李娟 張彥文

摘要：? 對從紅松林下新鮮子實(shí)體上分離純化得到的兩株外生菌根菌WSJ-1和WSJ-3進(jìn)行ITS序列分析，確定其分別為赭絲膜菌（Cortinarius russus）和美味牛肝菌（Boletus edulis） 。采用打孔注菌法，將兩株外生菌根菌分別與東北紅豆杉幼苗共同培養(yǎng)，研究其對東北紅豆杉幼苗生長的影響。結(jié)果表明：赭絲膜菌與美味牛肝菌均可與紅豆杉幼苗形成菌根，菌根侵染率分別為46.7%和35.0%;接種赭絲膜菌與美味牛肝菌后，均能顯著提高東北紅豆杉幼苗的鮮重、干重、苗高和地徑的性狀（P<0.05），其中赭絲膜菌效果優(yōu)于美味牛肝菌。

關(guān)鍵詞：? 東北紅豆杉;? 外生菌根菌;? 幼苗生長

外生菌根菌是一類可與宿主植物根系共生形成外生菌根的真菌[ 1 ]。研究表明，外生菌根菌的形成有利于植物對水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，可提高植株根系的適應(yīng)性和宿主抗性，從而促進(jìn)苗木生長[ 2 - 3 ]。東北紅豆杉（Taxus cuspidata）是東北及華北地區(qū)優(yōu)良的造林、庭院樹種，其樹皮中含有抗癌活性物質(zhì)紫杉醇及紫杉烷類化合物[ 4 ]。目前，東北紅豆杉可通過播種、扦插等方式進(jìn)行人工種植，但其幼苗生長緩慢，移栽成活率低。一些研究表明，馬勃、絲膜菌及牛肝菌等外生菌根菌對針葉苗木生長、移栽定植存活率均有顯著促進(jìn)作用[ 5 - 10 ]。因此，本試驗(yàn)將從紅松林新鮮子實(shí)體上分離得到的兩株菌根真菌進(jìn)行鑒定，并研究其對東北紅豆杉幼苗苗高、苗木生物量、地莖的苗木生長指標(biāo)影響，以期為培育優(yōu)良的東北紅豆杉幼苗，提高造林移栽成活率奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試紅豆杉幼苗為1年生東北紅豆杉實(shí)生苗，引自遼寧省丹東市金溝科技生態(tài)園東北紅豆杉繁育苗圃。試驗(yàn)用菌株為WSJ-1和WSJ-3，該菌株在遼寧省白石砬子自然保護(hù)區(qū)紅松林下采集的新鮮子實(shí)體上分離得到，現(xiàn)保存于遼東學(xué)院微生物工程實(shí)驗(yàn)室。

PDA：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖10.0 g，瓊脂20.0 g，水1 000 mL。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖10.0 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，水1 000 mL。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 菌根菌ITS序列分析

將待測菌株WSJ-1和WSJ-3分別接種在PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)3天后，用滅菌槍頭挑取適量尖端菌絲，置于50μL 菌體裂解液（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）中，80 ℃水浴15 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液作為PCR模板。采用通用引物（ITS1： 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCGG- 3';ITS4：5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC- 3'）擴(kuò)增ITS序列。擴(kuò)增體系（50 uL）：1×Taq PCR Master Mix 25μL，DNA模板2 μL（0.1～10 ng），引物（10 μmol/L）各2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，由生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行純化、測序拼接。所得序列在NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行在線比對。

1. 2. 2 菌根菌液體菌劑的制備

將試驗(yàn)菌株在PDA平板上活化后，用直徑6 mm的無菌打孔器制備菌餅，在無菌條件下接種至500 mL三角瓶中，置于恒溫振蕩器上培養(yǎng)4天，培養(yǎng)溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min。制備的液體菌劑冷藏備用，使用前按照祁金玉等方法對菌液進(jìn)行處理[ 5 ]。

1. 2. 3 試驗(yàn)設(shè)置

選取株高及長勢一致的紅豆杉1年生實(shí)生幼苗180株，地面上平均高度5.2 cm，于當(dāng)年11月休眠后取出，在營養(yǎng)缽內(nèi)定植。次年5月，將上述定植于營養(yǎng)缽內(nèi)的試驗(yàn)材料隨機(jī)分成9組，每組20株，共設(shè)置3個處理，分別為WSJ-1處理組（CR），WSJ-? 3處理組（BE）和對照組（CK），每個處理3組重復(fù)，進(jìn)行菌根菌侵染試驗(yàn)。

試驗(yàn)采用打孔注菌法進(jìn)行菌根菌接種，即在各試驗(yàn)組幼苗周圍均勻打6個孔，孔深約5 cm，每孔加入培養(yǎng)好的菌液20 mL后覆土;對照組做同樣處理，加入的樣品為無菌PDA液體培養(yǎng)基，然后 所有處理均置于丹東金溝科技生態(tài)園溫室中培育。接種150天后，用解剖鏡觀察菌根，統(tǒng)計(jì)侵染率 [ 8 ];然后每個處理組隨機(jī)選取10株樣品，測量苗高、地徑和鮮重;最后將樣本放入60 ℃干燥箱內(nèi)，烘干24 h后取出測量干重[ 5 ]。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 外生菌根菌WSJ-1和WSJ-3的ITS序列分析

以外生菌根菌WSJ-1和WSJ-3的基因組DNA為模板，對其ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得2條600 bp左右的特異性片段（圖1）。測序及序列在線比對結(jié)果表明：外生菌根菌WSJ-1與赭絲膜菌（Cortinarius russus）序列相似性為99%;外生菌根菌WSJ-3與美味牛肝菌（Boletus edulis）序列相似性為99%。因此，WSJ-1鑒定為赭絲膜菌;WSJ-3鑒定為美味牛肝菌。

2. 2 外生菌根菌侵染情況

由不同處理對東北紅豆杉幼苗生長的影響（表1）可知：赭絲膜菌（CR）和美味牛肝菌（BE）均可與紅豆杉幼苗形成外生菌根。其中，赭絲膜菌處理組的菌根侵染率為46.7%，美味牛肝菌處理組的菌根侵染率為35.0%，對照組無外生菌根形成。

2. 3 不同處理對紅豆杉幼苗生長的影響

由不同處理對東北紅豆杉幼苗生長的影響（表1）可知：CR與BE分別接種紅豆杉幼苗150天后，苗高較CK均有顯著提高（P<0.05）。CR處理組平均苗高達(dá)26.31 cm，與CK相比提高 52.4%;BE處理組平均苗高為22.46 cm，與CK相比提高30.1%，CR處理組對紅豆杉幼苗苗高的促進(jìn)作用更為明顯。

接種CR后，紅豆杉幼苗地徑較對照組增加39.6%，有顯著提高（P<0.05）。BE處理組地徑增加28.3%（P<0.05）。

兩組處理中，紅豆杉幼苗鮮重與干重較CK均顯著增加（P<0.05）。CR處理組的平均鮮重達(dá)51.02 g，平均干重達(dá)20.41 g，分別比對照組提高52.7%和35.8%。BE處理組的鮮重達(dá)47.79 g，干重達(dá)19.12 g，分別比CK提高43.0%和27.2%，CR處理組對紅豆杉幼苗鮮重、干重的促進(jìn)作用更為明顯。

3 結(jié)論

分離自遼寧省白石砬子自然保護(hù)區(qū)紅松林下的兩株外生菌根菌WSJ-1和WSJ-3分別為赭絲膜菌和美味牛肝菌。在試驗(yàn)條件下，兩株外生菌根菌赭絲膜菌與美味牛肝菌均可與紅豆杉幼苗形成菌根，并均能顯著提高東北紅豆杉幼苗鮮重、干重、苗高和地徑，其中赭絲膜菌效果優(yōu)于美味牛肝菌。

參考文獻(xiàn)

[1] 張婷，? 文曉鵬.? 混合接種外生菌根菌對馬尾松種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J].? 種子，? 2016，? 35（10）：? 1 - 5.

[2] 別格堅(jiān)巴哈提，? 鄧玉俠，? 尹大川，? 等.? 樟子松苗木促生長高效外生菌根菌的篩選[J].? 林業(yè)科技，? 2017，? 42（3）：? 31 - 33.

[3] 金陳斌.? 外生菌根菌促進(jìn)白皮松和檜柏古樹生長的應(yīng)用[J]. 廣西林業(yè)科學(xué)，? 2018，? 47（2）：? 233 - 236.

[4] 徐博超，? 周志強(qiáng)，? 李 威，? 等.? 東北紅豆杉幼苗對不同水分條件的光合和生理響應(yīng)[J].? 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，? 2013，? 34（4）： 73 - 78.

[5] 祁金玉，? 鄧?yán)^峰，? 尹大川，? 等.? 外生菌根菌對油松幼苗抗氧化酶活性及根系構(gòu)型的影響[J].? 生態(tài)學(xué)報， 2019，? 39（8）：? 1 - 6.

[6] 梁軍，? 張穎，? 賈秀貞，? 等.? 外生菌根菌對楊樹生長及抗逆性指標(biāo)的效應(yīng)[J].? 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2003，? 27（4）：? 39 - 43.

[7] 翟帥帥，? 丁貴杰，? 王藝，? 等.? 褐環(huán)乳牛肝菌對馬尾松幼苗根系構(gòu)型的影響[J].? 森林與環(huán)境學(xué)報，? 2015，? 35（3）：? 243 - 248.

[8] 孫民琴，? 吳小芹，? 葉建仁.? 外生菌根真菌對不同松樹出苗和生長的影響[J].? 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），? 2007，? 31（5）： 39 - 43.

[9] 欒慶書，? 王淑清，? 呂曉紅，? 等.? 高效外生菌根菌復(fù)合菌劑的研究[J].? 遼寧林業(yè)科技，? 2003（6）：? 4 - 7.

[10] 王建康，? 薛煜，? 左振鑫，? 等.? 菌根菌接種對樟子松高生長影響的研究[J].? 中國森林病蟲，? 2016，? 35（6）：? 9 - 12.