張瑞華 楊海平 劉彬

鱗狀細胞癌（squamous-cell epithelioma，SCC）是發(fā)于上皮組織角質(zhì)細胞的非黑素性惡性腫瘤，常見于鱗狀上皮覆蓋區(qū)，皮膚癌多見，進展快，易轉(zhuǎn)移，以頭、面、手背和頸部居多，同時可見于口腔黏膜、外陰處[1]。SCC誘因較多，日光暴曬為主，長期接觸射線、砷劑或慢性熱損傷皆可誘發(fā)皮膚癌發(fā)生[2]。G 蛋白受體家族（G protein-coupled receptor，GPCRs）是信號及功能最強的蛋白基因家族，參與跨膜信號傳導(dǎo)，活化G蛋白受體可激活下游信號分子，調(diào)節(jié)第二信使產(chǎn)生，激活Ga亞基Gi類GPCRs抑制環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）產(chǎn)生；相反，激活Gs類GPCRs可促進cAMP生成，激活cAMP依賴蛋白酶[3]。因GPCRs強功能性特點，諸多藥物機制皆通過GPCRs發(fā)揮作用。G蛋白偶聯(lián)受體48（G protein coupled receptor 48，Gpr48）與GPCRs中富含亮氨酸重復(fù)片段糖蛋白激素受體高度同源，均通過cAMP依賴信號通路發(fā)揮作用，已被證實主要分布于皮膚表皮及附屬器官，在控制毛發(fā)發(fā)育、維持皮膚組織正常功能方面有重要作用[4-5]。但對其在SCC發(fā)生及進展中的作用及機制尚少見報道。鑒于此，本研究建立ShRNA感染SCC細胞株A431，降低內(nèi)源性Gpr48基因表達，構(gòu)建Gpr48基因敲除隱轉(zhuǎn)株，明確沉默Gpr48基因?qū)ζつwSCC的影響，為其治療提供依據(jù)。

材料與方法

一、實驗材料

1.細胞系：皮膚SCC細胞株A431（上海酶聯(lián)生物研究所）。

2.主要材料及試劑：Sh-Gpr48質(zhì)粒、ShRNANC質(zhì)粒、PMD2G質(zhì)粒、PSPAX2質(zhì)粒（上海北諾生物科技有限公司），Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR） 試劑盒（日本Takara公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶、谷氨酰胺（美國Hyclone公司），細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)板（美國Corning公司），細胞裂解液（radio immunoprecipitation assay，RIPA）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）δ抗體、Notch1抗體、NF-κB p65抗體、β-actin抗體（美國Sigma公司），Lipofectmin 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒（美國Invitrogen公司），RT-PCR反應(yīng)引物均由日本TaKaRa公司設(shè)計及合成（表1）。

3.主要儀器：激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），DM500型生物倒置顯微鏡（德國Leica公司），NanoDorp 2000核酸定量分析儀、PCR儀、CO2培養(yǎng)箱、紫外分光光度計（美國Thermo公司），恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、熒光掃膜成像儀（美國Bio-Rad公司），Transwell小室（美國BD公司）。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：取凍存A431細胞株，37 ℃水浴解凍3 min，250×g離心5 min，加3 ml培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿內(nèi)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，細胞擴張至培養(yǎng)皿90%時進行細胞傳代，移液器吸走培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）清洗，加胰蛋白酶消化液1 ml，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化，6 min后顯微鏡下觀察細胞變圓后終止消化，加入培養(yǎng)基，移液槍吹打，促細胞脫落，轉(zhuǎn)移細胞懸液至離心管內(nèi)，250×g離心5 min，吸上清，加培養(yǎng)基1 ml，細胞吹打，1 ： 3傳代，加入培養(yǎng)基8 ml混勻分裝，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。

表1 RT-PCR反應(yīng)各引物序列

2.建立Gpr48基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)株：設(shè)計干擾Gpr48表達shRNA（shRNA-Gpr48組）及陰性對照shRNA-NC組，構(gòu)建重組質(zhì)粒，PSPAX2為包裝質(zhì)粒，PMD2G為封皮質(zhì)粒，擴增純化，細胞匯合至90%開始轉(zhuǎn)染，3 μg shRNA + 2 μg PMDG + 3 μg PSPAX2質(zhì)粒混勻，無血清DMEM 0.5 ml稀釋，室溫放置，20 μl Lipofect min 2000經(jīng)0.5 ml無血清DMEM稀釋，室溫放置5 min，質(zhì)粒與Lipofect min 2000混勻，靜置20 min，移液槍滴入293T細胞內(nèi)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，5 h后棄上清，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后收集細胞培養(yǎng)上清液（病毒），4 ℃保存，293T細胞內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞培養(yǎng)液上清，分裝至eppendorf管內(nèi)，-20 ℃保存。將A431細胞接種于2個培養(yǎng)皿內(nèi)，細胞匯合率達50%～ 60%時開始病毒感染，培養(yǎng)皿內(nèi)加入shRNA-Gpr48病毒1.3 ml，培養(yǎng)皿內(nèi)加入shRNA-NC 1.3 ml作為陰性對照，混勻后37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，24 h后吸上清液，加新鮮培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，24 h后加含嘌呤霉素DMEM篩選存活細胞為感染病毒成功細胞，1個月后所篩選細胞為Gpr48基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

3. RNA提?。簊hRNA-Gpr48組與shRNA-NC組均取生長良好細胞接入培養(yǎng)皿，匯合率超過90%時采用Trizol試劑盒提取RNA，紫外分光度計測定純度、濃度滿意后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA溶液，體系（20 μl）：4 μl PBS×5+1 μl oligo DT+1 μl隨機6核苷酸引物+1 μl RNA溶液+1 μl逆轉(zhuǎn)錄酶+焦碳酸二乙酯水（diethyl pyrocarbonate，DEPC）補足。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，87 ℃ 5 s，- 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.定量RT-PCR反應(yīng)體系：12.5 μl SYBR+1 μl cDNA+上下游引物各0.5 μl+ddH2O 10.5 μl，定量PCR兩步法，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，之后40 個循環(huán)，95 ℃變性5 s，58 ℃退火延伸20 s，每次延伸階段獲取吸光度值，反應(yīng)結(jié)束后每秒升高0.5 ℃從65 ℃至95 ℃，PCR結(jié)束后拷貝各管Ct值，β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算p-PKCδ、NF-κB p65、Notch1 mRNA相對表達量。

5.蛋白印跡法（Western Blot）測定轉(zhuǎn)染后細胞蛋白表達：取基因敲除后生長良好細胞兩組接入培養(yǎng)皿，細胞匯合率超過90%后提取蛋白，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，加入三丙胺（three propylamine，TPA）溶液，另取同體積丙酮為陰性對照，刺激6 h后提取細胞蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，凝膠電泳，蛋白變性，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，結(jié)束后剪裁蛋白質(zhì)片段，加入Western封閉液室溫封閉1 h，加入稀釋一抗，4 ℃孵育1 h，PBS洗膜4次×10 min，加入稀釋二抗，棄PBS，避光孵育1 h，PBS洗滌3 次×10 min，X線曝光，顯影及定影，β-actin蛋白作為質(zhì)控內(nèi)對照，放射自顯影曝光，以灰度值比值表示各目的蛋白表達量，由灰度掃描Image J軟件產(chǎn)生數(shù)據(jù)。

6.細胞侵襲能力檢測：人工基膜稀釋液包被Transwell小室底部膜上室，無菌干燥（4 ℃），倒置，下室預(yù)涂纖維粘連蛋白10 mg/L，37 ℃靜止2 h，PBS洗滌1次，加入含10%血清培養(yǎng)基，加入A431細胞懸液，37 ℃培養(yǎng)24 h，棉簽擦拭膜上室細胞，置于90%乙醇固定0.5 h，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，清水洗凈，顯微鏡下觀察顯色情況，計算侵襲細胞占總細胞比例。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，Gpr48相對表達量，p-PKCδ、Notch1、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達，侵襲細胞率等數(shù)據(jù)以± s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、A431細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株Gpr48基因敲出效率

shRNA干擾SCC A341細胞株進行Gpr48基因敲除，RT-PCR顯示，轉(zhuǎn)染敲除Gpr48質(zhì)粒的shRNA-Gpr48組Gpr48相對表達量（0.27±0.06）低于shRNA-NC組（1.01±0.12），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 17.441，P＜ 0.01）。（圖1）

圖1 SCC A431細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株Gpr48基因敲出效率

二、 A431細胞Gpr48基因敲除后形態(tài)改變

體外培養(yǎng)A431細胞，shRNA-NC組細胞大，呈長梭形、細胞漿豐富，粘附強，成膜狀生長，傳代時不易消化，貼壁生長（圖2a）；Gpr48基因敲除后細胞生長速度略減慢，形態(tài)相似，細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，仍貼壁生長（圖2b）。

三、Gpr缺失表達對SCC A431細胞各基因表達的影響

TPA刺激后，shRNA-NC組、shRNA-Gpr48組p-PKCδ、NF-κB p65 mRNA上調(diào)，Notch1 mRNA表達降低，shRNA-Gpr48組p-PKCδ、NF-κB p65 mRNA低于shRNA-NC組（P＜ 0.05），Notch1 mRNA 高于shRNA-NC組（P＜ 0.05，表2）。

四、Gpr48缺失對SCC A431細胞各蛋白表達的影響

圖2 倒置顯微鏡下觀察兩組細胞形態(tài)（×400）

表2 Gpr48缺失對SCC A431細胞株各基因表達的影響（± s）

表2 Gpr48缺失對SCC A431細胞株各基因表達的影響（± s）

分組p-PKCδNotch1NF-κB p65 shRNA-NC組0.721±0.0740.562±0.0410.834±0.102 shRNA-Gpr48組0.463±0.0350.981±0.0370.631±0.079 t 值9.96623.9914.975 P值＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01

TPA刺激后，shRNA-NC組、shRNA-Gpr48組p-PKCδ、NF-κB p65蛋白表達上調(diào)，Notch1蛋白表達下調(diào)，shRNA-Gpr48組p-PKCδ、NF-κB p65蛋白泳道條帶灰度值低于shRNA-NC組，Notch1條帶灰度值高于shRNA-NC組，提示Gpr48敲除可抑制TPA刺激所引起的p-PKCδ、NF-κB p65蛋白表達上調(diào)及Notch1蛋白降低（圖3）。shRNA-Gpr48組p-PKCδ、NF-κB p65蛋白表達均低于shRNA-NC組（P＜ 0.05），Notch1蛋白表達高于shRNA-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，表3）。

五、Gpr48缺失對SCC A431細胞株侵襲能力的影響

shRNA-Gpr48組侵襲細胞率為（35.03±1.54）%，低于shRNA-NC組的（51.83±2.76）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 16.809，P＜ 0.01，圖4）。

圖3 Western Blot測定A431細胞各蛋白表達

表3 Gpr48缺失對SCC A431細胞株各蛋白表達的影響（± s）

表3 Gpr48缺失對SCC A431細胞株各蛋白表達的影響（± s）

分組p-PKCδNotch1NF-κB p65 shRNA-NC組0.292±0.0460.421±0.0760.636±0.051 shRNA-Gpr48組0.221±0.0340.524±0.0630.512±0.047 t 值3.9253.2995.653 P值＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01

圖4 Gpr48缺失對SCC A431細胞株侵襲能力的影響

討 論

Gpr48系GPCRs家族孤兒受體，由17個亮氨酸片段構(gòu)成，系配體胞外重要結(jié)合位點，目前尚未完全明確其功能，已被證實分布于皮膚表皮，控制毛發(fā)發(fā)育，可能在維持皮膚正常功能方面存在一定的作用[6-7]。主流觀點認為，Gpr48可通過激活Gα蛋白，激活腺苷?；罨傅认掠涡盘柗肿愚D(zhuǎn)導(dǎo)，促進cAMP合成[8-9]。但在皮膚癌中的機制尚未明確。報道指出，皮膚內(nèi)Gpr48定位于表皮區(qū)、毛囊根部靠髓質(zhì)區(qū)及皮脂腺祖細胞內(nèi)[10]。動物研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠Gpr48基因后表皮區(qū)無組織結(jié)構(gòu)及厚度改變，但毛囊數(shù)量減少、稀疏，排列紊亂[11]。Adham等[12]指出，出現(xiàn)上述現(xiàn)象原因與Sonic Hedgehog（Shh）信號介導(dǎo)反應(yīng)有關(guān)。前期研究證實，Gpr48基因敲除抑制小鼠表皮細胞分類及表皮異常增生，阻止癌變，且Gpr48敲除小鼠皮膚厚度正常，無明顯增厚征象，推測Gpr48缺失可抑制皮膚組織增生[13]。但對其抑制TPA所誘導(dǎo)皮膚癌的機制尚不明確。

PKC屬絲（蘇）氨酸酶家族成員，介導(dǎo)有絲分裂、細胞存活等多類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及傳遞，在GPCRs依賴細胞信號傳導(dǎo)及應(yīng)答方面有關(guān)鍵作用[14]。GPCRs作為最大膜受體蛋白家族，廣泛參與細胞增殖、分化和遷移等過程，其結(jié)構(gòu)特點及信號傳導(dǎo)特征可決定多類疾病治療靶向[15]。目前全球有超過70%藥物的開發(fā)均針對GPCRs研發(fā)[16]，故明確PKC與GPCRs的關(guān)系可能為皮膚癌治療提供新的藥物靶點。PKCδ為PKC亞家族成員，在人體組織內(nèi)廣泛表達，無明顯組織特異性[17]。郝玉琴等[18]發(fā)現(xiàn)GPCRs刺激磷脂酶Cβ（phospholipase C beta，PLCβ）可促成二酸甘油酯（glyceride dihydrate，DAG）生成，導(dǎo)致PKC激活、自動磷酸化、成熟及活化。但DAG半衰期短，存在蛋白酶體依賴性水解效應(yīng)，可快速釋放，促使PKC繼續(xù)游離、失活，維持正常生理代謝。而TPA可持續(xù)、高效激活PKC，維持PKC穩(wěn)定活化[19-20]。故為明確PKC與GPCRs家族成員Gpr48的關(guān)系，選取SCC A431細胞株，建立Gpr48基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)株，以TPA誘導(dǎo)，并檢測Gpr48缺失對SCC PKC活性的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)TPA誘導(dǎo)后，shRNA-Gpr48組細胞生長速度略減慢，出現(xiàn)空泡，同時shRNA-NC組PKCδ mRNA/蛋白表達均上升，而shRNA-Gpr48組PKC活化程度不及shRNA-NC組，PKCδ表達低于shRNA-NC組，提示Gpr48缺失可有效抑制TPA所致PKC活化。

也有學(xué)者指出，PKC與癌癥發(fā)生、進展及轉(zhuǎn)移信號傳遞皆有緊密聯(lián)系[21]。Notch-1同樣參與PKC通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其活化形式NICD系多條信號通路的交匯點，可調(diào)控PKC下游基因表達，上調(diào)p21Cp1，阻滯細胞周期于Go或G期，抑制原癌基因表達，促進細胞凋亡，目前已被證實在胰腺癌、胰腺癌、胃癌中均見Notch-1低表達[22-23]。發(fā)現(xiàn)沉默Cpr48基因，經(jīng)TPA刺激后，shRNA-Gpr48組Notch-1表達高于shRNA-NC組，考慮沉默Gpr48基因表達可抑制PKC活性上升，間接上調(diào)Notch-1表達，發(fā)揮抑癌作用。NF-κB p65則為具備多項調(diào)節(jié)功能的核轉(zhuǎn)錄因子，目前已被證實NF-κB p65活化可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達，強化腫瘤細胞侵襲、浸潤性[24]。朱文巍等[25]提出，NF-κB p65基因可活化PKC基因表達，介導(dǎo)癌細胞有絲分裂。沉默Gpr48基因后，NF-κB p65表達水平降低，考慮可能與沉默Gpr48可抑制TPA刺激所引起PKC活性上升，促進腫瘤細胞凋亡，降低癌細胞核因子轉(zhuǎn)錄。還發(fā)現(xiàn)沉默Gpr基因后A431細胞株侵襲能力降低，侵襲細胞比例降低，考慮Gpr48基因在SCC A431細胞株增殖、分化和侵襲過程中均存在重要作用，而沉默Gpr48基因表達，可降低SCC PKC活性，抑制腫瘤增殖及侵襲。

Gpr 48缺失可能通過抑制PKC活性及癌細胞侵襲，降低p-PKCδ、NF-κB p65表達，上調(diào)抑癌基因Notch-1表達，抑制TPA所誘導(dǎo)SCC發(fā)生及進展，有望作為皮膚SCC治療研究的新靶點。但對Gpr48基因沉默抑制TPA誘導(dǎo)PKC活性及腫瘤侵襲的確切機制有待進一步深化研究。