骨架分別為甘油和鞘氨醇。甘油磷脂是一種兩性分子，一端為親水性的含氮或含磷的頭基，另一端為疏水(親油)性的長烴基鏈[2]。盡管仿刺參中磷脂相對于蛋白質(zhì)是低含量組分，但其對人體的營養(yǎng)價值仍十分可觀[1]。仿刺參磷脂中富含長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)，如二十碳五烯酸(C20:5 n-3，EPA)和二十二碳六烯酸(C22:6 n-3，DHA)，而膳食PUFA中n-3/n-6比例的增加具有降低血漿脂質(zhì)濃度[3]，預(yù)防心血管疾病[4]，并降低患癌癥風(fēng)險的作用[5]。

中國仿刺參主要產(chǎn)自遼寧、山東和福建等地。市場上大連仿刺參的價格相對而言較高，相應(yīng)地也出現(xiàn)了以異地海參冒充遼參高價出售的現(xiàn)象。為了防止少數(shù)商家進(jìn)行不正當(dāng)牟利，從而保護(hù)消費者的合法權(quán)益，保證水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的平穩(wěn)高速發(fā)展，有必要開展仿刺參的產(chǎn)地溯源研究。目前常見的水產(chǎn)品溯源技術(shù)主要是根據(jù)穩(wěn)定同位素比率、元素分布和生物分子(DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì))等信息對產(chǎn)地進(jìn)行鑒別[6-8]。已有研究利用海參中游離脂肪酸含量差異，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)實現(xiàn)產(chǎn)地溯源[6]，但需要對脂肪酸進(jìn)行衍生化，操作復(fù)雜且耗時較長，此外，氣相色譜難以檢測不易揮發(fā)的脂質(zhì)，具有一定局限性，因此，開發(fā)快速、高通量的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法將使其具有更好的應(yīng)用潛力。研究表明，作為重要生物活性脂質(zhì)，磷脂的一系列變化反映了生物體內(nèi)代謝的變化，且海產(chǎn)品的磷脂組成會隨生長的環(huán)境等條件的不同而變化[9-10]。研究不同產(chǎn)地仿刺參磷脂輪廓的差異，不僅能夠為產(chǎn)地溯源和營養(yǎng)學(xué)評價提供數(shù)據(jù)支持，還可為研究外界環(huán)境變化對仿刺參代謝的影響提供思路和方法學(xué)依據(jù)。

本研究旨在利用UHPLC-ESI-TOF-HRMS技術(shù)高靈敏度、高分辨率和高通量的特點，采用脂質(zhì)組學(xué)分析策略對來自3個產(chǎn)地仿刺參的磷脂分子組成、相對含量進(jìn)行測定，并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對獲取的磷脂組數(shù)據(jù)進(jìn)行信息挖掘，分析確定產(chǎn)地差異分子標(biāo)志物，在磷脂分子種水平探討仿刺參產(chǎn)地鑒別分析的可行性，并進(jìn)一步為其營養(yǎng)學(xué)評價和代謝組學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

于2018年11月分別自大連、膠南及威海3個不同產(chǎn)地(下文分別簡寫為DL、JN及WH)的當(dāng)?shù)厮a(chǎn)品市場購買新鮮仿刺參樣本(體長約25 cm)，去除內(nèi)臟后液氮冷凍，置于-80 ℃暫存。每種仿刺參分別取5個完整個體，冷凍干燥后用高速研磨儀(IKA A11basic，德國)于液氮浴中研碎成粉末，保存于50 mL旋蓋離心管中，-20 ℃凍存，分析待用。

磷脂提取所用三氯甲烷、甲醇和異丙醇均為分析純試劑，購自國藥(上海)集團(tuán)。流動相所用甲醇、乙腈和異丙醇均為質(zhì)譜級試劑，購自美國Merck公司。超純水采用Milli-Q Gradent系統(tǒng)制備(18.2 MΩ·cm)。甲酸和甲酸銨購自美國Sigma-Aldrich公司。溶血磷脂酰膽堿(lysophosphocholine，LPC)、磷脂酰膽堿(phosphocholine，PC)、溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphoethanolamine，LPE)、磷脂酰乙醇胺(phosphoethanolamine，PE)、磷脂酰甘油(phosphoglycerols，PG)及磷脂酰肌醇(phosphoinositols，PI)的標(biāo)準(zhǔn)品，純度均>99.1%，購自Avanti Polar Lipids公司(Alabaster，USA)。

1.2 實驗儀器

主要儀器包括：ShimadzuNexeraX230A超高效液相色譜儀(島津公司，日本)；Triple TOF 5600+四級桿/飛行時間質(zhì)譜伙(AB Sciex美國)，配有復(fù)合DuoSpray離子源，應(yīng)用軟件為AnalystTF(版本1.7)；DUC-1C氮吹儀(TAITEX公司，日本)；ABS35-S精密分析天平(梅特勒-托利多公司，瑞士)；CR22GⅡ高速冷凍離心機(HATACHI公司，日本)；A11basic高速研磨儀(IKA公司，德國)。

1.3實驗方法

1.3.1 樣品前處理

采用改良型Folch法[11]進(jìn)行磷脂提取。取制備好的仿刺參粉末0.1 g，使用6 mL氯仿/甲醇(2∶1，V/V)振蕩提取10 min，加入2 mL超純水，渦旋20 s，5 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上層至新離心管中(下層氯仿層留置待合并)。向新離心管中加入4 mL氯仿渦旋20 s，靜置5 min，重復(fù)提取2次，合并所有氯仿層提取液，氮氣吹干溶劑，并復(fù)溶于1 mL的異丙醇/乙腈/水(2∶1∶1，V/V)中，經(jīng)過0.22 μm有機濾膜過濾后于-20 ℃儲存，備用。上樣前超聲30 s。

1.3.2 儀器參數(shù)

色譜條件：Nexera超高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)；C18柱(50.0 mm × 2.1 mm，1.7 μm，美國ThermoFisher公司)。流動相A為甲醇/水(65∶35，V/V)，流動相B為甲醇/乙腈(20∶80，V/V)，A、B相均含1 mmol/L甲酸銨。采用梯度洗脫：0～15.0 min，100% A；15.0～17.0 min，0～80% A；17.0～17.5 min，80%～100% A；17.5～18.0 min，100% A。流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃。

質(zhì)譜條件：Triple TOF 5600+四級桿/飛行時間質(zhì)譜儀(AB Sciex美國)；ESI負(fù)離子模式-4.5 kV，離子化溫度500 ℃，霧化氣(GS1)60 psi，輔助加熱(GS2)35 psi；氣簾氣(CUR)15 psi；掃描范圍m/z120～1 000，IDA自動二級掃描模式；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

使用Lipidview軟件(版本V1.2，美國AB Sciex公司)中內(nèi)置數(shù)據(jù)庫對樣本中的磷脂輪廓進(jìn)行自動鑒定，獲得海參的磷脂輪廓信息。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的特征碎片，對自動鑒定的結(jié)果進(jìn)行人工篩選，過濾除去假陽性結(jié)果。通過MS-DAIL軟件(版本V3.12，日本RIKEN研究所)，對海參樣品中檢測到的磷脂分子種進(jìn)行色譜峰對齊以及歸一化預(yù)處理，并導(dǎo)入SIMCA-P+軟件(版本V14.0瑞典Umetrics公司)進(jìn)行多元統(tǒng)計分析，后構(gòu)建正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)模型，用于尋找不同產(chǎn)地仿刺參磷脂分子標(biāo)志物。

2 結(jié)果與分析

2.1 仿刺參磷脂組分鑒定

仿刺參中LPC和LPE保留時間在4～8 min，PC和PE的保留時間在8～14 min(圖1)。不同產(chǎn)地的仿刺參在總離子流圖上具有差異，說明其磷脂組成不同；為進(jìn)一步研究造成差異的主要因素，需對仿刺參中磷脂分子種進(jìn)行鑒定。

首先對仿刺參中的磷脂分子種組成進(jìn)行了分析。圖2給出了在負(fù)離子采集模式下3種產(chǎn)地仿刺參中確認(rèn)鑒定的磷脂分子種的質(zhì)荷比-保留時間二維展開圖。如圖2所示，主要磷脂分子種的洗脫時間在2～14 min。磷脂分子種的質(zhì)荷比主要集中在400～1 000區(qū)間內(nèi)，確認(rèn)了包括PE、LPE、PC和LPC等主要磷脂亞類約160余種磷脂分子種。

圖1 3種產(chǎn)地仿刺參磷脂總離子流圖Fig.1 TIC of A. japonicus phospholipids from three geographical origins

仿刺參中主要磷脂分子種(至少1個產(chǎn)地的仿刺參中該分子種在其對應(yīng)磷脂亞類中含量高于5%)總結(jié)于表1。由表可知，仿刺參中磷脂以富含C20∶5、C20∶4和C22∶5等多不飽和脂肪酸的分子種為主，如PC(18∶1-20∶5)、PE(18∶1-22∶5)及PI(18∶0-20∶5)等。而溶血型磷脂(LPC、LPE)中則以飽和或單不飽和中長碳鏈脂肪酸為主，如LPC(18∶0)、LPE(18∶1)等，與Lou等[12]對仿刺參脂質(zhì)輪廓分析結(jié)果相一致。不同產(chǎn)地仿刺參中磷脂分子種的相對含量有所不同，說明磷脂輪廓具有進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分和鑒別的功能。但由于變量數(shù)量較多，利用方差檢驗評估其差異顯著性會導(dǎo)致不可接受的假陽性率(例如，假設(shè)規(guī)定的檢驗水準(zhǔn)為0.01，則對于n次檢驗，存在假陽性錯誤的概率αn=1-(1-0.01)n,當(dāng)n增加時，αn趨于1[13])，因此宜采用多元統(tǒng)計模型。

圖2 3種產(chǎn)地仿刺參磷脂分子種鑒定Fig.2 Identification of phospholipid molecular species from A. japonicus samples from three geographical origins

表1 仿刺參中主要磷脂分子種及相對含量

Tab.1 Main phospholipid molecular species and their relative abundances inA.japonicasn=5

磷脂亞類Subclass加合形式Adduct保留時間/minRetentiontime質(zhì)荷比m/zMass-to-chargeratio磷脂分子種Molecularspecies磷脂相對含量/%RelativeabundanceofphopholipidDLJNWHPC[M+HCOO]-10.95832.5977PC(16:0-20:5)8.1±0.91.9±0.21.5±0.27.99798.5214PC(18:0-20:5)11.5±1.34.1±0.53.7±0.58.35824.5375PC(18:1-20:4)4.2±0.59.3±1.19.6±1.410.01804.5713PC(18:1-20:5)12.4±1.310.8±1.310.5±1.59.05826.5515PC(18:1-22:6)4.2±0.510.7±1.011.7±4.4PE[M-H]-9.39792.5474PE(18:0-22:5)24.3±1.74.8±0.46.3±0.68.42790.5330PE(18:1-22:5)25.4±2.311.9±0.716.2±1.611.34794.5626PE(20:0-20:4)10.0±1.117.4±2.918.2±2.09.41818.5622PE(20:1-22:5)5.7±0.53.3±1.03.4±1.512.18822.5911PE(22:0-20:4)2.9±0.410.8±2.27.9±1.611.30820.5751PE(22:1-20:4)2.6±0.46.7±1.36.8±1.1PI[M-H]-8.41883.5259PI(18:0-20:5)14.5±2.92.1±0.92.7±0.610.06913.5713PI(20:0-20:4)13.7±2.918.7±4.521.2±6.09.44911.5571PI(20:0-20:5)9.4±2.19.0±2.69.7±3.7

續(xù)表1，Tab.1 Continued

注：DL，JN和WH分別表示大連、膠南和威海。下同。

2.2 仿刺參磷脂輪廓數(shù)據(jù)多元統(tǒng)計分析

2.2.1 基于仿刺參磷脂輪廓的聚類分析

圖3為不同產(chǎn)地仿刺參鑒定的磷脂分子種數(shù)據(jù)PCA-X得分圖。圖中散點間距離表示其在主成分上的差異[14]。如圖3所示，不同產(chǎn)地的仿刺參樣本被分為3類，表明磷脂輪廓能夠?qū)?個產(chǎn)地的仿刺參有效區(qū)分。大連仿刺參與其他產(chǎn)地的磷脂組成差異較大；同屬山東半島的膠南和威海兩個產(chǎn)地仿刺參則較為接近，表明其磷脂組成具有相似性。Yun等[15]所產(chǎn)的仿刺參在DNA序列上存在差異。因此，磷脂輪廓的差異一方面可能與其產(chǎn)地環(huán)境因素有關(guān)[16-17]，另一方面，也可能受不同產(chǎn)地仿刺參遺傳物質(zhì)差異的影響。生物體內(nèi)脂質(zhì)代謝受生理狀態(tài)等多種因素影響[18]，膠南仿刺參個別樣本超出了PCA-X得分圖的T295%置信區(qū)域，可能是個體差異導(dǎo)致，不影響后續(xù)分析。

圖3 3種產(chǎn)地仿刺參PCA-X分析模型的得分圖Fig.3 Score plot of PCA-X model for differentiating A. japonicus samples from three geographical origins

產(chǎn)地溯源技術(shù)的原理是基于不同產(chǎn)地農(nóng)產(chǎn)品光譜特性或化學(xué)組成等方面存在的差異進(jìn)行分析，如張鵬等[19]基于不同產(chǎn)地蘋果中糖分等有機物含量的差異，利用近紅外光譜技術(shù)建立了有效的產(chǎn)地鑒別模型。目前，已有研究嘗試根據(jù)海參皂苷指紋圖譜進(jìn)行產(chǎn)地溯源，但受個體差異等多種因素影響，其結(jié)論具有一定局限性[20]。本研究表明，磷脂輪廓可以有效地對不同產(chǎn)地的仿刺參進(jìn)行區(qū)分，具有進(jìn)一步篩選對產(chǎn)地差異貢獻(xiàn)較大的磷脂標(biāo)志物的價值。為了更好地研究不同產(chǎn)地的仿刺參在磷脂輪廓上的差異，需要利用有監(jiān)督作用的多元統(tǒng)計工具OPLS-DA，對不同產(chǎn)地仿刺參磷脂輪廓構(gòu)建模型進(jìn)行分析。圖4給出了仿刺參磷脂輪廓的OPLS-DA模型得分圖，其參數(shù)[R2X=0.889(cum)，R2Y=0.979(cum)，Q2=0.954(cum)](其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2標(biāo)示模型的預(yù)測能力，理論上R2、Q2數(shù)值越接近1說明模型越好，通常情況下，R2、Q2高于0.5 (50%)較好)顯示模型的擬合度和預(yù)測能力符合要求。如圖4所示，在OPLS-DA模型中樣本類聚度明顯優(yōu)于PCA分析，特別是膠南和威海兩個產(chǎn)地仿刺參的分離更好，且全部樣本都位于PCA-X得分圖的霍特林T2的95%置信區(qū)域內(nèi)，說明該模型對仿刺參產(chǎn)地的鑒別能力優(yōu)于PCA模型。

圖4 3種產(chǎn)地仿刺參OPLS-DA分析模型的得分圖Fig.4 Score plot of OPLS-DA model for differentiating A. japonicus samples from three geographical origins

2.2.2 OPLS-DA兩兩比較及產(chǎn)地差異海參磷脂分子標(biāo)志物的篩選

聚類分析表明，不同產(chǎn)地仿刺參磷脂輪廓差異顯著。但是，為了篩選對產(chǎn)地差異具有較大貢獻(xiàn)的分子種(即產(chǎn)地差異的磷脂標(biāo)志物)，需進(jìn)一步構(gòu)建OPLS-DA模型進(jìn)行兩兩比較差異分析。表2給出了OPLS-DA模型兩兩比較的質(zhì)量評估參數(shù)。所有構(gòu)建的OPLS-DA模型在擬合優(yōu)度[R2X(cum)，R2Y(cum)]、預(yù)測能力Q2(cum)、穩(wěn)健度(R2，Q2的回歸曲線截距)方面均滿足要求[21]，可以用于產(chǎn)地差異磷脂分子標(biāo)志物的篩選。

表2 3種產(chǎn)地仿刺參磷脂分子標(biāo)志物篩選OPLS-DA模型質(zhì)量評估參數(shù)表

Tab.2 Quality evaluation parameters of OPLS-DA models for differentiating phospholipid molecular biomarkers inA.japonicussamples from three geographical origins

序號Number比較組別GroupsR2X(cum)R2Y(cum)Q2(cum)置換檢驗回歸曲線截距RegressioncurveinterceptofpermutationtestRb2Qb21DLvsJN0.9310.9990.9990.204-0.6042DLvsWH0.8930.9990.9980.203-0.3483WHvsJN0.5950.9750.9210.321-0.471

注：回歸曲線截距(Rb2<0.35，Qb2<0.05)時，表示模型穩(wěn)健[22]。

為保證篩選出的磷脂標(biāo)志物具有統(tǒng)計學(xué)意義，根據(jù)磷脂分子種在OPLS-DA模型中的變量投影重要度(variable importance for the projection,VIP)值、變化倍數(shù)(foldchange)和p值(pvalue)對結(jié)果進(jìn)行了過濾，并通過載荷圖刀切置信區(qū)間進(jìn)行檢驗[23]。最終篩選出10個磷脂分子種作為產(chǎn)地差異磷脂分子標(biāo)志物(表3)，主要是PE和PC。值得注意的是，磷脂標(biāo)志物多篩選自膠南-大連、大連-威海兩組模型，而在威海-膠南模型中則較少，這說明膠南和威海兩個產(chǎn)地仿刺參磷脂輪組成差異較小，此結(jié)論與PCA聚類分析的結(jié)果一致。在未來研究中，通過表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜等檢測技術(shù)[24]對少數(shù)產(chǎn)地差異標(biāo)志物進(jìn)行快速檢測，有望開發(fā)更加高效的仿刺參產(chǎn)地鑒別方法。此外，脂質(zhì)是影響農(nóng)產(chǎn)品感官質(zhì)量和營養(yǎng)成分的重要因素[25]，本研究篩選的磷脂標(biāo)志物不僅在仿刺參產(chǎn)地溯源方面具有應(yīng)用潛力，也可以作為仿刺參營養(yǎng)價值評估的重要指標(biāo)。

表3 仿刺參產(chǎn)地差異磷脂分子標(biāo)志物

Tab.3 Qualified phospholipid molecular biomarkers ofA.japonicusfrom three geographical origins

序號Number分子種Molecular species統(tǒng)計差異顯著組別Groups with significant difference1LPC(18:0)DL-JN; DL-WH2LPC(20:1)DL-JN3PC(18:0-20:5)DL-JN; DL-WH4PE(22:0-20:4)DL-JN; DL-WH; JN-WH5PE(20:0-20:4)DL-JN; DL-WH6PC(16:0-20:5)DL-JN; DL-WH7PC(18:1-20:4)DL-JN; DL-WH8PE(18:0-22:5)DL-JN; DL-WH9PC(18:1-22:6)DL-JN10PC(18:1-18:2)DL-JN

3 結(jié)論

本研究利用UHPLC-ESI-TOF-HRMS分析體系結(jié)合多元統(tǒng)計分析模型，建立了仿刺參磷脂組鑒定分析與產(chǎn)地差異磷脂分子標(biāo)志物篩選方法。PCA分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地仿刺參能夠根據(jù)其磷脂輪廓進(jìn)行有效區(qū)分。通過OPLS-DA模型篩選出10個產(chǎn)地差異磷脂分子標(biāo)志物(主要是PE和PC)，有望進(jìn)一步用于開發(fā)仿刺參產(chǎn)地快速鑒別方法。另外，多不飽和脂肪酸被認(rèn)為是海產(chǎn)品中重要生物活性成分之一，分析發(fā)現(xiàn)篩選的產(chǎn)地差異標(biāo)志物富含C20:4和C20:5等多不飽和脂肪酸,表明不同產(chǎn)地的仿刺參營養(yǎng)價值可能有所不同。本研究為高值海產(chǎn)品的溯源研究提供了方法學(xué)參考，同時為評價不同產(chǎn)地仿刺參營養(yǎng)價值差異提供了數(shù)據(jù)支持。