楊筱倩　陳仙蕾　楊仁義　唐標(biāo)　劉曉丹　鄧常清　黃小平

〔摘要〕 目的 探討冰片配伍黃芪甲苷（astragalosides Ⅳ， AST Ⅳ）和三七總皂苷（panax notoginseng saponins， PNS）抗腦缺血再灌注損傷的有效劑量。方法 采用U6*（64）均勻設(shè)計實驗，設(shè)立6個不同劑量的冰片、AST Ⅳ和PNS配伍，予大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO）再灌注大鼠灌胃干預(yù)，以神經(jīng)功能評分、腦梗死率、腦含水量、腦組織病理形態(tài)、血腦屏障（blood-brain barrier， BBB）通透性評價藥物的作用，對效應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行多重線性回歸分析，確立3種組（成）分的有效配伍劑量，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行驗證。結(jié)果 均勻設(shè)計實驗表明，大鼠腦缺血再灌注后，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，腦梗死率、腦含水量、神經(jīng)細(xì)胞損傷率和BBB通透性均顯著增加。冰片、AST Ⅳ、PNS不同劑量配伍對上述指標(biāo)均有一定的改善作用;多重線性回歸分析表明，冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS25 mg/kg配伍為其抗腦缺血再灌注損傷的有效配伍劑量。驗證實驗顯示，3種藥物高、低劑量配伍能顯著降低腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死率，3種藥物配伍的效應(yīng)顯著優(yōu)于各藥物單用或AST Ⅳ+PNS配伍（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 冰片、AST Ⅳ、PNS配伍可增強(qiáng)抗腦缺血再灌注損傷的效應(yīng)，3種藥物的有效配伍劑量為冰片7.5 mg/kg+AST Ⅳ 10 mg/kg+PNS 25 mg/kg。

〔關(guān)鍵詞〕 冰片;黃芪甲苷;三七總皂苷;腦缺血再灌注;配伍劑量

〔中圖分類號〕R285.5;R743? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.003

Study on the Effective Dosage of Borneol Combined with Astragalosides Ⅳ and Panax

Notoginseng Saponins Antagonizing Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

YANG Xiaoqian， CHEN Xianlei， YANG Renyi， TANG Biao， LIU Xiaodan， DENG Changqing*， HUANG Xiaoping*

（Molecular Pathology Laboratory， Key Laboratory of Hunan Province for Prevention and Treatment of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Cardio-Cerebral Diseases， Key Laboratory of Hunan Universities for Cell Biology and Molecular Techniques， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the effective dosage of Borneol combined with Astragalosides Ⅳ （AST Ⅳ） and panax notoginseng saponins （PNS） antagonizing cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods According to U6*（64） uniform design experiment， 6 different dosage combinations of Borneol， AST Ⅳ and PNS were set. The middle cerebral artery occlusion （MCAO）-reperfusion rats was administrated. The neurological function score， cerebral infarct volume， brain water content， brain histopathological morphology， blood-brain barrier （BBB） permeability were used to assess the effects of drugs. The effect index was analyzed using multiple linear regression method， thus to ascertain the effective combination dosage of 3 ingredients （components）， and the effective combination dosage were exerted to the experimental verification. Results The uniform design experiment results showed that the rats appeared obvious neurological dysfunction， cerebral infarction rate， brain water content， nerve cell injury rate and BBB permeability were all increased after cerebral ischemia-reperfusion. The different dosage combinations of Borneol， AST Ⅳ and PNS could improve the index above. Multiple linear regression analysis showed that the effective combination dosage of Borneol， AST Ⅳ and PNS antagonizing cerebral ischemia-reperfusion injury was Borneol 7.5 mg/kg， AST Ⅳ 10 mg/kg， PNS 25 mg/kg， respectively. Verification experiment results showed that 3 drug combinations with high or low dosage could significantly decrease neurological function score and cerebral infarct volume of cerebral ischemia-reperfusion rats， and the effects of the combinations were significantly better than that of single drug or AST Ⅳ+PNS （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion The combinations of Borneol， AST Ⅳ and PNS can enhance the effects of anti-cerebral ischemia-reperfusion injury， and the effective combination dosage is Borneol 7.5 mg/kg+AST Ⅳ 10 mg/kg+PNS 25 mg/kg.

〔Keywords〕 Borneol; Astragalosides Ⅳ; panax notoginseng saponins; cerebral ischemia-reperfusion; combination dosage

腦梗死是由于腦組織動脈血管阻塞使其血供障礙，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織形態(tài)和功能受損，該病具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高等特點，嚴(yán)重危害了人類的健康[1]。研究表明[2-3]，腦組織在缺血再灌注后會發(fā)生更嚴(yán)重的損傷，這種損傷常由Ca2+超載、腦組織能量代謝紊亂、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)等一系列變化引起，最終將導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷甚至細(xì)胞死亡。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦卒中的基本病機(jī)是虛、火、氣、血、風(fēng)、痰，以氣虛和血瘀為主，氣虛血瘀為缺血性中風(fēng)的主要病理機(jī)制，運用益氣活血法治療?？墒盏搅己玫寞熜4]。針對缺血性中風(fēng)的治療，臨床常以益氣藥黃芪和活血藥三七配伍使用，符合中醫(yī)學(xué)益氣活血的治療原則。藥物化學(xué)研究表明，黃芪總苷（astragalosides， AST）是黃芪中具有心腦血管藥理作用的主要藥效組分，主要含黃芪甲苷（astragalosides Ⅳ， AST Ⅳ）等;三七總皂苷（panax notoginseng saponins， PNS）是三七中具有心腦血管效應(yīng)的主要藥效組分，主要含人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1等。目前對AST和PNS兩類有效組分配伍的心腦血管效應(yīng)研究已有相關(guān)報道，我們的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪和三七中的主要有效組（成）分及其配伍可通過腦缺血后的多個病理生理環(huán)節(jié)，協(xié)同發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷的作用[5-8]。但AST給藥后主要分布于肝、脾、心、肺中，在腦組織中分布較少，難以穿透血腦屏障（blood-brain barrier， BBB）[9-10]。PNS給藥后，人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1等主要分布于腎、肺、肝、心臟，在腦組織中含量均較少[11]。由此可見，AST和PNS的主要成分由于其分子量大、脂溶性低，透過BBB的量少，難以更好地在病變腦組織發(fā)揮藥效作用。冰片相對分子質(zhì)量為154.24，是一種小分子脂溶性單萜類物質(zhì)，不僅本身能透過BBB，還可促進(jìn)其它藥物進(jìn)入腦組織[12]，具有“引藥上行”的作用，常作為輔藥或引經(jīng)藥使用以促進(jìn)藥物吸收及進(jìn)入病變部位，從而對腦相關(guān)疾病的治療發(fā)揮協(xié)同增效作用[13]。張青等[14]采用冰片400 mg/kg+黃芪40 mg/kg組合，發(fā)現(xiàn)冰片能開放腦缺血再灌注后BBB，促進(jìn)藥物入腦。吳俊杰等[15]研究發(fā)現(xiàn)，冰片20 mg/kg+梓醇49 mg/kg+葛根素200 mg/kg可以增加腦缺血模型BBB通透性，并促進(jìn)梓醇、葛根素透過BBB。因此，本研究采用大鼠腦缺血再灌注模型和功能、形態(tài)評價方法，探討冰片配伍AST Ⅳ和PNS抗腦缺血的增效作用，確立3種組（成）分配伍的有效劑量，為新型抗腦缺血中藥的開發(fā)與應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 主要試劑? 冰片（左旋龍腦，質(zhì)量分?jǐn)?shù)86%），購自本校附屬醫(yī)院藥劑科;AST IV（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號：MUST-15032010）、PNS（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號：MUST-14122912），均購自成都曼思特生物科技有限公司，藥物用時以0.5%羧甲基纖維素鈉配成相應(yīng)濃度混懸液。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium hloride， TTC，美國Sigma公司，批號：T8877-5G），水合氯醛（梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：8MQ20-CC），伊文思藍(lán)（美國Sigma公司，批號：314-13-6），PBS（Solarbio公司，批號：P1010）。

1.1.2? 動物? SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供（動物合格證號：43004700037715）。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心[場地許可證號：SKY（湘）2013-0005]。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)飼養(yǎng)5～7 d，給藥前禁食12 h，自由飲水。

1.2? 方法

1.2.1? 藥物劑量、配制、分組與干預(yù)? 根據(jù)《中華人民共和國藥典》記載，冰片成人每天用量為0.15～0.3 g，大鼠的等效劑量為15～30 mg/kg，故以30 mg/kg為本實驗的冰片常用劑量。根據(jù)我們前期研究，AST IV在大鼠以40 mg/kg劑量單獨應(yīng)用及與PNS配伍時具有抗腦缺血再灌注損傷的作用，故以40 mg/kg為本實驗AST Ⅳ的常用劑量;PNS在大鼠以100～120 mg/kg單用及與AST Ⅳ配伍時，具有抗腦缺血作用，故以100 mg/kg為本實驗PNS的常用劑量。以常用劑量為中點，采用基線等比設(shè)計方法，每個藥物設(shè)計6個劑量水平，藥物劑量以50%遞增或遞減。見表1。

采用U6*（64）均勻設(shè)計實驗，根據(jù)表1設(shè)定的6個劑量水平，得到3種藥物6個不同的配伍實驗組。見表2。

另設(shè)模型組、假手術(shù)組，共計8組。取SPF級SD大鼠，灌胃干預(yù)3 d，每天2次，2次給藥間隔時間12 h。于第3天干預(yù)后1 h制作大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO）缺血模型[6]，假手術(shù)組僅游離頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，不做結(jié)扎、插線處理，其他操作同其它組。缺血2 h后進(jìn)行再灌注，再灌注期間繼續(xù)給藥。假手術(shù)組和模型組灌胃等容量0.5%羧甲基纖維素鈉。于再灌注后24 h進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測。

1.2.2? 神經(jīng)功能學(xué)評分? 大鼠再灌注24 h后，參考文獻(xiàn)[6]對動物的神經(jīng)功能進(jìn)行評分。

1.2.3? 腦梗死率測定? 于再灌注24 h后，麻醉處死大鼠，迅速取腦。置-20 ℃冰箱15 min，去除小腦、腦干等，沿冠狀面將腦組織連續(xù)切片5片，每片厚2 mm，立即將切片放入2% TTC磷酸緩沖液中，置37 ℃水浴避光染色20 min，每5分鐘將腦片輕輕翻動1次。染色后置于4%多聚甲醛溶液中固定，24 h后將每片腦組織拍照。用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件測量梗死灶面積。根據(jù)公式

V=t（A1+A2……+An）/全腦體積

計算梗死灶體積，再進(jìn)一步計算梗死灶體積占全腦體積的百分比即為腦梗死率。其中t為切片厚度，A為梗死面積。

1.2.4? 腦水腫率測定? 計算出梗死灶體積和/全腦體積后，根據(jù)文獻(xiàn)[16]計算腦水腫率

S=（∑LT-∑RT）/（∑LT+∑RT）×100%

∑LT代表大腦左側(cè)半球總體積，∑RT代表大腦右側(cè)半球總體積。兩側(cè)大腦半球體積也由TTC染色結(jié)果可得。

1.2.5? 腦組織病理形態(tài)測定? 將腦組織放入4%多聚甲醛中固定2～3 d，經(jīng)視交叉平面冠狀切片，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切成4 μm的切片，用于HE染色。將切片在顯微鏡（10×40）下隨機(jī)取缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)的5個非重疊視野對損傷細(xì)胞進(jìn)行觀察，損傷細(xì)胞表現(xiàn)為空泡樣變性、嗜酸性樣變性、核固縮、核溶解等改變。分別計數(shù)每個高倍視野中的細(xì)胞總數(shù)及損傷細(xì)胞數(shù)。取5個視野的平均值作為該樣本的細(xì)胞損傷率。

細(xì)胞損傷率=（損傷細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%

1.2.6? 伊文思藍(lán)（Evans blue， EB）法測定血腦屏障通透性? 于動物處死前30 min用10%水合氯醛麻醉，經(jīng)股靜脈注入2%EB生理鹽水溶液（2 mL/kg）。30 min后放血處死大鼠，立即斷頸取腦，濾紙吸干組織表面水分，小心剝?nèi)蓚?cè)大腦半球，按EB試劑盒說明書進(jìn)行吸光度測定，根據(jù)EB標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算腦組織EB漏出量（μg/g腦組織），以此反映BBB受損情況。

1.3? 驗證實驗

根據(jù)均勻設(shè)計實驗得出冰片、AST Ⅳ、PNS配伍的有效配伍劑量（冰片7.5 mg/kg，AST Ⅳ 10 mg/kg，PNS 25 mg/kg），將動物隨機(jī)分為：假手術(shù)組、模型組、冰片7.5 mg/kg組、AST Ⅳ 10 mg/kg組、PNS 25 mg/kg組、AST Ⅳ 10 mg/kg+PNS 25 mg/kg組、冰片7.5 mg/kg+AST Ⅳ 10 mg/kg+PNS 25 mg/kg低劑量配伍組、冰片15 mg/kg+AST Ⅳ 20 mg/kg+PNS 50 mg/kg高劑量配伍組，以及依達(dá)拉奉4 mg/kg組，每組5只。灌胃干預(yù)3 d，每日2次，兩次間隔時間12 h，于第3天給藥后1 h同“1.2.1”制作MCAO模型。缺血2 h后進(jìn)行再灌注，再灌注期間繼續(xù)給藥。于再灌注后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分及腦梗死率測定，方法同“1.2.2”及“1.2.3”。

1.4? 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)用“x±s”表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析。各組計量資料比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnet T3檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。均勻設(shè)計實驗的二次回歸分析，首先對各個效應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行多重線性回歸分析，再將各效應(yīng)指標(biāo)賦予不同權(quán)重，計算其綜合效應(yīng)，同樣采用均勻設(shè)計實驗多重線性回歸分析方法分析，明確三種藥物配伍抗腦缺血再灌注損傷的有效配伍劑量。

2 結(jié)果

2.1? 均勻設(shè)計實驗分析

與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能評分、腦梗死率、腦水腫率、細(xì)胞損傷率、EB漏出量均顯著增加（P<0.01），表明腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損傷，腦含水量增多，BBB受損，出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀。與模型組比較，第1～5組能顯著減少腦組織EB漏出量（P<0.01），且第5配伍組還能顯著降低神經(jīng)功能評分、腦梗死率、腦水腫率，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表3。

將實驗藥物配比方案及以上的實驗結(jié)果進(jìn)行多重線性回歸分析（回歸方程中設(shè)定X1為冰片，X2為AST Ⅳ，X3為PNS，Y為各組各指標(biāo)的數(shù)據(jù)），結(jié)果如下。

2.1.1? 神經(jīng)功能評分? 多重線性回歸分析為

Y=2.072+0.002X2

由于要求神經(jīng)功能評分（Y值）越小越好，故冰片、AST Ⅳ、PNS均應(yīng)取實驗范圍內(nèi)的最小值，即冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS25 mg/kg。

2.1.2? 腦梗死率? 白色區(qū)為梗死灶，紅色區(qū)為正常腦組織。假手術(shù)組腦組織未見蒼白梗死區(qū)，模型組出現(xiàn)較大范圍的蒼白梗死灶，各藥物組梗死體積均有不同程度減少，見圖1。多重線性回歸分析為

Y=18.039+0.21X1+0.117X2+0.044X3

由于要求腦梗死率（Y值）越小越好，故冰片、AST Ⅳ、PNS均應(yīng)取實驗范圍內(nèi)的最小值，即冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS25 mg/kg。

2.1.3? 腦水腫率? 多重線性回歸方程為

Y=4.819+0.29X1+0.45X2+0.3X3

由于要求腦水腫率（Y值）越小越好，故冰片、AST Ⅳ、PNS均應(yīng)取實驗范圍內(nèi)的最小值，即冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS25 mg/kg。

2.1.4? 細(xì)胞損傷率? 假手術(shù)組大腦皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，排列緊密。模型組腦組織細(xì)胞周圍間隙增大，胞核不規(guī)整，間質(zhì)水腫明顯，排列紊亂，細(xì)胞核深染固縮或出現(xiàn)嗜酸性樣變性，損傷細(xì)胞增多，各給藥組細(xì)胞損傷程度有所減輕，見圖2。多重線性回歸方程為

Y=84.538-0.12X1+0.026X2-0.038X3

由于要求細(xì)胞損傷率（Y值）越小越好，故冰片、PNS應(yīng)取實驗范圍內(nèi)的最大值，AST Ⅳ取最小值，即冰片120 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS400 mg/kg。

2.1.5? EB漏出量? 多重線性回歸方程為

Y=0.72+0.02X1+0.01X2

由于要求EB漏出量（Y值）越小越好，故冰片、AST Ⅳ、PNS均應(yīng)取實驗范圍內(nèi)的最小值，即冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS25 mg/kg。

2.1.6? 各指標(biāo)綜合加權(quán)評分的多重線性回歸分析? 在5個指標(biāo)單獨分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行綜合分析，對每個指標(biāo)賦予不同的權(quán)重，總權(quán)重為1，每個指標(biāo)的平均權(quán)重系數(shù)為0.20。根據(jù)各指標(biāo)的特異性和對腦損傷評價的重要性對每個指標(biāo)賦予不同的權(quán)重。腦梗死率是直接評價腦組織損傷的指標(biāo)，其特異性高;神經(jīng)細(xì)胞損傷率是在微觀上評價神經(jīng)細(xì)胞損傷的指標(biāo)，也具有特異性高和直觀的特點。因此，將腦梗死率和神經(jīng)細(xì)胞損傷率兩個指標(biāo)在平均權(quán)重系數(shù)的基礎(chǔ)上各增加50%，即腦梗死率和細(xì)胞損傷率權(quán)重系數(shù)均為0.3。腦水腫率是評價腦缺血后腦水腫程度的指標(biāo)，但由于本實驗的腦水腫率是根據(jù)腦梗死率來間接計算的，因此，腦水腫率的權(quán)重系數(shù)在平均權(quán)重系數(shù)的基礎(chǔ)上減少25%，即為0.15;EB漏出率是評價BBB受損的指標(biāo)，但測定EB漏出率時受血管和血流狀態(tài)等的影響，是間接評價BBB受損程度的指標(biāo)，因此，其權(quán)重系數(shù)也是在平均權(quán)重系數(shù)的基礎(chǔ)上減少25%，即為0.15。神經(jīng)功能評分在一定程度上反映了神經(jīng)功能缺損情況，該指標(biāo)雖然在一定程度上可反映腦組織受損，但受機(jī)體狀態(tài)和代償功能等的影響，故權(quán)重系數(shù)是在平均權(quán)重系數(shù)的基礎(chǔ)上減少50%，即為0.10。將各指標(biāo)的平均值×權(quán)重系數(shù)得到每項指標(biāo)的權(quán)重得分，將各項指標(biāo)的權(quán)重得分相加得到權(quán)重總分，再進(jìn)行分析，見表3。將實驗藥物配比方案及其對應(yīng)的實驗結(jié)果進(jìn)行多重線性回歸分析，得回歸方程為

Y=4.446+0.007X2+0.000 005X3

由于要求權(quán)重總分（Y值）越小越好，故冰片、AST Ⅳ、PNS均應(yīng)取實驗范圍內(nèi)的最小值，即冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS25 mg/kg。

2.2? 驗證實驗

假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)缺損癥狀。與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能評分顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，3種藥物配伍低、高劑量組及依達(dá)拉奉組神經(jīng)功能評分顯著降低（P<0.05或P<0.01），且3種藥物配伍低劑量組的效應(yīng)顯著優(yōu)于各藥物單用組（P<0.05）。見圖3。

腦梗死率比較表明，假手術(shù)組無梗死灶形成，腦梗死率為0。與假手術(shù)組比較，模型組腦梗死率顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，冰片組，AST Ⅳ+PNS配伍組，3種藥物配伍高、低劑量組及陽性藥物依達(dá)拉奉組腦梗死率顯著縮?。≒<0.05或P<0.01），且AST Ⅳ+PNS配伍組的效應(yīng)強(qiáng)于AST Ⅳ單用組（P<0.05），3種藥物配伍低劑量組效應(yīng)強(qiáng)于各藥物單用組及AST Ⅳ+PNS配伍組（P<0.05或P<0.01）。見圖4-5。

3 討論

冰片口服后可經(jīng)胃腸道迅速吸收，廣泛分布于心、肺、脾臟，且極易透過血腦屏障進(jìn)入腦組織。冰片及其配伍抗腦缺血的作用主要反映在兩個方面：一是冰片單用具有一定的抗腦缺血作用，能減少腦缺血再灌注模型的腦梗死體積[17]，抑制大鼠腦缺血再灌注急性期炎癥損傷[18]，抑制氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡[19]。但冰片單用抗腦缺血的作用不強(qiáng)，常常作為佐使藥與其它藥物配伍使用，通過促進(jìn)藥物吸收和進(jìn)入病變部位，發(fā)揮協(xié)同增效作用。在抗腦缺血方面，研究表明，冰片配伍麝香可改善腦缺血動物血腦屏障通透性，減少腦梗死體積，抑制缺血后腦組織的炎癥反應(yīng)[20];冰片及丹參三七配伍后可通過促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）的表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用[21]。因此，以冰片配伍其它藥物，可促進(jìn)藥物吸收和進(jìn)入病變腦組織，增強(qiáng)藥物的抗腦缺血作用。

本研究采用均勻設(shè)計實驗，研究表明，腦缺血2 h再灌注24 h后，大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，腦梗死體積增大，腦含水量、神經(jīng)細(xì)胞損傷率增加，血腦屏障受損嚴(yán)重，呈現(xiàn)明顯的腦組織損傷。冰片、ASTⅣ、PNS不同劑量配伍可在一定程度上降低神經(jīng)功能評分，減輕神經(jīng)功能缺損癥狀，縮小腦梗死體積、降低腦含水量、神經(jīng)細(xì)胞損傷率，減輕血腦屏障受損。各指標(biāo)綜合加權(quán)計分的多重線性回歸分析表明，冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS 25 mg/kg配伍具有較好的抗腦缺血再灌注損傷作用，為三者抗腦缺血再灌注損傷的有效配伍劑量。驗證實驗結(jié)果顯示，3種藥物配伍的高、低劑量均能能顯著降低大鼠神經(jīng)功能評分，且3種藥物低劑量配伍的效應(yīng)顯著優(yōu)于各藥物單用，表明冰片、AST Ⅳ、PNS配伍可增強(qiáng)對腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損障礙的改善作用;同時，冰片、AST Ⅳ+PNS配伍，3種藥物高、低劑量配伍能顯著降低腦梗死率，3種藥物低劑量配伍效應(yīng)強(qiáng)于各藥物單用及AST Ⅳ+PNS配伍，也表明冰片、AST Ⅳ、PNS配伍對減輕腦缺血再灌注后腦組織損傷具有增效作用。至于冰片是否是通過促進(jìn)AST Ⅳ和PNS透過血腦屏障發(fā)揮協(xié)同增效作用，以及入腦后的具體作用機(jī)制如何，尚待我們進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 王隴德，王金環(huán)，彭? 斌，等.《中國腦卒中防治報告2016》概要[J]. 中國腦血管病雜志，2017，14（4）：217-224.

[2] 劉? 磊，劉麗華，馬玉奎.腦缺血再灌注損傷機(jī)制研究進(jìn)展[J].藥學(xué)研究，2016，35（9）：542-544.

[3] 侯? 昆，戴海龍，肖志成.腦缺血再灌注損傷研究進(jìn)展[J].中國心血管病研究，2016，14（1）：11-15.

[4] 李? 穎，黃? 楨，季曉霞，等.益氣活血法治療缺血性腦卒中研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012，10（9）：1112-1114.

[5] 黃小平，王? 蓓，邱詠園，等.黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1抗小鼠腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷和促進(jìn)能量代謝的配伍研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，34（7）：5-11.

[6] 李靜嫻，楊筱倩，唐? 標(biāo)，等.黃芪甲苷和三七總皂苷配伍抗大鼠腦缺血再灌注損傷及其藥動學(xué)的研究.中國中藥雜志，2017，42（19）： 3786-3794.

[7] HUANG X P， TAN H， CHEN B Y， et al. Combination of total astragalus extract and total panax notoginseng saponins strengthened the protective effects on brain damage through improving energy metabolism and inhibiting apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in mice[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine， 2017， 23（6）： 445-452.

[8] HUANG X P， DING H， Lu J D， et al. Effects of the combination of the main active components of astragalus and panax notoginseng on inflammation and apoptosis of nerve cell after cerebral ischemia-reperfusion[J]. American Journal of Chinese Medicine， 2015， 43（7）： 1419-1438.

[9] CHANG Y X， SUN Y G， LI J， et al. The experimental study of astragalus membranaceus on meridian tropsim： The distribution study of astragaloside IV in rat tissues[J]. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences， 2012， 911： 71-75.

[10] ZHANG W D， ZHANG C， LIU R H， et al. Preclinical pharmacokinetics and tissue distribution of a natural cardioprotective agent astragaloside IV in rats and dogs[J]. Life Sciences， 2006， 79（8）： 808-815.

[11] LIU H， YANG J， DU F， et al. Absorption and disposition of ginsenosides after oral administration of panax notoginseng extract to rats[J]. Drug Metabolism and Disposition， 2009，37（12）： 2290-2298.

[12] 王利蘋，奉建芳，胡凱莉.芳香開竅中藥對血腦屏障通透性的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2014，39（6）：949-954.

[13] 汪宏錦，吳俊杰，薛? 強(qiáng)，等.冰片對血腦屏障通透性的雙向調(diào)節(jié)作用影響因素及機(jī)制探討[J].中國中藥雜志，2017，42（11）：2200-2205.

[14] 張? 青，李茂利，趙? 陽，等.黃芪加冰片對大鼠腦缺血再灌注損傷后VEGF表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥，2010，50（7）：88.

[15] 吳俊杰，汪宏錦，楊? 帥，等.冰片對梓醇及葛根素透過局灶性腦缺血模型大鼠血腦屏障作用的研究[J].中國中藥雜志，2016，41（21）：3988-3995.

[16] 江? 君，楊巍巍，張? 楠，等.低氧預(yù)適應(yīng)減輕腦中動脈阻塞所致小鼠缺血性腦損傷[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，29（2）：113-118.

[17] 夏鑫華，劉亞敏，趙光峰.麝香配伍冰片對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的腦保護(hù)研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2009，15（2）：42-45.

[18] 何曉靜，呂慶杰，劉玉蘭.冰片注射液對缺血再灌注大鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響[J].華西藥學(xué)雜志，2006，21（6）：523-526.

[19] LIU R， ZHANG L， LAN X， et a1. Protection by borneol on cortical neurons against oxygen-glucose deprivation/reperfusion： involvement of anti-oxidation and anti-inflammation through nuclear transcription factor kapaB signaling pathway[J]. Neuroscience， 2011， 176： 408-419.

[20] 李? 歡，夏鑫華，劉? 梅，等.麝香配伍冰片干預(yù)局灶性腦缺血-再灌注損傷的代謝組學(xué)研究[J].中藥材，2012，35（8）：1274-1279.

[21] 胡利民，張艷軍，王? 威，等.冰片與丹酚酸B和三七總皂苷配伍對局灶性腦缺血-再灌注大鼠腦VEGF mRNA表達(dá)的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2005，12（5）：263-266.