張鳳英，朱克永

(四川工商職業(yè)技術學院，四川 都江堰 611830)

隨著全球經濟的迅猛發(fā)展，“民以食為天”的思想伴隨著中國社會的小康生活快速、穩(wěn)定地發(fā)展，調味品的種類、數(shù)量都在不斷增加，醬油也從單一的散裝醬油、袋裝醬油、瓶裝醬油，從包裝的改進發(fā)展到生抽、老抽、低鹽醬油以及180 d發(fā)酵零添加醬油等，這都體現(xiàn)了我國人民群眾對食品安全與衛(wèi)生的要求進一步提高。根據(jù)食品安全國家標準的食品微生物學檢驗要求，對于大腸菌群如大腸桿菌[1]、埃希氏菌、沙門氏菌以及含有O157基因的菌都成為了必檢指標[2]。食物中大腸菌落的數(shù)量和密度也成為校驗產品是否合格的一個重要標準，李巖冰[3]通過對紹興地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵調味品(醬油、腐乳以及黃酒等)按照國家標準的要求進行微生物測定，結果表明：菌落總數(shù)、含O157:H7基因的大腸菌群超標主要出現(xiàn)在發(fā)酵調味品中。品牌與標準化雜志公布的國家質檢總局對豆類發(fā)酵制品(醬油、食醋、醬)的抽查結果發(fā)現(xiàn)了10種不合格產品，主要涉及的是菌落總數(shù)[4]，這說明檢測發(fā)酵調味品中的有害菌是十分必要的。大腸菌落主要寄居在動物、人類的糞便中，如果檢測結果超標，則意味著食物受到污染，不符合人民群眾的日常生活需求，不能達到市場流通的標準。我國根據(jù)市場和人民群眾的基本要求，根據(jù)國家標準GB 4789.3-2016，即每1 g(或者每1 mL)產品中，檢驗出的大腸桿菌數(shù)值(MPN)，需滿足不大于3 MPN的標準。但楊素霞[5]通過對全國部分地區(qū)市售的20份醬油樣品進行微生物學檢驗，結果表明樣品中存在的微生物主要是霉菌、酵母菌以及少量的有害芽孢桿菌，但是沒有檢測到大腸菌群。此結果對于檢測醬油中大腸菌群的可靠性和必要性都提出了質疑和相反的結論。

基于此，本文根據(jù)相關檢測案例、結果結合國家標準規(guī)定的方法探討檢測成品醬油中大腸菌群的研究方法、過程、結果、可靠性。

1 大腸菌群檢測案例與研究現(xiàn)狀

對成品醬油中的大腸桿菌檢測其實早已經開始了。2013年《中國調味品》報道的案例[6]：早在1974年，安徽省蕪湖市的一個衛(wèi)生防疫站就為當時收集到的100多份成品進行致病衛(wèi)生的檢測，包括大腸菌群、其他雜菌和致病菌，結果表明全部樣品均檢測有大腸菌落。檢測完的醬油樣品在37 ℃的恒溫箱環(huán)境下存放2個晝夜以后，卻發(fā)現(xiàn)大腸菌落的數(shù)量已經少到檢測不出[7]。在2012年以后，江蘇省淮陰縣的衛(wèi)生防疫站為了進一步探索實驗結果的可靠性，也對部分醬油產品展開了檢測。與蕪湖市的衛(wèi)生院相比，此次的檢測更加具有規(guī)范性，相關檢驗人員以含有不同氯化鈉濃度的醬油做比較，在相同的環(huán)境下，靜置這些醬油，并每隔5 h檢測醬油內部的大腸菌落數(shù)量一次，因為此舉更具有可靠性。檢測數(shù)據(jù)表明，隨著時間的增長，大腸桿菌菌落的數(shù)量逐漸減少，且醬油中NaCl越高，大腸菌群減少得速度越快，但同之前的案例結果一致的是：48 h是分界線，超過保留時間以后，工作人員無法檢測出大腸菌落了。

我國食品類輕工業(yè)在改革開放初期發(fā)展緩慢，技術革新較慢，安全衛(wèi)生工作起步較晚，尚有眾多亟待解決的問題。國家衛(wèi)生標準GB 2717-2003對醬油產品的大腸菌落數(shù)量有明確的要求：菌落總數(shù)不超過30000 CFU/mL；大腸菌群不超過30 MPN/dL。史夢雨[8]參照GB 14934-2016的規(guī)定，使用了液態(tài)產氣發(fā)酵培養(yǎng)法和紙片法測定消毒餐具中大腸菌群指標，結果表明兩種不同方法檢測的合格率相差1.01%左右，說明兩種方法檢測的準確性相當，但由于紙片法能夠節(jié)省時間，可以用于大量樣品檢測大腸菌群。朱素芬[9]則對比了平板計數(shù)法與測試紙片法對食物中大腸菌群的敏感性、準確率等，結果表明：測試紙片法檢出限更低，適合食品中大腸菌群污染的指示和分析。裴曉燕等[10]于2017年收集了全國31個省的預包裝醬油樣品，通過檢測其微生物污染情況，結果顯示個別醬油中耐鹽性菌超標，但大腸菌群檢出率在所有醬油中占比不到1%。醬油釀造時間成熟后需要加熱殺菌和增加成品醬油的風味和口感，檢出大腸桿菌很有可能是加熱溫度不夠或者加熱時間不足，但周家達認為只要醬油中食鹽含量較高(目前一般醬油中食鹽含量沒有硬性規(guī)定，一般為不少于18 g/dL)，非耐鹽性大腸桿菌不能在醬油中長期存活。

因企業(yè)必須在符合國家食品安全衛(wèi)生的規(guī)范下操作，這樣才能避免內部人員和物力的浪費，提升效率，最終實現(xiàn)經濟效益的進步。因此本文在原有研究的基礎上完善相應檢測，從耐鹽大腸菌落的角度出發(fā)，進一步對大腸菌群展開必要的質疑，提升國際標準檢測的意義。

2 實驗材料和方法

根據(jù)目前國家現(xiàn)行的GB/T 4789.22-2003要求，菌落總數(shù)測定按照GB/T 4789.2-2016執(zhí)行，大腸菌群測定按照GB/T 4789.3-2016執(zhí)行。本文所使用的大腸埃希氏菌的編號是ATCC8739，試管斜面保存在溫度為4 ℃的冰箱中，確保大腸埃希氏菌能夠正常地生存和繁衍，滿足實驗的基本要求，可以保證實驗研究結果的可靠性和價值性，與人們日常生活習慣和水平密切相關。檢測儀器的精密度高低，直接與檢測結果的準確度密切相關，因此為保證數(shù)據(jù)的可靠性，實驗人員選擇壓力滅菌鍋來降低其他菌種的影響，選擇超凈工作臺降低檢測難度，提升檢測的效率，滿足實驗的基本要求[11,12]。

由食品系生產的不含鹽的豆渣發(fā)酵液(醬油)，經過121 ℃，20 min處理后進行滅菌，分裝在250 mL三角瓶中，每瓶放125 mL。為保證大腸菌落生存的基本要求，培養(yǎng)基必不可少，綜合考慮培養(yǎng)基價格成本和耐久性，本實驗選擇月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯培養(yǎng)基，英文名縮寫為LST，符合大腸菌落的繁衍需求。除此之外，培養(yǎng)基還選擇煌綠乳糖膽鹽肉湯，英文名縮寫是BGLB，這兩種培養(yǎng)基混合使用，幾乎符合所有大腸桿菌的營養(yǎng)要求，且不會因為生存競爭問題而出現(xiàn)菌落數(shù)自主降低的情況，排除無關變量的干擾，降低偶然性帶來的影響。醬油鹽分高低控制選擇的是最簡單的氯化鈉，即NaCl，食用鹽的主要成分，安全可靠、操作簡單且成本低廉。

2.1 材料和配方

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST，g/L)：胰蛋白胨20 g、氯化鈉5 g、乳糖5 g、磷酸氫二鉀2.75 g、磷酸二氫鉀2.75 g、月桂基硫酸鈉0.1 g，將所有試劑放入2 L燒杯中，在電爐上加熱攪拌溶解于1000 mL蒸餾水中,待全部溶解后分裝到有倒立發(fā)酵管的20 mm×150 mm試管中， 每管10 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。接入樣品后在(36±1) ℃水浴培養(yǎng)(48±2) h，觀察生長以及產氣情況。

2.2 實驗方法

制作含鹽較低的醬油原汁(將黃豆蒸煮后搗碎，接入米曲霉，加入鹽水18%左右，待發(fā)酵成熟，將醬油原汁滅菌后加入蒸餾水，稀釋到所需含鹽量比例的無菌醬油汁)接入大腸埃希氏菌，觀察液體培養(yǎng)基中的產氣情況，將微產氣和不產氣試管中菌液接入平板培養(yǎng)計數(shù)，再通過革蘭氏染色法用高倍顯微鏡觀察和掃描電子顯微鏡(SEM)、熒光顯微鏡、假彩色透射電子顯微鏡觀察在低濃度食鹽和高濃度食鹽醬油中的形態(tài)，分別進行定性和定量分析，確保實驗結果準確。

3 實驗的主要措施手段

要保證實驗的正常開展，首先要確保大腸桿菌的基本生存情況，需要將早前存放在冰箱中的大腸桿菌及其菌落從冰箱中取出，接種到培養(yǎng)基以后，放在溫度37 ℃左右的恒溫環(huán)境中培養(yǎng)一段時間進行活化，因為這個溫度很接近人體溫度，在這種模擬人體環(huán)境的前提下，實驗結果才能更加具有現(xiàn)實意義。培養(yǎng)時間約48 h即可，大腸桿菌數(shù)量能保證在穩(wěn)定期，且菌體數(shù)穩(wěn)定。把大腸桿菌培養(yǎng)液均勻分在幾個試管中，再將這些培養(yǎng)液分別放置在濃度不同但溫度同為37 ℃的肉湯培養(yǎng)基中，反復培養(yǎng)以提升可靠性。最終選擇那些長期數(shù)量穩(wěn)定的一批次作為最后的檢測。大腸桿菌培養(yǎng)完成以后，就能展開后續(xù)的生存檢測，只要將培養(yǎng)液接種到預先準備的醬油中，控制醬油溶液中食鹽的濃度為2%、5%、7%、10%、12%、15%、20%、22%，分別放置在室溫下即可，因為日常使用醬油時，都是在室溫環(huán)境中，而非37 ℃的恒溫環(huán)境中。檢測人員在一段時間以后，就能對靜置的醬油展開大腸桿菌濃度分析，取樣調查即可，檢測方法與國家標準GB 4789.3-2010相同，操作合理規(guī)范。

4 實驗結果分析和統(tǒng)計

將大腸埃希氏菌放入含有不同濃度食鹽的醬油中進行培養(yǎng)，分別于24，48，72 h查看倒立管中是否有氣體存在，為驗證數(shù)據(jù)準確，在無氣體產生的醬油中挑取大腸埃希氏菌落在平板上過培養(yǎng)查看大腸菌群的菌落，大腸菌群多次誘導培養(yǎng)的結果見表1。

表1 耐鹽大腸菌落的培育數(shù)據(jù)Table 1 Cultivation data of salt-tolerant coliforms

由表1可知，隨著培養(yǎng)時間不斷延長，食鹽濃度不斷提升，大腸菌落的耐鹽性逐漸降低。

圖1 大腸埃希菌菌落特征Fig.1 Colony characteristics of Escherichia coli

醬油含鹽量為7%培育48 h溶液經過稀釋后在平板上培養(yǎng)48 h后生長的菌落圖見圖1，但是在10%濃度下培養(yǎng)48 h以上幾乎無菌落。

5% 和7%濃度醬油液體培養(yǎng)48 h后在高倍顯微鏡下觀察到的大腸埃希菌革蘭氏染色圖見圖2。

圖2 不同濃度醬油液體培養(yǎng)的革蘭氏染色顯微鏡觀察圖Fig.2 Gram staining microscopic observation by liquid culture of soy sauce with different concentration

由圖2可知，5%濃度培養(yǎng)液中菌體染色顏色較深，菌體粗大強壯，而7%濃度的培養(yǎng)液中染色很淺，菌體數(shù)明顯很少，活躍成功度較低。菌落的有無可以定性地看出菌落是否存活的標準，實驗結果也在一定程度上表明，大腸埃希氏菌的耐鹽性不能在短時間內獲得，菌體的繁殖與鹽分及培育時間密切相關，高濃度食鹽對大腸埃希氏菌具有抑制作用。醬油產品生產、罐裝、銷售以及保藏都是在室溫條件下，在室溫下的大腸菌接種大腸菌數(shù)據(jù)結果見表2。

表2 4 h和12 h后的大腸菌落數(shù)Table 2 Colony number of coliforms after 4 h and 12 h

由表2可知，鹽分濃度超過19 g/dL時，即使大腸菌落具有較強的耐鹽性，也不能長時間生存。且即使?jié)舛炔⑽闯^19 g/dL，時間達到24 h以后，菌落也無法生存。

圖3 不同濃度醬油液體培養(yǎng)的菌體假彩色透射電子顯微鏡觀察圖Fig.3 Pseudo-color transmission electron microscopic observation of bacteria by liquid cultured of soysauce with different concentration

不同濃度醬油的大腸埃希菌的假彩色透射電子顯微鏡觀察圖見圖3。

綠色的菌體是正常狀態(tài)下的菌體，細胞壁較厚，較為明顯的擬核，右圖是在18%濃度醬油中培養(yǎng)24 h的菌體圖，內容物已經外滲，擬核變大、瀕臨破碎，由圖3可知，大腸埃希氏菌對中低濃度的鹽溶液耐受性很差，這同前人對于大腸菌群耐鹽的研究結果一致。

圖4 不同濃度醬油液體培養(yǎng)的菌體電子顯微鏡(SEM)觀察圖Fig.4 SEM observation of bacteria by liquid cultured of soysauce with different concentration

而通過掃描隧道電子顯微鏡觀察到的正常培養(yǎng)條件下菌體長度均一，飽滿，生物量大；圖4中右圖為10%濃度下培養(yǎng)24 h的醬油汁中單場菌群SEM圖，超過10%含鹽量的醬油汁中難以觀察到成型的大腸菌群形態(tài)。

日常的食用醬油，都是經歷長時間的釀造和暴曬工序，而且為了提高滋味、口感，食鹽的添加量不少于18 g/dL,大腸菌無法保證基本的存活要求。成熟醬油基本都能接近食鹽飽和的濃度，章志超[13]通過測定市售醬油中的不同指標發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在不同級別的醬油中失活速率不同，而且溫度也能影響其失活。黃文彪等[14]測定了同種大腸桿菌在老抽、生抽醬油中的存活時間，在老抽醬油中存活時間較長，約為2～4 d。

根據(jù)實驗結果可以得出以下結論：大腸菌并沒有很強的耐鹽能力，所以醬油生產商只要確保必要的鹽分濃度，就能在很大程度上降低大腸菌落的負面影響，從根本上杜絕大腸菌的生存。不僅如此，即使大腸菌的生存條件已經得知，醬油生產商依舊需要按照國家制定的基本標準，對即將流通于市場的醬油展開抽查工作，確保其有關菌落濃度均在合理的范圍內，對人體健康絕對無害，這樣才能適應當下可持續(xù)發(fā)展的基本目標，落實以人為本的理念，實現(xiàn)經濟效益、生態(tài)效益與社會效益和諧統(tǒng)一的關系，也能夠確保企業(yè)在越發(fā)激烈的市場上有核心競爭力。簡言之，醬油生產必須符合國家有關質量標準規(guī)范，將于2019年12月21日開始實施的新的國家標準GB 2717-2018、GB 8953-2018都已經對正在實施的國標進行了調整，尤其根據(jù)很多研究者對醬油產品的研究成果對微生物尤其對現(xiàn)行的GB 2717-2003微生物指標進行了調整：菌落總數(shù)(CFU/mL)由原來的不超過30000變更為按照GB 4789.2-2016的方法檢測結果需要低于菌落總數(shù)(CFU/mL)n：5、c：2、m：5×103、M：5×104。對大腸菌群的檢測指標變化最大由原來的30 MPN/dL變更為：參照GB 4789.3-2016平板計數(shù)法檢出的指標需要符合大腸菌群(CFU/mL)n：5、c：2、m：10、M：102。但是醬油的基本質量檢查工作必不可少，確保醬油不受霉菌、腐敗酵母的污染，才能讓合格產品流入市場，否則檢測工作就失去了它基本的意義和價值，而對于檢測大腸菌群根本沒有推崇的必要，值得引起有關人士的重視，并展開適度的完善工作。

5 結論

醬油產品檢測相關的實驗，隨著時間的不斷推移而逐步完善，近幾年來更是取得了突飛猛進的進步，質量檢測結果和方法都進一步完善，與人們生產生活的契合度提升效果明顯，穩(wěn)中有進。所以醬油在生產過程中，一定要按照規(guī)范進行，嚴格控制溫度，普通消費者在食用的過程中，也要增強自己的信心，不用過分擔心大腸菌群問題。