張濤，張林，周劍光，甘金華，陳建武，何力

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(武漢)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

黃尾鲴(Xenocyprisdavidi)隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鯝亞科(Xenocyprininae)、鯝屬(Xenocypris)，俗稱黃尾、黃片、黃姑子、黃瓜魚或黃板刁等，在中國長江、珠江、閩江以及黃河水系均有分布，為中國特有種[1]。黃尾鲴為底棲中小型魚類，通常生活在江河、湖泊和水庫等天然水域的中下層，以藻類、腐殖質(zhì)、有機碎屑以及植物碎片為餌料，兼食浮游動物和底棲動物[2]，具有食性雜、生長快、抗逆性強、肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)價值高、可自然繁殖和容易捕撈等特點。黃尾鲴自20世紀50年代引入池塘馴養(yǎng)，至60年代初人工繁殖成功[1]。由于黃尾鲴個體繁殖力較強[3]，且集群生活，在湖泊、水庫中均能形成自然種群，具有較高的群體生產(chǎn)力。此外，黃尾鲴可通過其下頜角質(zhì)邊緣刮取藻類、腐殖質(zhì)、有機碎屑等作為食物，可起到凈化水質(zhì)、減緩水體富營養(yǎng)化進而改善水生態(tài)環(huán)境的作用，是天然水域增殖品種之一。由于黃尾鲴餌料成本低廉，在水體中不與肉食性和植食性魚類爭食，又使其成為良好的套養(yǎng)品種之一。

目前，有關(guān)黃尾鲴的報道主要集中在養(yǎng)殖技術(shù)[4-5]、生物學(xué)特性[3, 6-8]、營養(yǎng)學(xué)特性[9]、發(fā)育生物學(xué)[10-11]、分子遺傳學(xué)特性[1,8,12-13]及漁業(yè)資源評估[14]等方面，有關(guān)黃尾鲴形態(tài)特征[4-5,8,15]方面的研究僅見零星報道，缺乏系統(tǒng)性。有關(guān)生化遺傳特性方面的研究[16-19]主要針對于野生群體，關(guān)于養(yǎng)殖群體的報道相對較少，且不同研究者研究結(jié)果間存在差異。形態(tài)特征和生化遺傳參數(shù)是制定種質(zhì)標準時常采用的指標。已有研究表明：即使形態(tài)特征相近、分類上仍屬同一個種的不同地理種群，在同工酶水平上也存在一定差異[20]。所以，在鑒定生物物種時，除了從形態(tài)特征層面著手外，有必要探討其在同工酶水平上是否存有差異。本研究通過形態(tài)學(xué)觀察、可數(shù)可量性狀測定，并結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)檢測不同組織中的乳酸脫氫酶(LDH)以及蘋果酸脫氫酶(MDH)表達情況，同時篩選出黃尾鲴種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)，并與已有研究結(jié)果進行比較分析，旨在從形態(tài)特征和生化遺傳角度進一步豐富黃尾鲴種質(zhì)資源方面的研究內(nèi)容，為其種質(zhì)鑒定標準的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用黃尾鲴于2018年11月采自湖北省隨州市，為人工養(yǎng)殖群體，總共74尾，體重范圍為210.8～615.8 g，均值為(390.4±82.4) g；體長范圍為24.0～32.0 cm，均值為(28.8±1.7) cm。

1.2 實驗方法

1.2.1 形態(tài)測定

按照養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗性狀測定標準GB/T 18654.3—2008[21]的規(guī)定，對30尾樣本進行形態(tài)觀察，并對可數(shù)可量性狀進行測定?？蓴?shù)性狀計數(shù)參數(shù)包括背鰭鰭條數(shù)、臀鰭鰭條數(shù)、側(cè)線鱗數(shù)、側(cè)線上鱗數(shù)、側(cè)線下鱗數(shù)、脊椎骨數(shù)以及左側(cè)第一鰓弓外側(cè)鰓耙數(shù)。可量性狀測量參數(shù)包括全長、體長、體高、頭長、吻長、眼徑、眼間距、尾柄長和尾柄高。全長及體長參數(shù)用直尺測量，其他參數(shù)用游標卡尺進行測量，并計算可量性狀的比例值。

1.2.2 組織酶液的制備、電泳及染色方法

LDH所用凝膠為不連續(xù)濃度膠，濃縮膠、分離膠濃度分別為7.5%、4%，MDH所用凝膠濃度為9%連續(xù)濃度膠，組織酶液的制備、電泳及染色參照張濤等[22]的方法。

1.2.3 模式圖的繪制

采用Bandscan 5.0(Glyko, 美國)電泳圖譜中的酶帶進行灰度識別，并根據(jù)識別灰度繪制電泳圖譜模式圖。

1.2.4 酶的命名與分析

同工酶的命名和分析參考熊全沫[23]的方法，以各酶帶的相對遷移率(Rf)從小到大依次命名并順序編號。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得可量性狀數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0(IBM公司，美國)進行分析，結(jié)果以(平均值±標準差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)描述及可數(shù)、可量性狀

觀測74尾黃尾鲴形態(tài)(圖1)，發(fā)現(xiàn)其體呈紡錘形，側(cè)扁，腹部圓。頭小，較尖，近圓錐形。口下位，下頜有較發(fā)達的角質(zhì)邊緣。側(cè)線完全，在腹鰭附近向下彎曲呈弧形，向后延伸至尾柄正中。背鰭有硬刺，表面光滑，起點在腹鰭起點稍前上方。胸鰭不發(fā)達，遠不及腹鰭起點。腹鰭、臀鰭較短小。尾鰭分叉，上下葉幾乎等長。肛門靠近臀鰭。在肛門前有一小段腹棱，其長不超過肛門與腹鰭基部間距的1/4。背部呈黑色或青灰色，胸鰭和腹鰭呈淡黃色，體側(cè)下半部及腹部呈銀白色，鰓蓋骨后緣有一淺黃色斑塊，背鰭末端呈黃色，尾鰭呈橘黃色。

圖1 黃尾鲴外觀形態(tài)Fig.1 Morphological observation of Xenocypris davidi

黃尾鲴鰾2室，前室短，后室長。下咽齒齒式2·4·6/6·4·2。脊椎骨數(shù)為36～41。左側(cè)第一鰓弓外側(cè)鰓耙數(shù)為44～52。腹膜呈黑色。黃尾鲴可數(shù)、可量性狀見表1，表中范圍給出了所測各指標的上下限，均值反映了所測數(shù)據(jù)的集中程度?？蓴?shù)性狀中，背鰭條數(shù)穩(wěn)定，側(cè)線鱗數(shù)較多，變化范圍也較大?？闪啃誀钪?，主要以體長和頭長為參照，給出了吻長、眼徑和眼間距等頭部主要參數(shù)與頭長的比例關(guān)系，也反映了體高、尾柄長和尾柄高等軀干部主要參數(shù)與體長的比例關(guān)系。

2.2 LDH的表達

黃尾鲴5種組織中的LDH同工酶表達結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，心臟組織中共檢測到6條酶帶(圖2A)，其中LDH1、LDH2、LDH4和LDH5表達活性較強，LDH3表達活性最弱；眼睛晶狀體組織中共檢測到6條酶帶(圖2B)，LDH2、LDH4和LDH5表達活性較強，LDH6表達活性最弱；肌肉組織中共檢測到4條LDH酶帶(圖2C)，其中1～2號樣本檢測到3條酶帶，而其余3尾樣本均多出1條酶帶即LDH1，且LDH1在3號樣本中的表達活性弱于其他兩個樣本，LDH2～LDH4在各樣本中的酶譜相同，表達活性一致；肝臟組織中共檢測到7條酶帶(圖2D)，LDH2、LDH3、LDH5～LDH7表達活性均較強，LDH1表達活性最弱；腎臟中檢測到的酶帶數(shù)最多，共有8條(圖2E)，LDH1僅在3～5號樣本中檢出，LDH2和LDH3在1號樣本中未檢出，LDH4～LDH8為5尾樣本魚的

共有酶帶，其中，LDH4和LDH5表達活性相對較弱，其余3條共有酶帶表達活性相對較強。綜上，除肌肉和腎臟組織外，5尾樣本魚其余3種組織酶譜相同，表達活性一致。LDH在黃尾鲴不同組織中均有表達，但是表達的酶譜和活性不同，呈現(xiàn)出明顯的組織特異性。

表1 黃尾鲴的可數(shù)性狀和可量性狀的均值與標準偏差

Tab.1 The mean values and standard deviation of countable and measurable parameters ofXenocyprisdavidi

特征Trait指標Item范圍Scale均值A(chǔ)verage可數(shù)性狀背鰭條數(shù)7 7.00±0.00Countabletrait臀鰭條數(shù) 9～11 9.84±0.60側(cè)線鱗數(shù)60～6864.99±1.72側(cè)線上鱗數(shù)10～1210.69±0.74側(cè)線下鱗數(shù)5～6 5.81±0.39脊椎骨數(shù)36～4138.28±1.38左側(cè)第一鰓弓外側(cè)鰓耙數(shù)44～5248.76±1.81可量性狀全長/體長1.16～1.26 1.21±0.02Measurabletrait體長/體高3.55～4.033.77±0.12體長/頭長4.80～5.855.41±0.17體長/尾柄長5.84～9.806.68±0.58體長/尾柄高8.55～10.399.39±0.38頭長/吻長3.63～4.443.94±0.18頭長/眼徑3.47～4.223.87±0.17頭長/眼間距1.93～3.712.19±0.20尾柄長/尾柄高0.99～1.671.41±0.12

圖2 黃尾鲴LDH電泳圖譜A、B、C、D、E分別表示心臟、眼睛晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟的LDH酶譜；1～5泳道分別表示不同個體的酶譜。Fig.2 Electrophoretogram of LDH isozymes in Xenocypris davidiA, B, C, D, E show electrophoretograms of LDH isozymes expressed in heart, eye, muscle, liver and kidney respectively.1-5 show the zymograms of different individuals.

2.3 MDH的表達

黃尾鲴的MDH同工酶的表達如圖3所示，線粒體型MDH(m-MDH)僅在心臟和肌肉組織中有表達，其余3種組織中僅檢測到上清液型MDH(s-MDH)。心臟組織中共檢測到7條MDH酶帶(圖3A)，s-MDH1～s-MDH3僅在1號樣本中有檢出，s-MDH4～m-MDH7在5尾樣本中均有檢出，其中，m-MDH7在1號樣本中的表達活性最高，而s-MDH4～s-MDH6在1號樣本中的表達活性均弱于其他樣本。眼睛晶狀體組織MDH酶帶表達見圖3B，除1號樣本未檢測到MDH表達外，其余4尾樣本中均檢測到3條s-MDH酶帶，其中s-MDH1表達活性高于s-MDH2和s-MDH3。肌肉組織中共檢測到4條MDH酶帶(圖3C)，除1號和2號樣本中檢測到3條上清液型s-MDH酶帶和1條線粒體型m-MDH4酶帶外，其他樣本中只檢測到3條上清液型s-MDH酶帶；s-MDH3在1號和2號樣本肌肉中表達活性高于其他3個樣本，s-MDH1和s-MDH2在5尾樣本肌肉中的表達活性基本相同。肝臟組織中共檢測到4條s-MDH酶帶(圖3D)，除1號樣本未檢測到s-MDH2外，其余4尾樣本均有s-MDH2檢出，s-MDH1和s-MDH3在1號樣本中的表達活性程度均比其余4尾樣本弱。腎臟組織中檢測到3條MDH酶帶(圖3E)，除s-MDH1在1號樣本中未檢測到外，其余樣本酶譜相同，表達活性相似。因此，推斷黃尾鲴MDH表達的酶譜和活性既有個體差異性也有組織特異性。

圖3 黃尾鲴MDH電泳圖譜A、B、C、D、E分別表示心臟、眼睛晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟MDH酶譜；1～5泳道分別表示不同個體的酶譜。Fig.3 Electrophoretogram of MDH isozymes in Xenocypris davidiA, B, C, D, E show electrophoretograms of MDH isozymes expressed in heart, eye, muscle, liver and kidney respectively.1-5 show the zymograms of different individuals.

2.4 黃尾鲴特征生化遺傳參數(shù)

本研究中5尾樣本魚肌肉和腎臟中LDH酶帶均有多態(tài)，心臟和肝臟中LDH酶帶分離效果并不理想，而所有樣本魚眼睛晶狀體組織中LDH不僅酶帶數(shù)和表達活性程度相同，且分離效果好，酶帶清晰，初步確定以眼睛晶狀體LDH作為從生化遺傳特征層面鑒定黃尾鲴種質(zhì)的備選對象。再隨機選取5尾樣本魚的眼睛晶狀體進一步電泳以驗證眼睛LDH酶帶表達情況，5尾樣本魚眼睛LDH同工酶圖譜顯示全部為單態(tài)(圖4)。因此，本研究采用眼睛晶狀體組織的LDH作為鑒定黃尾鲴種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)。

圖4 黃尾鲴眼睛晶狀體組織LDH電泳圖譜1～5泳道分別表示不同個體的酶譜。Fig.4 Electrophoretogram of LDH isozymes expressed in eyes of Xenocypris davidi1-5 show the zymograms of different individuals.

3 討論

3.1 黃尾鲴的形態(tài)學(xué)比較

本研究中黃尾鲴的形態(tài)特征與其他已有研究結(jié)果基本一致，本研究觀察到黃尾鲴的胸鰭和腹鰭呈淡黃色，不同于彭良宇[4]和《中國鯉科魚類志》[24]中的觀測結(jié)果，分析認為造成這種觀察差異的原因可能主要是與養(yǎng)殖環(huán)境的差異有關(guān)，這種現(xiàn)象在其他魚類中亦有類似的報道[25]，當然也不排除觀察者主觀判斷因素造成的差異。在可數(shù)性狀方面，本研究結(jié)果與羅泉笙[15]和《中國鯉科魚類志》[24]的報道相一致，不同于謝立華[8]的研究結(jié)果，分析認為造成這一差異的原因除了與樣本量大小有關(guān)外，還可能與觀察者的主觀認識有關(guān)。在可量性狀方面，本研究中除少數(shù)性狀比例如體長/頭長、頭長/吻長等參數(shù)與羅泉笙[15]和《中國鯉科魚類志》[24]報道稍有差異外，其他性狀比例基本一致，分析造成這一差異的原因可能與野生種群和養(yǎng)殖種群獲取餌料難易程度不同有關(guān)，養(yǎng)殖種群餌料充分有保障，受敵害、環(huán)境脅迫相對較少，有利于其生長，而野生種群餌料供應(yīng)保障程度上不及養(yǎng)殖種群，而且相對養(yǎng)殖種群長期處于復(fù)雜多變的水生態(tài)環(huán)境，不利于其生存與生長[26]。當然也不排除與所測樣本魚的規(guī)格和樣本量大小有關(guān)，隨著黃尾鲴規(guī)格的增大，可食部分所占比例也相應(yīng)增大。因此，建議在報道魚類可數(shù)可量性狀時，一定要說明樣本的規(guī)格及樣本數(shù)量。

表2 黃尾鲴可數(shù)性狀的比較

Tab.2 Comparations of countable parameters ofXenocyprisdavidi

來源Resources樣本數(shù)Numberofsamples體長/cmBodylength背鰭條數(shù)Numberofdorsalfin臀鰭條數(shù)Numberofanalfin側(cè)線鱗式Formulaoflateralscales謝立華[8]20—7～911～136010～12676～8羅泉笙[15]>7910.0～45.079～116310～11685～6―V《中國鯉科魚類志》[24]2018.0～26.879～116310～12685～6―V本研究7425.8～32.079～116010～12685～6―V

注：側(cè)線鱗式參照文獻[21]?！啊笔疚墨I未列出，下同。

3.2 黃尾鲴同工酶表達的組織特異性及其研究結(jié)果比較

本研究中，黃尾鲴的各種組織中均能檢測到LDH和MDH同工酶的表達，說明黃尾鲴體內(nèi)LDH和MDH分布比較廣泛。從實驗結(jié)果來看，兩種同工酶在黃尾鲴5種組織中的表達均具有組織特異性，除了不同組織檢出的酶帶數(shù)目不同外，表達的活性也存在差異。如肝臟LDH酶帶著色程度均較深，說明其在肝臟中表達活性較強，這與肝臟是重要的糖代謝器官是相適應(yīng)的，糖代謝主要通過肝糖原的合成和分解以及糖異生作用來維持血糖濃度相對穩(wěn)定，而LDH是參與糖酵解和糖異生過程中催化乳酸和丙酮酸之間氧化還原反應(yīng)的重要酶類[27-28]。同時，心臟組織MDH表達活性也高于眼睛晶狀體組織，心臟主要的功能是泵血和循環(huán)，血液通過血管進入機體各部分，為機體提供氧分和營養(yǎng)，而MDH是三羧酸循環(huán)過程中的一種重要酶，能夠催化蘋果酸脫氫并與草酰乙酸相互轉(zhuǎn)化[29]，MDH在血液為機體提供氧和營養(yǎng)方面發(fā)揮著巨大作用。一般認為，同工酶是基因表達的產(chǎn)物，其表達受溫度、壓力、激素、氧容量和營養(yǎng)等內(nèi)外因素的時空調(diào)控，致使其基因在各組織間的表達時間和強度不相一致，造成了不同組織同工酶酶譜的特異性[30]。

關(guān)于黃尾鲴LDH和MDH研究結(jié)果的比較見表3，從表3可以看出不同研究者[16-19]對黃尾鲴各組織LDH和MDH的研究結(jié)果稍有不同。關(guān)于LDH，本研究與姚桂桂等[19]的研究結(jié)果比較接近，除了心臟LDH酶帶數(shù)略有差異、腎臟LDH酶帶數(shù)差異較大外，其余組織中LDH表達的酶帶數(shù)相近，且均認為眼睛晶狀體組織LDH酶帶穩(wěn)定，多次重復(fù)試驗結(jié)果無差異，眼睛晶狀體組織LDH可作為鑒定黃尾鲴種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)。分析認為造成差異的原因可能與實驗方法不同有關(guān)，包括樣品制備方法、濃縮膠和分離膠的濃度、電壓和電泳時間的不同等。值得注意的是，不排除養(yǎng)殖種群經(jīng)過人工定向選擇和有限親本累代繁殖后，致使等位基因喪失，反應(yīng)在同工酶電泳時相對于野生群體有差異，其他學(xué)者研究報道中也有類似的現(xiàn)象[31-32]。當然，由于同工酶是蛋白質(zhì)水平的標記，是對基因的間接反映，檢測結(jié)果往往是被修飾的基因產(chǎn)物，而非基因本身[33]。上述研究結(jié)果的差異，也可能與同工酶自身特性有關(guān)。

表3 黃尾鲴LDH和MDH研究結(jié)果比較

Tab.3 Comparations of LDH and MDH isozymes expressed inXenocyprisdavidi

來源Resources電泳方法及凝膠濃度Electrophoresismethodandgelconcentration電泳時間Electrophoresistime同工酶Isozyme心臟Heart眼Eye肌肉Muscle肝臟Liver腎臟Kidney朱藍菲[16] 玻璃管電泳5.6%1.5hLDH33——3曹麗琴和 孟慶聞[17] PAGE垂直版電泳,凝膠濃度不詳100minLDH555115MDH43355張燕萍等[18]PAGE垂直版電泳,濃縮膠5%,分離膠10%4～5hLDH2—344MDH2—未檢出31姚桂桂等[19]PAGE垂直版電泳,濃縮膠3.75%,分離膠6.5%5～6hLDH76—713本研究 PAGE垂直版電泳,濃縮膠4%,分離膠7.5%6～7hLDH663～475～8PAGE垂直版電泳,9%連續(xù)膠5～6hMDH4～70～33～43～42～3

4 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法觀測了黃尾鲴的形態(tài)特征，重點對其可數(shù)、可量性狀進行了討論分析，黃尾鯝的主要形態(tài)特征：頭小而尖，口下位，下頜有較發(fā)達的角質(zhì)邊緣。肛門靠近臀鰭，肛門前有一小段腹棱。鰓蓋骨后緣有一淺黃色斑塊，背鰭末端黃色，胸鰭和腹鰭淡黃色，尾鰭橘黃色。鰭式為背鰭D.Ⅲ-7和臀鰭A.ⅲ-9～11；下咽齒齒式2·4·6/6·4·2；脊椎骨數(shù)為36～41；左側(cè)第一鰓弓外側(cè)鰓耙數(shù)為44～52。同時,通過聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳對黃尾鲴心臟、眼睛晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟5種組織的LDH和MDH同工酶進行了分析，其LDH酶帶數(shù)分別為6、6、3～4、7和5～8條，MDH酶帶數(shù)分別為4～7、0～3、3～4、3～4和2～3條，初步確定了黃尾鲴眼睛晶狀體中LDH為單態(tài)、表達豐富且活性穩(wěn)定，可作為鑒定黃尾鲴種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)。本研究可為黃尾鯝種質(zhì)鑒定、制定其種質(zhì)標準提供參考資料。