向倩倩 楊佳瑤 侯梓淇

摘要：? 為建立三葉青毛狀根的誘導(dǎo)和液體培養(yǎng)體系，采用發(fā)根農(nóng)桿菌株系C58C1和ATCC15834進(jìn)行毛狀根的誘導(dǎo)，通過無菌三葉青葉片預(yù)培養(yǎng)、浸染、共培養(yǎng)、篩選、形態(tài)和PCR鑒定等過程獲得三葉青毛狀根根系，并對(duì)三葉青毛狀根和兩年生塊根總黃酮進(jìn)行比較分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1能從三葉青葉片誘導(dǎo)出毛狀根，三葉青毛狀根在不添加生長(zhǎng)素的1/2MS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)良好，其總黃酮含量約是2年生三葉青塊根的1/5。

關(guān)鍵詞：? 三葉青;? 毛狀根;? C58C1;? 黃酮;? 液體培養(yǎng)

三葉青（Tetrastigma hemsleyanum） 是葡萄科崖爬藤屬植物，俗名金線吊葫蘆、蛇附子、石老鼠等，為我國(guó)特有珍稀藥用植物，全草可入藥，以地下塊根最佳[ 1， 2 ]。近些年來，三葉青塊根被發(fā)現(xiàn)具有低毒和抗癌特性[ 3 - 10 ]，自然資源遭到規(guī)模化人為破壞[ 11 - 12 ]。三葉青自然生長(zhǎng)條件苛刻，生長(zhǎng)緩慢，人工栽培技術(shù)還不成熟，難以滿足快速增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。盡管人們對(duì)三葉青進(jìn)行了微繁和細(xì)胞培養(yǎng)研究，但規(guī)模化應(yīng)用明顯不足[ 13 - 14 ]。另一方面，人們?cè)谌~青塊根中發(fā)現(xiàn)了大量的黃酮類物質(zhì)[ 15 - 19 ]，但一直沒有確定其主效成分。毛狀根具有生長(zhǎng)速度快、遺傳穩(wěn)定、培養(yǎng)周期短、條件可控等優(yōu)點(diǎn)，可為植物次生代謝產(chǎn)物的規(guī)模生產(chǎn)、作物品種改良、環(huán)境修復(fù)以及相關(guān)理論的研究提供快捷的培養(yǎng)體系[ 20 ]。當(dāng)前，對(duì)于三葉青毛狀根的研究還較少[ 21 ]，為了解決這些問題，本研究建立了三葉青毛狀根的誘導(dǎo)程序，初步建立了其液體培養(yǎng)體系，為三葉青毛狀根培養(yǎng)、次生代謝物合成和代謝機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)希望起到保護(hù)三葉青野生資源的作用。

1 試驗(yàn)材料

三葉青苗（浙江理工大學(xué)植物學(xué)副教授楊宗岐博士鑒定）由杭州市三葉青農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，根據(jù)王靜等人[ 22 ]的方法獲得無菌試管苗。發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株C58C1和ATCC15834由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2 試驗(yàn)方法

2. 1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

采用MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基[ 23 ]，并進(jìn)行微調(diào)。毛狀根誘導(dǎo)體系用培養(yǎng)基：（1）發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB：牛肉浸膏5 g·L-1、 酵母浸膏1 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、MgSO4·H2O 0.5 g·L-1，pH：7.0～7.2。（2）葉片浸染液體培養(yǎng)基（ILD）（工作液濃度單位：mg·L-1，下同）：MS+6-BA（6-卞基胺基嘌呤，6-Benzylaminopurine）2+NAA（萘乙酸，1-naph-? thylacetic acid）0.5，蔗糖30 g·L-1，pH：5.2～5.4，滅菌后冷至室溫，加AS 25。（3）葉片預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基（PCM）：MS+6-BA 2+NAA 0.5，蔗糖30 g·L-1，pH=5.8，植物凝膠2.7 g·L-1。（4）共感染培養(yǎng)基（CID）：MS+6-BA 2+

NAA 0.5，蔗糖30 g·L-1，pH：5.2～5.4，植物凝膠2.7 g·L-1，滅菌后加AS 25。（5）除菌培養(yǎng)基（DM）：MS+6-BA 2+NAA 0.5，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0，植物凝膠2.7 g·L-1，特美?。═imentin，Ti）200，頭孢（Cefixime，cef）200。（6）毛狀根篩選培養(yǎng)基（SM1）：MS+NAA 0.3，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0，植物凝膠2.7 g·L-1，Ti 200，cef 200。（7）毛狀根繼代培養(yǎng)基（SCD1）：MS，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0，植物凝膠2.7 g·L-1，Ti 200，cef 200;（8）毛狀根繼代培養(yǎng)基（SCD2）：MS，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0，植物凝膠2.7 g·L-1。（9）毛狀根液體懸浮培養(yǎng)基（LSD）：1/2MS，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0。所有培養(yǎng)基經(jīng)115 ℃，15 min滅菌，培養(yǎng)基降溫至60 ℃以下時(shí)添加抗生素和AS。三葉青毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)和固體培養(yǎng)條件為25±2 ℃，暗培養(yǎng);三葉青毛狀根液體培養(yǎng)條件為25 ℃，轉(zhuǎn)速110 r/min，暗培養(yǎng)。

2. 2 毛狀根誘導(dǎo)

用無菌手術(shù)刀在三葉青無菌苗葉片表面劃出傷口，接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基（PCM）預(yù)培養(yǎng)3天。期間，將-80 ℃保存的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834和C58C1解凍后，取50 μL加入50 mL YEB液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)（28 ℃，220 r·min-1）16～18 h，OD600=0.4～

0.6。離心（4 ℃，5500 r·min-1，5 min），棄上清;用50 mL ILD懸浮菌體，搖床培養(yǎng)（25.5 ℃，150 r·min-1）1～1.5 h后，浸染預(yù)培養(yǎng)的三葉青葉片。室溫下，將預(yù)培養(yǎng)的三葉青葉片放入含有ATCC15834和C58C1菌的ILD浸染液中，浸染5 min。用無菌濾紙吸干葉片表面菌液，轉(zhuǎn)入CID培養(yǎng)基（培養(yǎng)基表面加一層無菌濾紙，用ILD潤(rùn)濕濾紙表面），共培養(yǎng)3天。然后，用無菌濾紙吸干葉片表面菌液，接入除菌培養(yǎng)基DM中培養(yǎng)7天，再將葉片轉(zhuǎn)入SM培養(yǎng)基中除菌7～10天。不定根長(zhǎng)度達(dá)0.5～2 cm時(shí)，將其切下，接種到SCD1培養(yǎng)基，每15天更換1次繼代培養(yǎng)基。繼代2次后，將毛狀根接種到SCD2培養(yǎng)基，15天更換1次培養(yǎng)基。

2. 3 毛狀根rol C基因的PCR檢測(cè)

按照植物DNA提取試劑盒（天根，北京）的方法提取三葉青毛狀根、無菌苗葉片的DNA。吸取菌液500 μL置于1.5 mL離心管，12 000 r·min-1離心2 min，去清液，加TE液100 μL（TE：10 mmo·L-1 Tris-HCl，1 mmo·L-1 EDTA，pH 8.0），重懸菌體，沸水煮5 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清于新離心管中，作為PCR檢測(cè)中的陽(yáng)性對(duì)照。

擴(kuò)增rolC基因的引物為 RolC-f：5'-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3'，Rol C-r：5'-TGCTTCGAGTTATGGGTACA- 3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為626 bp。PCR反應(yīng)總體積為25 μL，含有dNTP 2 μL，10 × PCR buffer 2.5 μL，RolC-f 1 μL，RolC-r 1 μL，rTaq酶（Takara，大連）0.13 μL，DNA template 1.0 μL，ddH2O 17.37 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性4? min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s的程序進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后在72 ℃下延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2. 4 毛狀根液體培養(yǎng)

鑒定為陽(yáng)性毛狀根的根系，選取生長(zhǎng)旺盛、分支多的毛狀根根系，吸水紙吸凈毛狀根表面的液體，稱取0.3 g，轉(zhuǎn)入100 ml LSD中進(jìn)行液體培養(yǎng)。

2. 5 總黃酮提取和含量測(cè)定

LSD1中培養(yǎng)60天的毛狀根和2年生三葉青塊根，用吸水紙吸干材料上的水分，冷凍真空干燥儀（SCIENTZ-12N，寧波）中進(jìn)行低溫冷凍干燥處理。干燥的毛狀根采用研磨儀研成細(xì)粉，過100目篩。稱取0.10 g樣品置于25 mL試管中，加入50%乙醇5 mL，室溫下超聲（KQ-500DE，昆山，頻率：40 kHz）1.5 h，取出后4 000 r·min-1離心10 min，上清移入10 mL容量瓶中，毛狀根殘?jiān)? mL 50%乙醇潤(rùn)洗2次之后4 000 r·min-1離心10 min，上清移入上述容量瓶中，用50%乙醇定容至10 mL。平行重復(fù)3次。

吸取0.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL），置于25 mL容量瓶中，加50%乙醇至6 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，快速搖勻，室溫放置6 min;再加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min;加入氫氧化鈉試液10 mL，用50%乙醇定容至25 mL，搖勻，放置15 min。以“0.0”為空白對(duì)照，利用紫外可見分光光度計(jì)（UV5200，上海）于500 nm處測(cè)定光吸收值。以光吸收值為縱坐標(biāo)，蘆丁的濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。同理，吸取樣品溶液2 mL置于25 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制中所用的方法對(duì)樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中總黃酮的含量。

3 結(jié)果和分析

3. 1 三葉青毛狀根誘導(dǎo)體系

研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834株系不能誘導(dǎo)三葉青毛狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1浸染三葉青無菌苗離體葉片，13天時(shí)，葉片切口周圍出現(xiàn)白色半透明的小突起（圖1a）。20天時(shí)，切口突起處周圍形成不定根（圖1b），待不定根長(zhǎng)至0.5～5 cm時(shí)（圖1c），將長(zhǎng)出的不定根從葉片切下，轉(zhuǎn)至SCD1培養(yǎng)基，經(jīng)過2～3次繼代培養(yǎng)后除凈農(nóng)桿菌。在繼代培養(yǎng)基SCD2上，大部分不定根由于沒有生長(zhǎng)素的作用而停止生長(zhǎng)，少量不定根在30～40天時(shí)可見大量增殖（圖1d），這些不定根為毛狀根候選根系。

3. 2 三葉青毛狀根PCR鑒定

Rol C基因是Ri質(zhì)粒上誘導(dǎo)毛狀根生長(zhǎng)的重要基因，也通常用于毛狀根的鑒定。利用引物Rol C-f和Rol C-r對(duì)毛狀根候選根系中的2個(gè)根系（RH1和RH2）、三葉青葉片以及C58C1質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增。由三葉青毛狀根rol C基因PCR鑒定結(jié)果（圖2）可以看出，通過與Marker比較，陽(yáng)性對(duì)照和2個(gè)毛狀根候選根系在同一位置檢測(cè)到了特異性擴(kuò)增條帶，2組陰性對(duì)照中沒有檢測(cè)到相關(guān)條帶。這說明，RH1（圖1d）和RH2兩個(gè)候選根系為陽(yáng)性毛狀根系。從形態(tài)學(xué)來看，在沒有添加植物生長(zhǎng)素的情況下，RH1（圖1d）根系發(fā)育良好，生長(zhǎng)旺盛，分支較多，呈匍匐狀分布在培養(yǎng)基表面，根尖的向地性減弱，而不定根（圖1c）在生長(zhǎng)到一定長(zhǎng)度時(shí)，根能深入到固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，根的分支很少發(fā)生。

3. 3 三葉青毛狀根液體培養(yǎng)

將在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛的毛狀根RH1（圖1d）轉(zhuǎn)移到LSD中，12天新根長(zhǎng)出（圖1e），30天毛狀根生長(zhǎng)加快（圖1f），一般可以培養(yǎng)到70天。擴(kuò)大培養(yǎng)后，得到良好的三葉青毛狀根培養(yǎng)體系，液體培養(yǎng)基中的三葉青毛狀根呈圓形團(tuán)塊狀，這應(yīng)該與培養(yǎng)時(shí)所用圓底三角瓶形狀和搖床的規(guī)律性圓周轉(zhuǎn)動(dòng)有關(guān)。毛狀根中間部位顏色較深，越向外顏色越淺，中間的深色部位由老根形成，而周圍顏色較淺的毛狀根是新生長(zhǎng)出來的。

3. 4 總黃酮測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，三葉青毛狀根（RH1）中總黃酮的含量7.211 mg·g-1，顯著（p<0.01），低于2年生三葉青塊根中總黃酮含量（33.566 mg·g-1），前者約是后者的1/5。

4 結(jié)論和討論

4. 1 發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根的體系已在多種植物中得到研究，不同植物的誘導(dǎo)條件不盡相同，沒有固定模式可循。菌株類型、菌液濃度、外植體類型選擇、化學(xué)因子（例如外源激素和培養(yǎng)基成分）等條件均會(huì)影響毛狀根誘導(dǎo)的效率，因此，針對(duì)不同植物的毛狀根誘導(dǎo)需要篩選適宜的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化條件。在本試驗(yàn)中，初步選擇了發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834和C58C1兩個(gè)菌株來探索不同菌株類型對(duì)于三葉青毛狀根誘導(dǎo)的影響。我們發(fā)現(xiàn)ATCC15834菌株在試驗(yàn)條件下沒能誘導(dǎo)出毛狀根，而C58C1菌株則可以，而Du等人采用K599菌株獲得了三葉青的毛狀根[ 21 ]。這些可能與不同菌株對(duì)植物的感染能力差異導(dǎo)致的，包括植物的不同組織外植體，外植體的狀態(tài)等[ 23 - 24 ]。因此，還需要進(jìn)一步研究不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對(duì)三葉青不同組織的感染特性，最終獲得穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

4. 2 三葉青毛狀根（RH1）中總黃酮的含量7.211 mg·g-1，2年生三葉青塊根中總黃酮含量33.566 mg·g-1，前者約是后者的1/5。Du等人利用重組型發(fā)根農(nóng)桿菌K599誘導(dǎo)三葉青葉片產(chǎn)生毛狀根，得到6個(gè)株系，其總黃酮含量最低為17.917 mg·g-1，最高為64.167 mg·g-1，均高于我們得到的毛狀根[ 21 ]。這可能與實(shí)驗(yàn)室取材時(shí)間、發(fā)根農(nóng)桿菌菌株以及采用的三葉青株系有關(guān)，其原因還需要進(jìn)一步的研究。田思迪等人研究發(fā)現(xiàn)，NAA、IAA、IBA 在適宜的濃度下均能促進(jìn)金鐵鎖毛狀根的生長(zhǎng)和皂苷積累[ 25 ];孫彬賢等人通過對(duì)MS ， B5 ， 6 .7-V 及White 4組液體培養(yǎng)基進(jìn)行比較，人參毛狀根的生物量和人參皂苷的含量在MS液體培養(yǎng)基中達(dá)到最大，且利用激素預(yù)處理有利于人參毛狀根的培養(yǎng)[ 26 ]。三葉青毛狀根在1/2MS液體培養(yǎng)基上增殖速率較慢且總黃酮含量較低，還需要通過改良培養(yǎng)基成分等對(duì)培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化，獲得更佳的培養(yǎng)體系。

4. 3 本研究采用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1菌株、無菌葉片建立了三葉青毛狀根誘導(dǎo)和初步培養(yǎng)體系，為加快其次生代謝物的積累、生物合成等研究提供了基礎(chǔ)。然而，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根的過程較為復(fù)雜，影響因素較多，該體系還需要進(jìn)一步優(yōu)化，促進(jìn)其生物量的快速增加，提高其次生代謝物的積累。

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