汪蕾 張秀霞 王冬梅 李軍濤 魯耀鵬 鄭佩華 冼健安

摘要：【目的】明確β-1，3-葡聚糖對(duì)紅螯螯蝦血細(xì)胞免疫力的影響，為開(kāi)發(fā)β-1，3-葡聚糖作為紅螯螯蝦飼料免疫增強(qiáng)劑提供理論依據(jù)。【方法】向紅螯螯蝦注射不同劑量（1和5 μg/g）的β-1，3-葡聚糖，以注射生理鹽水為對(duì)照，于注射后的0、6、12、24和48 h采集紅螯螯蝦的血淋巴，測(cè)定血細(xì)胞總數(shù)（THC）、活性氧（ROS）含量、一氧化氮（NO）含量、非特異性酯酶活力、吞噬活力及血清酚氧化酶（PO）活力。【結(jié)果】β-1，3-葡聚糖可刺激紅螯螯蝦血細(xì)胞THC、ROS和NO含量、酯酶和血清PO活力顯著提高（P<0.05，下同），注射5 μg/g的β-1，3-葡聚糖劑量還可顯著提高血細(xì)胞的吞噬活力;β-1，3-葡聚糖對(duì)各類(lèi)免疫應(yīng)答的影響存在一定的劑量和時(shí)間效應(yīng)，THC、ROS含量、NO含量及血清PO活力對(duì)β-1，3-葡聚糖的刺激更敏感;ROS含量、酯酶活力和血清PO活力呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，其指標(biāo)達(dá)峰值時(shí)，處理時(shí)間在24.72～28.20 h范圍內(nèi)?！窘Y(jié)論】注射β-1，3-葡聚糖能提高紅螯螯蝦的循環(huán)血細(xì)胞數(shù)量及其細(xì)胞免疫力，表明β-1，3-葡聚糖可開(kāi)發(fā)為紅螯螯蝦飼料免疫增強(qiáng)添加劑。

關(guān)鍵詞： 紅螯螯蝦;β-1，3-葡聚糖;血細(xì)胞;免疫刺激;流式細(xì)胞術(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)： S968.22? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）04-0883-08

Abstract：【Objective】Effects of β-1，3-glucan injection on immunity of haemocytes of Cherax quadricarinatus were studied. It provided reference for developing β-1，3-glucan as an? immunopotentiator for C. quadricarinatus. 【Method】C. quadricarinatus were injected with different doses（1 and 5 μg/g） of β-1，3-glucan， physiological saline injection was as control， and haemolymph of C. quadrciarinatus were obtained after 0， 6， 12， 24 and 48 h injection， and then total haemocyte count（THC）， reactive oxygen species（ROS） production， nitric oxide（NO） production， non-specific esterase activity， phagocytic activity and plasmic phenoloxidase（PO） activity of haemocytes were determined. 【Result】β-1，3-glucan injection would significantly induce the improvements of THC， ROS and NO productions， activities of esterase and plasmic PO（P<0.05， the same below）. Moreover， β-1，3-glucan at dose of 5 μg/g also significantly induced the phagocytic activity of haemocytes. Effects of β-1，3-glucan on immune responses of C. quadricarinatus haemocytes were dose-dependent and time-dependent. THC， ROS and NO productions and plasmic PO activity were more sensitive to β-1，3-glucan stimulation. ROS production， activities of esterase and plasmic PO rose firstly and then dropped. The elapsed time was between 24.72-28.20 h when these three indicators reached their peaks. 【Conclusion】β-1，3-glucan injection can increase the number of circulating haemocytes and improve their cellular immunity of C. quadricarinatus， indicating that β-1，3-glucan can be developed to be an immunopotentiator for C. quadricarinatus.

Key words： Cherax quadricarinatus; β-1，3-glucan; haemocyte; immunostimulation; flow cytometry

0 引言

【研究意義】紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）原產(chǎn)于澳大利亞，20世紀(jì)90年代開(kāi)始引入我國(guó)試養(yǎng)，因其出苗量少、蝦苗價(jià)格貴等原因，尚未得到大規(guī)模推廣養(yǎng)殖，而逐漸淡出了我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。近年來(lái)，由于對(duì)蝦病害頻發(fā)、養(yǎng)成率低下，而紅螯螯蝦因出肉率高、生長(zhǎng)快、適應(yīng)性強(qiáng)、味道鮮美等優(yōu)點(diǎn)，成為部分養(yǎng)殖戶(hù)的替代養(yǎng)殖品種。目前紅螯螯蝦的人工養(yǎng)殖技術(shù)仍處于起步階段，急需營(yíng)養(yǎng)飼料、病害防控等研究成果為其規(guī)?；l(fā)展提供技術(shù)支撐。水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害頻發(fā)是導(dǎo)致養(yǎng)殖失敗的主要原因，因此，研制適宜的免疫增強(qiáng)劑，安全高效地提高水產(chǎn)動(dòng)物自身的免疫力和抗病力，從而減少用藥，對(duì)生產(chǎn)無(wú)毒害殘留的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品具有重要現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】β-1，3-葡聚糖是目前公認(rèn)的在眾多水產(chǎn)動(dòng)物上具有顯著作用的免疫刺激劑（王超和王敏奇，2010;王銀東和何吉祥，2014;劉露等，2017）。飼料添加β-1，3-葡聚糖能顯著提高凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的過(guò)氧化氫酶（CAT）活力、溶菌酶活力、酚氧化酶（PO）活力等非特異性免疫功能（劉立鶴等，2005;楊福剛等，2005;趙紅霞等，2010）。飼料中添加400和600 mg/kg的β-1，3-葡聚糖能顯著提高花鱸（Lateolabrax japonicus）的抗氨氮脅迫能力（吳春玉等，2013）。在原代培養(yǎng)的凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞培養(yǎng)液中添加β-1，3-葡聚糖或其衍生物，均能顯著提高PO活力和呼吸爆發(fā)活力（白楠等，2014）。此外，在飼料中添加0.2% β-1，3-葡聚糖可提高虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的生長(zhǎng)性能并改變其部分血液生理指標(biāo)（王藝等，2018）;向大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）腹腔注射濃度5 mg/kg的β-1，3-葡聚糖0.1 mL，可顯著降低低氧脅迫下的丙二醛（MDA）含量，提高抗氧化酶的活力與基因表達(dá)水平（王永紅等，2018）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前以注射β-1，3-葡聚糖的試驗(yàn)方式，并通過(guò)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）分析血細(xì)胞免疫響應(yīng)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)分析β-1，3-葡聚糖注射對(duì)紅螯螯蝦血細(xì)胞免疫功能的影響，探討β-1，3-葡聚糖作為紅螯螯蝦免疫增強(qiáng)劑的可行性，為開(kāi)發(fā)紅螯螯蝦的安全高效飼料免疫增強(qiáng)劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

紅螯螯蝦購(gòu)自廣州市黃沙水產(chǎn)交易市場(chǎng)，平均體重19.41±3.54 g/尾，在廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)環(huán)境條件下進(jìn)行暫養(yǎng)。養(yǎng)殖水體環(huán)境條件：pH 7.9～8.0，溫度（24±2）℃，一直保持曝氣，并進(jìn)行循環(huán)過(guò)濾。暫養(yǎng)適應(yīng)一周后，選取健康無(wú)病患、附肢完整、處于蛻皮間期的螯蝦進(jìn)行試驗(yàn)。β- 1，3-葡聚糖、SYBR Green I、DCFH-DA、DAF-FM DA和二乙酸熒光素（FDA）均購(gòu)自Sigma公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1. 2. 1 β-1，3-葡聚糖注射 β-1，3-葡聚糖以生理鹽水（0.85% NaCl）配制成濃度為1和5 μg/g的工作液。試驗(yàn)用紅螯螯蝦分為3組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行20尾。分別按1和5 μg/g（以蝦體重?fù)Q算注射量）的劑量進(jìn)行腹節(jié)注射，對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1. 2. 2 血細(xì)胞懸液制備 于注射后0、6、12、24和48 h分別取樣。用2.5 mL一次性注射器吸取600 μL預(yù)冷的抗凝劑（葡萄糖20.5 g/L，檸檬酸鈉8 g/L，氯化鈉4.2 g/L，pH 7.5），在紅螯螯蝦的圍心腔抽取血淋巴，以預(yù)冷的抗凝劑將血淋巴中的細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106個(gè)/mL，用于FCM檢測(cè)。每尾紅螯螯蝦的血細(xì)胞懸液作為一個(gè)單獨(dú)樣品進(jìn)行分析。

1. 3 血細(xì)胞指標(biāo)測(cè)定

1. 3. 1 血細(xì)胞總數(shù)（Total haemocyte count，THC）

各組試驗(yàn)分別取血細(xì)胞懸液200 μL，加入終濃度為10×的SYBR GreenI（原液濃度10000×），室溫條件下遮光孵育60 min，再用200目篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀（品牌BD，型號(hào)FACSCalibur）進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)熒光強(qiáng)度的差異劃分完整細(xì)胞區(qū)域和細(xì)胞碎片區(qū)域，每個(gè)樣品上樣時(shí)間為1 min，分析并記錄完整細(xì)胞區(qū)域的細(xì)胞個(gè)數(shù)，每個(gè)樣品上樣記錄3次。THC根據(jù)冼健安等（2015）的方法進(jìn)行計(jì)算。

1. 3. 2 活性氧（Reactive oxygen species，ROS）含量 以DCFH-DA作為ROS的特異性熒光染料分析ROS含量（冼健安等，2012）。取血細(xì)胞懸液200 μL，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA進(jìn)行標(biāo)記，室溫條件下遮光孵育30 min，再用200目篩網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品獲取10000個(gè)細(xì)胞數(shù)據(jù)。結(jié)果以DCF熒光強(qiáng)度（FL1）為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的直方圖顯示，分析胞內(nèi)DCF平均熒光強(qiáng)度，胞內(nèi)DCF平均熒光強(qiáng)度與ROS含量呈正比。

1. 3. 3 一氧化氮（NO）含量 以DAF-FM DA作為NO的特異性熒光染料分析NO含量（Xian et al.，2013）。取血細(xì)胞懸液200 μL，加入終濃度為10 μmol/L的DAF-FM DA進(jìn)行標(biāo)記，室溫條件下遮光孵育60 min，再用200目篩網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品獲取10000個(gè)細(xì)胞數(shù)據(jù)。結(jié)果以DAF-FM熒光強(qiáng)度（FL1）為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的直方圖顯示，分析胞內(nèi)DAF-FM平均熒光強(qiáng)度，胞內(nèi)DAF-FM平均熒光強(qiáng)度與NO含量呈正比。

1. 3. 4 非特異性酯酶活力 采用FDA作為熒光探針測(cè)定非特異性酯酶活力。取血細(xì)胞懸液200 μL，加入終濃度為5 μmol/L的FDA進(jìn)行標(biāo)記，室溫條件下遮光孵育30 min，再用200目篩網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品獲取10000個(gè)細(xì)胞數(shù)據(jù)。結(jié)果以FDA熒光強(qiáng)度（FL1）為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的直方圖顯示，分析胞內(nèi)FDA平均熒光強(qiáng)度，胞內(nèi)FDA平均熒光強(qiáng)度與非特異性酯酶活力呈正比。

1. 3. 5 吞噬活力 以人工熒光微球（Fluorospheres? carboxylate-modified microspheres，黃綠色熒光，直徑1 μm，Molecular Probes，Invitrogen）作為被吞噬物。取血細(xì)胞懸液400 μL，加入10 μL濃度為微球原液1/10的微球稀釋液，室溫條件下遮光孵育1 h，再用200目篩網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品獲取10000個(gè)細(xì)胞數(shù)據(jù)。結(jié)果以FL1熒光量為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的直方圖顯示，吞噬3個(gè)或以上熒光微球的血細(xì)胞定義為吞噬陽(yáng)性的細(xì)胞，劃定該細(xì)胞區(qū)域，計(jì)算該區(qū)域細(xì)胞比例，即為吞噬率。

1. 3. 6 血清PO活力 以L(fǎng)-DOPA為特異性底物測(cè)定PO活力（Huang et al.，2010）。分別取30～50 mL血清，與800 mL L-DOPA[用0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.6）配制，磷酸鉀緩沖液為38.1 mL 1 mol/L的K2HPO4+61.9 mL 1 mol/L的KH2PO4]充分混合，立刻讀取490 nm波長(zhǎng)下的光密度值，每10 s讀數(shù)一次，共讀數(shù)120 s。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以考馬斯亮藍(lán)G-250為染色劑進(jìn)行染色，在595 nm處比色測(cè)定蛋白含量。PO活性單位定義：1 mg蛋白每分鐘OD490增加0.001為一個(gè)PO活力單位（U/mg）。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析和二次曲線(xiàn)回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 β-1，3-葡聚糖注射對(duì)紅螯螯蝦THC的影響

由圖1可知，紅螯螯蝦的初始THC為8.85×106個(gè)/mL;葡聚糖注射劑量為1 μg/g時(shí)，與注射生理鹽水的對(duì)照相比，紅螯螯蝦的THC在注射β-1，3-葡聚糖后6和12 h均表現(xiàn)出顯著升高趨勢(shì)（P<0.05，下同），隨后恢復(fù)至正常水平;葡聚糖注射劑量為5 μg/g時(shí)，紅螯螯蝦的THC在注射后48 h內(nèi)均顯著高于對(duì)照，最高值出現(xiàn)在注射后6 h，達(dá)16.33×106個(gè)/mL。

2. 2 β-1，3-葡聚糖注射對(duì)紅螯螯蝦血細(xì)胞ROS含量的影響

由圖2可知，葡聚糖注射劑量為1 μg/g時(shí)，紅螯螯蝦血細(xì)胞的ROS含量在注射后6和12 h顯著提高，注射后24 h降回到正常水平;葡聚糖注射劑量為5 μg/g時(shí)，紅螯螯蝦血細(xì)胞的ROS含量在注射后48 h內(nèi)均顯著高于對(duì)照，最高值出現(xiàn)在注射后12 h，約為對(duì)照的3.55倍?？梢?jiàn)，在5 μg/g的葡聚糖注射劑量下，紅螯螯蝦血細(xì)胞的ROS含量呈現(xiàn)明顯的先升高后下降變化趨勢(shì)，對(duì)該劑量下的處理時(shí)間與ROS含量變化進(jìn)行二次曲線(xiàn)回歸分析，得出ROS含量達(dá)峰值時(shí)的處理時(shí)間為24.72 h（圖3）。

2. 3 β-1，3-葡聚糖注射對(duì)紅螯螯蝦血細(xì)胞NO含量的影響

由圖4可看出，葡聚糖注射劑量為1 μg/g時(shí)，紅螯螯蝦血細(xì)胞的NO含量在注射后6 h急劇升高，約為對(duì)照的2.22倍，在注射12 h后逐漸恢復(fù)至正常水平;葡聚糖注射劑量為5 μg/g時(shí)，紅螯螯蝦血細(xì)胞的NO含量在注射后6 h急劇升高至最高值，約為對(duì)照的2.68倍，在注射后12 h開(kāi)始急劇下降，但仍高于對(duì)照，注射后24 h恢復(fù)至正常水平。

2. 4 β-1，3-葡聚糖注射對(duì)紅螯螯蝦血細(xì)胞非特異性酯酶活力的影響

由圖5可看出，葡聚糖注射劑量為1 μg/g時(shí)，紅螯螯蝦血細(xì)胞的酯酶活力在注射后12和24 h顯著升高，在注射后48 h下降至正常水平;葡聚糖注射劑量為5 μg/g時(shí)，紅螯螯蝦血細(xì)胞的酯酶活力在注射后12～48 h顯著高于對(duì)照，在12 h時(shí)達(dá)最高值?？梢?jiàn)，酯酶活力呈現(xiàn)明顯的先升高后下降變化趨勢(shì)，經(jīng)二次回歸分析得出，注射1和5 μg/g葡聚糖時(shí)，螯蝦血細(xì)胞酯酶活力達(dá)峰值的處理時(shí)間分別為26.45和26.88 h（圖6）。

2. 5 β-1，3-葡聚糖注射對(duì)紅螯螯蝦血細(xì)胞吞噬活力的影響

由圖7可看出，在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，注射1 μg/g葡聚糖對(duì)紅螯螯蝦血細(xì)胞吞噬活力無(wú)顯著影響（P>0.05）;葡聚糖注射劑量為5 μg/g時(shí)，血細(xì)胞吞噬活力在注射后6和12 h顯著提高，并在注射后12 h達(dá)最高值，吞噬率為32.6%。

2. 6 β-1，3-葡聚糖注射對(duì)紅螯螯蝦血清PO活力的影響

由圖8可看出，葡聚糖注射劑量為1 μg/g時(shí)，紅螯螯蝦血清PO活力在注射后6和12 h顯著高于對(duì)照，在注射后24和48 h恢復(fù)至正常水平;葡聚糖注射劑量為5 μg/g時(shí)，血清PO活力在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中均顯著高于對(duì)照，最高值出現(xiàn)在注射后24 h。在注射5 μg/g葡聚糖的處理下，血清PO活力呈明顯的先升高后下降變化趨勢(shì)，以處理時(shí)間與血清PO活力變化進(jìn)行二次回歸分析，得出血清PO活力達(dá)峰值時(shí)的處理時(shí)間為28.20 h（圖9）。

3 討論

3. 1 β-1，3-葡聚糖對(duì)蝦類(lèi)THC的影響

蝦類(lèi)的免疫防御依賴(lài)于其先天性免疫，血細(xì)胞在細(xì)胞免疫和體液免疫過(guò)程中均扮演著重要角色（Johansson et al.，2000），因此，THC常作為衡量蝦類(lèi)免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)。環(huán)境脅迫（Cheng and Chen，2001;Xian et al.，2010）、病原體感染（Li et al.，2008;Ji et al.，2009;Xian et al.，2016）等因素均會(huì)導(dǎo)致循環(huán)血細(xì)胞數(shù)量的減少，THC下降是免疫力和抗病力低下的一個(gè)重要體現(xiàn)。β-1，3-葡聚糖是水產(chǎn)配合飼料中較常用、免疫刺激效果較顯著的一種飼料添加劑（王銀東和何吉祥，2014）。在飼料中添加β-1，3-葡聚糖可顯著提高對(duì)蝦的THC，從而提高其免疫力和抗病力。我國(guó)對(duì)蝦（Penaeus chinensis）的相關(guān)研究顯示，注射β-1，3-葡聚糖48 h后，對(duì)蝦的THC提高了52.0%（汪小鋒等，2005）。本研究對(duì)紅螯螯蝦進(jìn)行β-1，3-葡聚糖肌肉注射，結(jié)果顯示其THC顯著升高，且存在一定的劑量效應(yīng)。當(dāng)注射劑量為1 μg/g時(shí)，THC在注射后6～12 h顯著提高，隨后恢復(fù)至正常水平;當(dāng)注射劑量為5 μg/g時(shí)，THC在整個(gè)試驗(yàn)階段均呈現(xiàn)顯著升高，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。注射β-1，3-葡聚糖后，THC最高值均出現(xiàn)在注射后6 h，表明THC對(duì)β-1，3-葡聚糖注射刺激十分敏感。THC最高值也呈一定的劑量效應(yīng)，注射劑量為1 μg/g時(shí)，THC最高值是對(duì)照的1.45倍;注射劑量為5 μg/g時(shí)，THC最高值為對(duì)照的1.98倍?？梢?jiàn)，β-1，3-葡聚糖的刺激可誘導(dǎo)紅螯螯蝦循環(huán)血細(xì)胞數(shù)量增加，從而可能對(duì)其免疫力和抗病力產(chǎn)生正面影響，因此，β-1，3-葡聚糖具有作為飼料免疫增強(qiáng)劑的開(kāi)發(fā)潛力。

3. 2 β-1，3-葡聚糖對(duì)蝦類(lèi)血細(xì)胞ROS和NO含量的影響

ROS包括超氧陰離子（[O][2] ）、過(guò)氧化氫（H2O2）和羥自由基（OH·）等，是機(jī)體內(nèi)重要的抗菌殺菌物質(zhì)（Munoz et al.，2000;Lambert et al.，2007）。NO作為一種主要的活性氮（RNS）分子，在哺乳動(dòng)物殺滅病原微生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，近年來(lái)在甲殼動(dòng)物的研究中也發(fā)現(xiàn)NO在殺菌機(jī)制中產(chǎn)生作用（Raman et al.，2008;Yao et al.，2010;Xian et al.，2013）。蝦類(lèi)血細(xì)胞經(jīng)革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁脂多糖（LPS）（Xian et al.，2016）和病毒雙鏈RNA類(lèi)似物聚肌胞苷酸（poly I∶C）（Xian et al.，2018）刺激，以及在吞噬過(guò)程中均會(huì)產(chǎn)生大量的ROS和NO（Raman et al.，2008），表明ROS和NO在蝦類(lèi)抗菌和抗病毒過(guò)程中具有普遍性作用。凡納濱對(duì)蝦原代培養(yǎng)血細(xì)胞與β-1，3-葡聚糖及其衍生物孵育后，其血細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力極大提高（白楠等，2014）。在本研究中，注射β-1，3-葡聚糖后紅螯螯蝦血細(xì)胞ROS和NO含量均有顯著提高，表明β-1，3-葡聚糖注射刺激了紅螯螯蝦血細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力的提高。ROS和NO對(duì)β-1，3-葡聚糖的響應(yīng)模式存在一定差異，NO的響應(yīng)較敏感，最高值出現(xiàn)在注射后6 h，但持續(xù)時(shí)間較短，隨后便逐漸恢復(fù)至正常水平，可能是由于NO的另一重要作用是作為信號(hào)因子參與機(jī)體內(nèi)許多生理與病理過(guò)程，其含量受到嚴(yán)格控制;另一方面，NO本身極不穩(wěn)定，在胞內(nèi)很快被代謝為硝酸鹽和亞硝酸鹽。ROS含量的最高值出現(xiàn)在注射后12 h，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，注射高劑量時(shí)可持續(xù)整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程。綜上所述，在β-1，3-葡聚糖免疫刺激下，ROS通路和NO通路均是紅螯螯蝦血細(xì)胞的免疫防御機(jī)制，其中ROS通路可能起到更為主要的作用。

3. 3 β-1，3-葡聚糖對(duì)蝦類(lèi)血細(xì)胞酯酶活力和吞噬活力的影響

酯酶是溶酶體酶類(lèi)之一，在血細(xì)胞抗菌作用中發(fā)揮重要作用。蝦類(lèi)血細(xì)胞酯酶活力是一個(gè)較敏感的指標(biāo)，對(duì)環(huán)境脅迫（Xian et al.，2011）和病原體刺激（Xian et al.，2016，2018）均能作出強(qiáng)烈的響應(yīng)。飼料添加物對(duì)酯酶活力的影響目前僅見(jiàn)關(guān)于飼料銅離子的研究，結(jié)果顯示飼料中添加過(guò)量的銅離子會(huì)對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦血細(xì)胞酯酶活力產(chǎn)生一定的負(fù)面影響，可能是過(guò)量銅離子產(chǎn)生的細(xì)胞毒性所致（冼健安和王安利，2013）。不同微生物抗原物質(zhì)對(duì)酯酶活力的影響也不同，不管是在離體刺激還是在活體注射的情況下，細(xì)菌LPS的刺激均能引起對(duì)蝦血細(xì)胞酯酶活力顯著提升（Guo et al.，2013;Xian et al.，2016），但聚肌胞苷酸[poly（I∶C）]處理對(duì)蝦血細(xì)胞酯酶活力的影響甚少（Xian et al.，2018）。本研究結(jié)果顯示，β-1，3-葡聚糖也能誘導(dǎo)紅螯螯蝦血細(xì)胞酯酶活力顯著提高，但其敏感性較ROS和NO低，在注射后12 h才呈顯著升高趨勢(shì)。上述結(jié)果表明，蝦類(lèi)免疫系統(tǒng)對(duì)不同的微生物抗原物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生不同的免疫響應(yīng)。此外，飼料中添加β-1，3-葡聚糖或酵母細(xì)胞壁可顯著提高凡納濱對(duì)蝦溶菌活力或溶菌酶活力（許國(guó)煥等，2003;楊福剛等，2005;趙紅霞等，2010），酯酶在這一過(guò)程中可能起到一定作用。

吞噬功能是蝦類(lèi)血細(xì)胞進(jìn)行抗菌防御的主要免疫功能之一。本研究中，在低劑量β-1，3-葡聚糖處理下，紅螯螯蝦血細(xì)胞的吞噬活力無(wú)顯著變化;而高劑量β-1，3-葡聚糖處理顯示出其對(duì)紅螯螯蝦血細(xì)胞吞噬活力的激活作用。羅氏沼蝦血細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后，其吞噬率顯著提高（冼健安等，2011），與本研究結(jié)果相似。另有研究表明，各類(lèi)免疫響應(yīng)并非單一存在，彼此間可能相互激活，配合發(fā)揮免疫防御功能，如活化的酚氧化酶原（proPO）系統(tǒng)組分能激活血細(xì)胞的吞噬能力（Johansson et al.，2000），血細(xì)胞在吞噬過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的ROS和NO（Raman et al.，2008）。

3. 4 β-1，3-葡聚糖對(duì)蝦類(lèi)血清PO活力的影響

proPO系統(tǒng)是蝦類(lèi)免疫系統(tǒng)的重要組成部分，關(guān)于proPO系統(tǒng)的作用機(jī)理研究已較深入（孟凡倫等，1999;郭慧等，2013）。proPO系統(tǒng)儲(chǔ)存于大顆粒細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞的顆粒中，當(dāng)有微生物抗原性物質(zhì)如β-1，3-葡聚糖、脂多糖和肽聚糖等存在時(shí)，可被相應(yīng)模式識(shí)別蛋白如β-1，3-葡聚糖結(jié)合蛋白（BGBP）、脂肪與β-1，3-葡聚糖結(jié)合蛋白（LGBP）等識(shí)別并結(jié)合，引起顆粒細(xì)胞脫顆粒釋放proPO系統(tǒng)，proPO被絲氨酸蛋白酶激活為活性PO，PO將酚氧化為醌，再形成黑色素而發(fā)揮抗菌殺菌作用（徐海圣和徐步進(jìn)，2001）。體外孵育、注射或飼喂β-1，3-葡聚糖均能顯著提高對(duì)蝦的血清PO活力（許國(guó)煥等，2003;劉立鶴等，2005;汪小鋒等，2005;白楠等，2014）。本研究結(jié)果也顯示，注射β-1，3-葡聚糖能顯著提高紅螯螯蝦的血清PO活力，且具有明顯的劑量效應(yīng)，高劑量β-1，3-葡聚糖刺激下其血清PO活力的提高幅度更大，持續(xù)時(shí)間也更長(zhǎng)。

4 結(jié)論

注射β-1，3-葡聚糖能提高紅螯螯蝦的循環(huán)血細(xì)胞數(shù)量及其免疫力，表明β-1，3-葡聚糖可開(kāi)發(fā)為紅螯螯蝦飼料免疫增強(qiáng)添加劑。

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（責(zé)任編輯 鄧慧靈）