孫婉瑾　金實(shí)　段雪云　閆斌　白書仙　李成銀　姜楠

〔摘要〕 目的 建立消腫Ⅰ號揮發(fā)性成分指紋圖譜，以期為這一內(nèi)病外治對抗癌性疼痛的中藥制劑的進(jìn)一步研究提供科學(xué)基礎(chǔ)。

方法 采用頂空靜態(tài)加熱萃取技術(shù)提取消腫Ⅰ號低溫易揮發(fā)性成分，采用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜（HS-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析，使用Agilent HP-5MS毛細(xì)管色柱（0.25 μm×0.25 mm×30 m）分離;程序升溫：初始溫度60 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至120 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至170 ℃，保持5 min;分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度150 ℃，進(jìn)樣量1 ？滋L，載氣為高純氦氣（純度≥99.999%），載氣流量 1.0 mL/min，質(zhì)譜條件為EI源，轟擊電壓70 eV，正離子模式，離子源溫度230 ℃。結(jié)果 檢驗(yàn)10批次樣品，各批次相似度均在0.90以上，得到17個(gè)共有峰，分別進(jìn)行識別與歸屬以及相對含量的計(jì)算。結(jié)論 消腫Ⅰ號揮發(fā)性成分復(fù)雜，其中主要組成成分為仲丁基-1-丙烯基二硫化物、二烯丙基二硫醚等物質(zhì)，同時(shí)含許多萜類促透皮吸收劑。

〔關(guān)鍵詞〕 頂空-氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù);揮發(fā)性成分;指紋圖譜;消腫Ⅰ號

〔中圖分類號〕R284.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.011

Study on Volatile Fingerprinting of Xiaozhong Ointment No. 1 by HS-GC-MS Technology

SUN Wanjin1，2， JIN Shi1，2， DUAN Xueyun1，2， YAN Bin1，2， BAI Shuxian1，2， LI Chengyin1，2， JIANG Nan1，2*

（1. Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430061， China; 2. Hubei Province

Academy of Traditional Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430074， China）

〔Abstract〕 Objective To develop the volatile fingerprinting of Xiaozhong Ointment No. 1， thus providing a scientific basis for further study of the external preparation against internal cancer pain relief. Methods The low temperature volatile components of Xiaozhong Ointment No. 1 were extracted by using headspace static heating extraction technology. The headspace sampling-gas chromatography-mass spectrometry （HS-GC-MS） technology was used to analyze. Agilent HP-5MS column （0.25 μm×0.25 mm×30 m） was used and temperature programmed run was conducted： initial temperature 60 ℃， hold 5 min， 10 ℃/min rise to 120 ℃， hold 3 min， 5 ℃/min rise to 170 ℃， hold 5 min; split injection， inlet temperature： 150 ℃， injection volume 1.0 μL; carrier gas was high purity helium （≥99.999%）， carrier gas flow 1.0 mL/min; mass spectrometry conditions： EI source， bombardment voltage 70 eV， positive ion mode， ion source temperature was set at 230 ℃. Results After analyzing 10 batches of samples， the similarity of all batches was over 0.90. 17 substances were identified and their relative contents were analyzed. Conclusion The volatile composition of Xiaozhong Ointment No. 1 is complex， and the main components are sec-butyl-cis-trans-1-propentyl disulfide， diallyl disulfide and other substances. It also contains many terpenes for transdermal absorption.

〔Keywords〕 HS-GC-MS technology; volatile components; fingerprint; Xiaozhong Ointment No. 1

消腫Ⅰ號是在名老中醫(yī)理論指導(dǎo)下，本院長期使用的經(jīng)驗(yàn)方，注重辨證與辨病相結(jié)合，針對癌性疼痛的主要發(fā)病機(jī)制，組方選藥配制而成，在臨床使用十余年，深受患者好評[1-2]。有研究結(jié)果表明：消腫Ⅰ號在治療癌性疼痛、減輕癌性疼痛方面有顯著功效，可以用來改善患者的生存質(zhì)量[3-4]，然而關(guān)于其物質(zhì)基礎(chǔ)方面的研究較少。

消腫Ⅰ號由三七、白首烏、阿魏三味藥材組成，阿魏單獨(dú)提取揮發(fā)油后，再與其他中藥加水提取，最后與適宜基質(zhì)混合制備成外用膏劑。經(jīng)體表局部給藥，通過皮膚吸收，達(dá)到鎮(zhèn)痛作用。阿魏揮發(fā)油中含有單萜類、倍半萜類、多酚類、苯等化合物[5-6]，有很好的抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化等作用[7-10]。同時(shí)，關(guān)于中藥揮發(fā)油類中活性成分透皮吸收促進(jìn)作用的研究日益增多，其主要促滲活性成分多為單萜和倍半萜類化合物，該類天然促滲劑具有促滲作用強(qiáng)、起效快、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)[11-14]。它們主要通過改變皮膚角質(zhì)層細(xì)胞的有序排列、“拉動”效應(yīng)以及增強(qiáng)皮膚角質(zhì)層水合作用等機(jī)制發(fā)揮促滲作用[15]。本研究擬采用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-GC-MS）方法建立消腫Ⅰ號揮發(fā)性成分指紋圖譜，確立共有特征峰，并進(jìn)行指認(rèn)。對其中可能的活性成分和起透皮吸收促進(jìn)作用的成分進(jìn)行定性分析，為這一治療癌性疼痛的中藥外用制劑的后續(xù)開發(fā)提供基礎(chǔ)與依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1? 儀器

Agilent 7890A-5975C氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），包括7697A頂空進(jìn)樣器、G4513A自動進(jìn)樣器、NIST17質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫、Agilent Masshunter Qualitative Analysis定性工作站。真空機(jī)械泵（德國Pfeiffer Vacuum公司），高純氦氣（純度≥99.999%）（武漢華星工業(yè)技術(shù)有限公司），ES225SM-DR十萬分之一電子天平（瑞士Precisa公司）。

1.2? 試藥

三七、阿魏白首烏均經(jīng)湖北省中醫(yī)院主任藥師段雪云鑒定。三七為五 加 科 植 物 三 七Parmx notoginseng （Burk.） F.H.Chen的干燥根和根莖;阿魏為傘形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis K. M. Shen的樹脂;白首烏為蘿藦科植物耳葉牛皮消Cynanchum auriculatum Royle ex Wight的干燥塊根。阿魏單獨(dú)提取揮發(fā)油后，再與三七、白首烏一同加水提取，最后提取物與適宜基質(zhì)混合并加入揮發(fā)油制備成消腫Ⅰ號。實(shí)驗(yàn)用的10批消腫Ⅰ號（見表1）均由湖北省中醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1? 揮發(fā)性成分的提取

稱取消腫Ⅰ號供試品3.0 g，準(zhǔn)確稱定，置于10 mL頂空瓶中密閉，置頂空進(jìn)樣器中按以下條件進(jìn)樣：樣品瓶加熱溫度100 ℃，定量環(huán)105 ℃，傳輸線110 ℃，加熱15 min，提取消腫Ⅰ號低溫易揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。

2.2? 氣相及質(zhì)譜條件

使用Agilent HP-5MS 毛細(xì)管色柱（0.25 μm×0.25 mm×30 m）;程序升溫：初始溫度60 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至120 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至170 ℃，保持5 min;載氣為高純氦氣（純度≥99.999%），載氣流量1.0 mL/min;分流比25∶1，進(jìn)樣口溫度150 ℃，進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜條件為EI源，轟擊電壓70 eV，正離子模式，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，采用全掃描模式獲得樣品的總離子流色譜圖[16]。

2.3? 重復(fù)性試驗(yàn)

取2號樣品5份頂空進(jìn)樣器分別進(jìn)樣，各圖譜的相似度均在0.996以上，說明本試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.4? 指紋圖譜共有模式建立與各樣本之間相似度分析

按照“2.1”及“2.2”所述條件測定各批次消腫Ⅰ號揮發(fā)性成分，提取電元文件，導(dǎo)入國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件（2012A科研類）進(jìn)行指紋圖譜數(shù)據(jù)分析和處理，設(shè)定樣品1為參照圖譜，建立消腫Ⅰ號揮發(fā)性成分共有模式對照指紋圖譜（見圖1）與10批消腫Ⅰ號揮發(fā)性成分總離子流色譜疊加圖（見圖2），并得到17個(gè)共有峰，10批指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果見表2;譜庫檢索結(jié)合文獻(xiàn)[5-6，17]進(jìn)行識別，相應(yīng)信息見表3;識別出12號峰為仲丁基-1-丙烯基二硫化物，為阿魏揮發(fā)油中主要成分，來源明確，歸屬可靠，并且在氣相色譜圖中分離較好。

3 討論

目前，HS-GC-MS技術(shù)判斷化合物信息的手段主要是通過譜庫檢索匹配度打分結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)兩者吻合，則該化合物被識別正確的概率就非常高，因而可以被確證。本研究識別出的17個(gè)共有峰中，2-9、12-17峰均有相關(guān)文獻(xiàn)支持來自阿魏，加上譜庫檢索匹配度打分均大于80，我們可以識別為表3列出的相應(yīng)成分。而1、10、11號峰暫時(shí)沒有文獻(xiàn)報(bào)道，識別信息僅來自譜庫檢索，來源歸屬信息有待進(jìn)一步研究。

仲丁基-1-丙烯基二硫化物約占阿魏揮發(fā)油總量的50%左右[18]，具有辛通溫開，解毒脫癮的功效，為本文測得消腫Ⅰ號低溫?fù)]發(fā)性成分中含量最高的物質(zhì)。二烯丙基二硫醚含量次之，是一種潛在的廣譜抗癌藥，被報(bào)道在大蒜中分離得到，有可能是阿魏揮發(fā)油中硫醚化合物轉(zhuǎn)化而成，或者直接來源于阿魏揮發(fā)油，是其蒜臭味物質(zhì)基礎(chǔ)之一[19]。這兩種物質(zhì)在功效方面與消腫Ⅰ號治療癌性疼痛吻合，有利于抗癌治療順利實(shí)施。同時(shí)，外敷貼劑止痛，不僅方便，而且易為患者接受。特別是晚期癌癥患者正氣已虛，不耐攻伐，脾胃吸收功能減弱，單靠內(nèi)服藥效果不佳，中藥外治更具優(yōu)勢。檢測出蒎烯、蒈烯等萜類化合物為經(jīng)皮給藥制劑天然的促滲劑。本文結(jié)果提示，本品在使用前適當(dāng)隔水加熱，有利于揮發(fā)性物質(zhì)溢出，能達(dá)到更好的促進(jìn)吸收效果。

在采集各批次制劑樣品時(shí)，能明顯發(fā)現(xiàn)6號樣品與其它樣品顏色有差異，顏色與其它樣品相比偏淺，曾懷疑其存在質(zhì)量問題。但經(jīng)過檢查，其制備流程不存在問題，臨床療效也與其他批次無異，在氣質(zhì)指紋圖譜中能發(fā)現(xiàn)3號樣品與其它樣品的指紋圖譜相似度均≥0.9，與共有指紋圖譜相似度為0.931，相似度較高，驗(yàn)證了指紋圖譜是制劑質(zhì)量穩(wěn)定性評價(jià)的手段的科學(xué)性。本研究所建立的消腫Ⅰ號揮發(fā)性成分氣質(zhì)指紋圖譜，較大程度地反映了消腫Ⅰ號揮發(fā)性成分的組成情況，除了揭示其揮發(fā)性物質(zhì)基礎(chǔ)，還可用于控制其質(zhì)量的穩(wěn)定性、均一性，對提高該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)有著重要意義。

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