許菊

【摘 要】目的對潔凈室沉降菌監(jiān)測中可能影響微生物生長的各種因素進行試驗分析，找出一種行之有效的操作方法。方法按《中國藥典》四部9205要求對潔凈室沉降菌進行監(jiān)測。結果培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基的量、沉碟暴露時間、沉降碟放置位置對最終監(jiān)測結果均有一定影響。結論對潔凈室進行沉降菌監(jiān)測時應綜合考慮各種因素的影響，以得到最客觀的監(jiān)測結果。

【關鍵詞】潔凈室；沉降菌；影響因素

醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法（G B/T 1 6 2 9 4一20 1 0）中規(guī)定，動態(tài)測試時，培養(yǎng)皿的暴露時間為不大于如，《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》G M（P 2 01O年修訂版）、歐盟EUC G M P、美國F D AC G M P中沉降菌的測試合格標準均以如為單位時間衡，但是均規(guī)定，培養(yǎng)皿暴露時間不得超過如，即考慮到培養(yǎng)皿隨著放置時間的延長其培養(yǎng)基會因為失水等原因影響微生物正常生長。

一、潔凈室的微生物檢測

近年修訂藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（衛(wèi)生部令第79號）附錄1中第十一條：應當對微生物數(shù)進行動態(tài)監(jiān)測，評估無菌生產(chǎn)的微生物狀況。監(jiān)測方法有沉降菌、定量空氣浮游菌、表面取樣法[2]。因為浮游菌監(jiān)測需要浮游菌檢測儀，并且每次檢測前，還需將浮游菌檢測儀的采樣上蓋做滅菌處理，較沉降菌檢測方法繁瑣。因此，大多數(shù)藥品生產(chǎn)廠家在日常監(jiān)測潔凈室空氣中的微生物時，因?qū)嶋H操作比較方便的沉降菌檢測法使用的頻率較高。

二、沉降菌的檢測

國內(nèi)藥品企業(yè)沉降菌的日常檢測按G B/T l6294—2010《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的檢測方法》檢測，但潔凈室的平均菌落數(shù)必須低于所選定的評定標準。沉降菌檢測除操作方便外，又具有費用低、對空氣環(huán)境破壞小，特別是在具有層流的區(qū)域，不會干擾氣流的方向，因而在潔凈區(qū)的環(huán)境監(jiān)測中應用廣泛，。

三、儀器、設備與材料

1.儀器。全自動數(shù)顯恒溫鼓風干燥箱；全自動數(shù)顯生化培養(yǎng)箱；全自動數(shù)顯立式蒸汽滅菌器；生物安全柜；滅菌刻度吸管、試管、Q 90 mm×15 mm培養(yǎng)皿等。

2.設備。標準潔凈室，T：18～26℃，RH：45%～65%。

3.培養(yǎng)基。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；沙氏葡萄糖瓊液體養(yǎng)基。所有制備好的培養(yǎng)基均照《中國藥典》2015年版（四部）1421“滅菌法”操作，在121℃滅菌20 min。

4.驗證試驗用菌種。金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）（10104）]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）（63501）]、白色念珠菌[CMCC（F）（98001）]、黑曲霉菌[CMCC（F）（98003）。所有實驗用菌種均為第三代。

四、方法

1.菌液制備。取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1 mL分別加至9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋成相應濃度且含菌數(shù)小于100 cfu/mL的菌懸液備用。取經(jīng)20～25℃培養(yǎng)2～3 d的白色念珠菌的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1 mL，加入9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至相應濃度且含菌數(shù)小于100 cfu/mL的菌懸液備用。取經(jīng)20～25℃培養(yǎng)5～7 d的黑曲霉菌的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)物，加2 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，洗下孢子，轉移至另一空管，取1 mL加至9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋成相應濃度且含孢子數(shù)小于100 cfu/mL的孢子懸液備用。

2.方法驗證。培養(yǎng)基適用性檢查：每次均以兩個平皿在操作臺暴露4 h作為陰性對照。（1）培養(yǎng)基失重情況考察（單位：g）。①取制備好的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟（培養(yǎng)基量30 mL）先在30～35℃常規(guī)預培養(yǎng)48 h后在潔凈室動態(tài)環(huán)境下暴露4 h，再依法培養(yǎng)。②取制備好的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟（培養(yǎng)基量30 mL）以雙層透明無菌袋包裝燙封后先在30～35℃預培養(yǎng)48 h后，在潔凈室動態(tài)環(huán)境下暴露4 h，再依法培養(yǎng)。（2）培養(yǎng)基量對微生物生長的影響。依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟45個（培養(yǎng)基加入量分別為：20、30、40 mL各15個），以雙層透明無菌袋包裝燙封后在30～35℃培養(yǎng)48 h，無菌生長。在潔凈室操作臺均勻放置，動態(tài)暴露4 h后，取不同培養(yǎng)基量的沉降碟分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養(yǎng)2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌液的，于20～25℃培養(yǎng)5 d。點計菌落數(shù)，取平均值計算比值。（3）暴露時間對微生物生長的影響。依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟60個（培養(yǎng)基加入量30 mL）以雙層透明無菌袋包裝燙封后在30～35℃培養(yǎng)48 h，無菌生長。分成4組，每組15個，在潔凈室操作臺均勻放置，動態(tài)暴露時間分布為1、2、3、4 h，取不同暴露時間的沉降碟分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養(yǎng)2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培養(yǎng)5 d。點計菌落數(shù)，取平均值計算比值。結（4）培養(yǎng)方式對微生物生長的影響。①培養(yǎng)方式1：常規(guī)培養(yǎng)。依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟15個（培養(yǎng)基加入量30 mL）以雙層透明無菌袋包裝燙封后在30～35℃培養(yǎng)48 h，無菌生長。在潔凈室操作臺均勻放置，動態(tài)暴露4 h后，分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養(yǎng)2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培養(yǎng)5 d。點計菌落數(shù)，取平均值計算比值。

3.討論。（1）培養(yǎng)基失重情況考察。因為采用的沉降碟不是終端滅菌，制備好后要100%進行預培養(yǎng)。常規(guī)預培養(yǎng)后依法操作，培養(yǎng)基總失重平均占比情況（失重率%）。說明采用密封預培養(yǎng)能明顯減少預培養(yǎng)過程中的水分損失，同時在沉降菌監(jiān)測中沉降碟不應放置于通風口附近。因為不同潔凈室或生產(chǎn)車間環(huán)境條件不一樣，受溫度濕度及層流的風速的影響，培養(yǎng)基失重數(shù)據(jù)會有一定波動。（2）培養(yǎng)基量干擾培養(yǎng)結果。培養(yǎng)基為20、30、40 mL驗證測得比值均在0.5～2范圍內(nèi)。但培養(yǎng)基量以30～40 mL為宜；20 mL量較少，水份損失后對微生物生長有一定影響，例如銅綠假單胞菌，比值僅為0.59；實際操作時不可能采用量器加培養(yǎng)基，加量不會很精準，多于40 mL已接近培養(yǎng)皿上沿，操作不當可能導致培養(yǎng)基溢出，同時黑曲霉培養(yǎng)5 d后已生成較為豐富的菌絲，如接觸皿蓋，造成計數(shù)困難，且孢子一旦逸出則會導致嚴重的環(huán)境污染。

隨著我國藥品G M PS U度的發(fā)展，對藥品生產(chǎn)中潔凈室控制的要求越來越高，醫(yī)藥生產(chǎn)潔凈室屬于一般生物潔凈室，主要控制有生命的微粒兼塵埃微粒對產(chǎn)品的污染。藥廠應自覺按照G M P的要求，對潔凈區(qū)域制定系統(tǒng)的環(huán)境監(jiān)測方案，以有代表性的、準確的數(shù)據(jù)評價環(huán)境的微生物分布情況，判定潔凈區(qū)環(huán)境是否處于良好的受控狀態(tài)下運行。要做到這些，正確的方法是關鍵性的。

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（作者單位：天津津環(huán)醫(yī)凈空氣檢測技術有限公司）