董明強(qiáng) 汪蕊 王志華 江炳東

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤，CRC的發(fā)病率、死亡率均較高，發(fā)病率居于惡性腫瘤的第3位，死亡率居于第4位，嚴(yán)重危害人類生命健康[1]。目前關(guān)于CRC的治療主要是外科手術(shù)和放化療綜合療法，但是術(shù)后部分患者的預(yù)后仍然較差，因此尋找更為有效的靶向治療方法對(duì)CRC患者具有重要的意義。微小RNA（microRNAs，miRNA）是一類非編碼小RNA分子，可與靶基因mRNA的3'UTR區(qū)域結(jié)合，降解靶基因mRNA，調(diào)控靶基因的表達(dá)影響細(xì)胞功能[2]。研究報(bào)道，miR-142-3p在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著降低，過(guò)表達(dá)miR-142-3p可抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[3]。miR-142-3p在CRC患者血清中表達(dá)下調(diào)[4]。在肝細(xì)胞癌中，F(xiàn)STL1通過(guò)抑制AKT/ GSK- 3β依賴性方式的凋亡來(lái)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[5]。研究顯示，F(xiàn)STL1在CRC組織中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系[6]。但關(guān)于miR-142-3p與FSTL1在CRC細(xì)胞中是否存在調(diào)控關(guān)系，miR-142-3p是否靶向FSTL1影響CRC細(xì)胞的增殖、凋亡與放療敏感性則未見報(bào)道，本研究通過(guò)生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)探究miR-142-3p是否靶向FSTL1，及對(duì)CRC細(xì)胞的影響。

材料與方法

一、材料

正常人胚胎結(jié)腸FHC細(xì)胞、CRC細(xì)胞系SW480、DLD-1、HCT116、Caco-2（上海細(xì)胞庫(kù)），胰蛋白酶（T8031）、DMEM培養(yǎng)基（30071.03）（美國(guó)Hyclone公司），MTT（M2128-1G，美國(guó)Sigma公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（DRR420A，日本TAKARA公司），BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（AR0146，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），CyclinD1（4196，美國(guó)R&D公司），Bax（2772）、Bcl-2（2876）、β-actin（4967s）（美國(guó)CST公司），F(xiàn)STL1（PA127757，美國(guó)Pierce公司），IgG二抗（bs-13151R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司），LiPofectamineTM 2000試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞的培養(yǎng)：細(xì)胞置于10%胎牛血清和雙抗（青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml）的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。

2. qRT-PCR：Trizol提取細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA行qRT-PCR，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為miR-142-3p的內(nèi)參基因，miR-142-3p的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔct方法計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。引物序列：miR-142-3p：F5'-ACACTC CAGCTGGGTCTCCCAACCCTTGTACCA-3'，R5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6：F5'-CT CGCTTCGGCAGCACA-3'，R5'-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3'。

3.蛋白印跡（Western Blot）法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況：RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，取100 μg蛋白進(jìn)行變性，10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶封閉1 h；一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST清洗3次；二抗孵育1 h，TBST清洗3次；滴加ECL顯影液顯色，AI600成像系統(tǒng)顯影，采集圖片，Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以β-Actin為內(nèi)參進(jìn)行灰度值比較。

4.實(shí)驗(yàn)分組與轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞接種于24孔板中，使細(xì)胞貼壁密度約80%。設(shè)計(jì)并合成miR-NC、miR-142-3p mimic、anti-miR- con、anti- miR-142-3p的片段，使用opti-MEM分別稀釋miR-NC、miR-142-3p mimic、anti-miR-con、anti- miR-142-3p合成序列各20 μl及l(fā)ipo2000 10 μl，5 min內(nèi)將兩種稀釋液混合作用20 min，分別記為miR-con組、miR-142-3p組、anti-miR-con組和anti- miR-142-3p組。然后分別將各組混合液加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中混勻，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)6 h，換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后進(jìn)行功能試驗(yàn)。并設(shè)置空白對(duì)照組（NC組），細(xì)胞不做任何處理。

合成si-FSTL1及陰性對(duì)照si-con片段，分別將si-FSTL1、si-con與Lipo2000試劑混勻后，加至生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SW480細(xì)胞中混勻，分別記為si- FSTL1組、si- con組，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育6 h，換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后進(jìn)行功能試驗(yàn)。

構(gòu)建pcDNA3.1-FSTL1表達(dá)載體：提取細(xì)胞中RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以PCR產(chǎn)物為模板，加入含BamH I和Xho I雙酶切位點(diǎn)的引物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并回收DNA片段。將DNA片段與pcDNA3.1質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后，酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的催化下，混合、4 ℃過(guò)夜連接。然后轉(zhuǎn)化、挑選單克隆菌落，進(jìn)行搖菌擴(kuò)增并提取質(zhì)粒。通過(guò)菌落PCR和雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。選取酶切鑒定成功的質(zhì)粒送至英駿公司測(cè)序，證實(shí)已將FSTL1基因插入到pcDNA3.1載體。應(yīng)用Lipo2000將pcDNA3.1-con、pcDNA3.1-FSTL1轉(zhuǎn)染至高表達(dá)miR-142-3p的SW480細(xì)胞中，記為miR-142-3p+pcDNA-con組、miR-142-3p +pcDNA-FSTL1組。

5. MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，分別培養(yǎng)24，48，72 h。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h。吸棄培養(yǎng)基，加入150 μl二甲基亞砜，室溫反應(yīng)5 min，混合均勻，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6.克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)放射敏感性：按照梯度倍數(shù)稀釋法稀釋SW480細(xì)胞，根據(jù)照射劑量的增加接種不同數(shù)量的細(xì)胞，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，給予（0，2，4，6，8 Gy）照射。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，PBS清洗2次；400 μl每孔快速吉姆薩染色液（Giemsa）染液固定2 min；800 μl每孔Giemsa染液染色8 min，沖洗染色液，自然干燥；光鏡下觀察≥50個(gè)細(xì)胞的集落，計(jì)算細(xì)胞存活率。

7.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞處理后48 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，離心收集細(xì)胞；500 μl 1×結(jié)合緩沖液（binding buffe）重懸細(xì)胞，避光條件下加入1 μl Annexin V-PE，混勻，孵育15 min；加入5 μl 7-氨基放線菌D（7-Amino-actinomyces D，7AAD），混勻，孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，計(jì)算凋亡細(xì)胞率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

圖1 miR-142-3p和FSTL1在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。CRC細(xì)胞與正常結(jié)腸細(xì)胞FHC中miR-142-3p、FSTL1 mRNA和蛋白水平用± s表示，比較采用樣本t檢驗(yàn)；NC組、si- con組與si-FSTL1組以及NC、si-con組與si- FSTL1組三組間細(xì)胞活力、凋亡率、CyclinD1、Bcl-2蛋白水平采用單因素方差分析。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CRC細(xì)胞系中miR-142-3p和FSTL1表達(dá)水平

與正常人結(jié)腸細(xì)胞FHC相比，CRC細(xì)胞SW480、DLD-1、HCT116、Caco-2中miR-142-3p表達(dá)降低，F(xiàn)STL1 mRNA和蛋白水平均升高，選擇FSTL表達(dá)量最高的SW480細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1～ 2，P＜ 0.05）。

圖2 結(jié)直腸癌細(xì)胞中FSTL1蛋白表達(dá)條帶

二、過(guò)表達(dá)miR-142-3p對(duì)CRC SW480細(xì)胞增殖、凋亡和放療敏感性的影響

與miR-con組相比，miR-142-3p組CRC SW480細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平升高，48、72h細(xì)胞增殖活力和CyclinD1、Bcl-2蛋白水平降低（圖 3 ～ 5和表1，P＜ 0.05）。放射敏感性實(shí)驗(yàn)顯示，與miR-con組相比，miR-142-3p組細(xì)胞經(jīng)2、4、6、8Gy劑量的放射線照射后存活率均降低，放療敏感性增加（表2，P＜ 0.05）。 NC組與miR-con組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

三、 敲減FSTL1對(duì)CRC SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與si-con組相比，si-FSTL1組SW480細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平升高48h、72h細(xì)胞增殖活力和CyclinD1、Bcl-2蛋白水平降低（圖6 ～ 8，表3，P＜ 0.05）。NC組與si-con組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

四、 miR-142-3p靶向調(diào)控FSTL1的表達(dá)

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-142-3p后的SW480細(xì)胞凋亡情況

圖4 MTT法檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-142-3p后的SW480細(xì)胞OD值

圖5 CyclinD1、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)條帶

表1 過(guò)表達(dá)miR-142-3p對(duì)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響（± s）

表1 過(guò)表達(dá)miR-142-3p對(duì)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響（± s）

注：與miR-con組比較，aP ＜ 0.05

分組樣本量miR-142-3pCyclinD1BaxBcl-2細(xì)胞增殖活力（OD 490 nm ）凋亡率（%）24 h48 h72 h NC組90.85±0.091.00±0.110.40±0.041.00±0.100.65±0.071.08±0.111.68±0.15 9.01±0.91 miR-con組90.88±0.091.02±0.120.45±0.050.98±0.100.63±0.071.01±0.101.60±0.16 8.96±0.89 miR-142-3p組9 2.99±0.30a 0.35±0.05a 1.02±0.11a 0.38±0.04a0.58±0.06 0.82±0.08a 1.16±0.11a30.23±3.10a F值382.737135.279197.722155.1672.61917.14735.163361.718 P值＜ 0.05＜ 0.05＜ 0.05＜ 0.05＜ 0.05＜ 0.05＜ 0.05＜ 0.05

表2 放射線對(duì)過(guò)表達(dá)miR-142-3p的結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞存活率的影響（± s）

表2 放射線對(duì)過(guò)表達(dá)miR-142-3p的結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞存活率的影響（± s）

注：與miR-con組比較，aP ＜ 0.05

分組樣本量細(xì)胞存活率（%）0 Gy2 Gy4 Gy6 Gy8 Gy NC組9102.01±10.0192.56±9.2555.26±5.5336.58±3.5311.05±1.10 miR-con組9100.01± 9.8690.11±9.0152.86±5.2933.43±3.3210.35±0.25 miR-142-3p組9103.05±10.30 76.43±7.52a 31.26±3.13a 9.05±0.90a 7.56±0.75a F值0.2129.13669.007252.33050.160 P值0.8100.001＜ 0.05＜ 0.05＜ 0.05

圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)敲減FSTL1后SW480細(xì)胞凋亡情況

表3 敲減FSTL1對(duì)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響（± s）

表3 敲減FSTL1對(duì)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響（± s）

注：與si-con組比較，aP ＜ 0.05

分組樣本量 FSTL1CyclinD1BaxBcl-2細(xì)胞增殖活力（OD-490nm ）凋亡率（%）24 h48 h72 h NC組91.18±0.141.00±0.100.39±0.041.01±0.110.60±0.071.03±0.111.65±0.15 9.25±0.93 si-con組91.15±0.121.05±0.100.41±0.041.00±0.120.60±0.071.00±0.101.60±0.16 9.01±0.91 si-FSTL1組9 0.41±0.05a 0.40±0.05a 1.00±0.11a 0.42±0.05a0.55±0.06 0.78±0.08a 1.05±0.11a28.03±2.91a F值140.721157.000211.941119.4071.67917.65360.090316.430 P值＜ 0.05＜ 0.05＜ 0.05＜ 0.050.208＜ 0.05＜ 0.05＜ 0.05

圖7 MTT檢測(cè)敲減FSTL1后的SW480細(xì)胞OD值

圖8 敲減FSTL1后的SW480細(xì)胞FSTL1、CyclinD1、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)條帶

圖9 生物信息軟件預(yù)測(cè)miR-142-3p與FSTL1靶向關(guān)系

TargetScan軟件預(yù)測(cè)miR-142-3p與FSTL1 3'UTR存在互補(bǔ)位點(diǎn)（圖9），熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-142-3p與FSTL13'UTR的聯(lián)系，構(gòu)建WT- FSTL13'UTR和MUT-pGL3-SIRT1- 3'UTR質(zhì)粒，分別與miR-con、miR-142-3p共轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞中，熒光素酶報(bào)告基因顯示，只有WT- miR- 142- 3p熒光素酶活性降低（表4，P＜ 0.05），提示miR-142-3p與FSTL1可直接結(jié)合。Western Blot結(jié)果顯示，與miR-con組相比，F(xiàn)STL1蛋白水平降低（P＜ 0.05）；與anti-miR-con組相比，anti-miR-142-3p組FSTL1蛋白水平升高（P＜ 0.05）（圖10，表5），提示miR-142-3p對(duì)FSTL1具有負(fù)性調(diào)控作用。

表4 雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果（± s）

表4 雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果（± s）

分組樣本量熒光素酶活性WTMUT miR-con組91.00±0.171.00±0.15 miR-142-3p組90.37±0.050.95±0.09 t 值8.7090.700 P值＜ 0.050.500

圖10 FSTL1蛋白表達(dá)條帶

表5 miR-142-3p對(duì)FSTL1蛋白表達(dá)影響（± s）

表5 miR-142-3p對(duì)FSTL1蛋白表達(dá)影響（± s）

注：與miR-con組比較，aP ＜ 0.05，與anti-miR-con組比較，bP ＜ 0.05

分組樣本量FSTL1蛋白miR-con組91.12±0.11 miR-142-3p組9 0.49±0.05a anti-miR-con組91.15±0.11 anti-miR-142-3p組9 0.78±0.08b F值141.390 P值＜ 0.05

五、高表達(dá)FSTL1可部分恢復(fù)miR-142-3p對(duì)CRC SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與miR-con組相比，miR-142-3p組SW480細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平升高（P＜ 0.05），48h、72h細(xì)胞增殖活力和FSTL1、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平水平降低（P＜ 0.05）；與miR- 142- 3p+ pcDNA- con組相比，miR-142-3p+pcDNA-FSTL1組SW480細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平降低（P＜ 0.05），48h、72h細(xì)胞增殖活力和FSTL1、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平水平升高（P＜ 0.05，圖11 ～ 13，表6）。

討 論

CRC在我國(guó)的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加和年輕化的趨勢(shì)，具有高發(fā)病率和死亡率[7]。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多基因相互作用的病理過(guò)程。CRC的治療主要包括手術(shù)切除、綜合化療、放療等[8]。目前的治療方法已經(jīng)很大程度上改善患者的預(yù)后，但是癌細(xì)胞增殖迅速，為治療帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[9]。腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及敏感性抵抗仍然是當(dāng)前治療方法的局限性，所以研究CRC發(fā)病的分子機(jī)制，尋求靶向治療CRC的分子靶點(diǎn)具有重要意義。

圖11 流式細(xì)胞儀檢測(cè)高表達(dá)FSTL1部分恢復(fù)miR-142-3p對(duì)結(jié)直腸癌SW480凋亡的影響

圖12 MTT法檢測(cè)高表達(dá)FSTL1部分恢復(fù)miR-142-3p對(duì)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響

圖13 FSTL1、CyclinD1、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)條帶

表6 FSTL1高表達(dá)部分恢復(fù)miR-142-3p對(duì)抑制結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響（± s）

表6 FSTL1高表達(dá)部分恢復(fù)miR-142-3p對(duì)抑制結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響（± s）

注：與miR-con組比較，aP ＜ 0.05，與miR-142-3p+pcDNA-con組比較，bP ＜ 0.05

分組樣本量 FSTL1CyclinD1BaxBcl-2細(xì)胞增殖活力（OD 490 nm ）凋亡率（%）24 h48 h72 h miR-con組91.10±0.111.05±0.120.41±0.041.02±0.110.63±0.071.05±0.101.65±0.16 8.81±0.87 miR-142-3p組9 0.45±0.05a 0.36±0.05a 1.03±0.11a 0.40±0.04a0.58±0.06 0.77±0.08a 1.13±0.12a29.10±2.94a miR-142-3p+pcDNA-con組90.48±0.050.35±0.051.01±0.110.39±0.040.59±0.060.81±0.091.16±0.1228.21±2.82 miR-142-3p+pcDNA-FSTL1組9 0.88±0.09b 0.85±0.09b 0.75±0.08b 0.88±0.09b0.63±0.06 0.99±0.10b 1.68±0.17b 15.11±1.61b F值190.651217.644125.019217.3502.11525.73952.110239.831 P值＜ 0.05＜ 0.05＜ 0.05＜ 0.050.112＜ 0.05＜ 0.05＜ 0.05

隨著對(duì)miRNA研究的深入發(fā)現(xiàn)，一個(gè)miRNA可同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶基因，并被多個(gè)基因調(diào)控[10]。miRNA通過(guò)抑制靶基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和代謝等多個(gè)過(guò)程[11]。目前醫(yī)學(xué)界在治療腫瘤方面以siRNA及miRNA模擬物為主要靶向手段的治療方案?jìng)涫茚t(yī)學(xué)界的青睞。研究顯示，miR-142-3p在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。miR-142-3p通過(guò)下調(diào)TGFβ1表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲[12]。miR-142-3p靶向抑制FZD7表達(dá)降低宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[14]。miR- 142- 3p在CRC組織中低表達(dá)，與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，miR- 142- 3p在CRC細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，過(guò)表達(dá)miR-142-3p后，CyclinD1、Bcl-2蛋白水平顯著降低，Bax蛋白水平顯著升高，CRC細(xì)胞系SW480凋亡率顯著增加，細(xì)胞增殖活力顯著降低，放療敏感性顯著增加，提示miR-142-3p在結(jié)腸癌細(xì)胞中可能發(fā)揮抑癌基因的作用，提高放療敏感性。

FSTL1定位于3q13染色體，是一種分泌型糖蛋白，由308個(gè)氨基酸組成。研究報(bào)道，F(xiàn)STL1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，且耐藥性乳腺癌細(xì)胞系中FSTL1表達(dá)高于母細(xì)胞系[15-16]。本研究顯示，F(xiàn)STL1在CRC細(xì)胞系中呈高表達(dá)，與上述研究結(jié)果一致，提示FSTL1在結(jié)直腸CRC癌中的作用可能與上述研究相似。FSTL1在CRC組織中表達(dá)上調(diào)，體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FSTL1可以促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移、侵襲能力，縮短裸鼠生存時(shí)間[17-18]。Kudo-Saito等[19]報(bào)道稱，F(xiàn)STL1可促進(jìn)惡性腫瘤對(duì)骨組織的侵襲作用，是潛在的預(yù)防和治療腫瘤骨轉(zhuǎn)移的作用靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，抑制FSTL1的表達(dá)后，SW480細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白水平顯著降低，Bax蛋白水平顯著升高，細(xì)胞增殖活力顯著降低，提示抑制FSTL1的表達(dá)，可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-142-3p與FSTL1 3'UTR存在互補(bǔ)位點(diǎn)，能夠作用于其特異性序列。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示miR-142-3p可與FSTL1直接結(jié)合，Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證顯示miR-142-3p對(duì)FSTL1具有負(fù)性調(diào)控作用。在過(guò)表達(dá)miR-142-3p的細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染pcDNA-FSTL1，結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞中FSTL1、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高，Bax蛋白水平顯著降低，細(xì)胞增殖活力顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，提示過(guò)表達(dá)FSTL1可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-142-3p引起的促凋亡，抑制增殖作用。

綜上所述，本文初步探究了miR-142-3p、FSTL1在CRC中的作用，驗(yàn)證miR-142-3p靶向FSTL1基因，通過(guò)靶向FSTL1基因調(diào)控CRC細(xì)胞增殖、凋亡和放療敏感性。本研究不僅豐富了FSTL1在CRC中的作用，還為CRC分子靶向治療和放療敏感性研究提供線索。