李立明 張秋瑩 栗四方 花光斌 李向楠

[摘要]目的 探討AT富集序列特異性結(jié)合蛋白1（SATB1）在食管鱗狀細(xì)胞癌（簡稱鱗癌）組織中的表達(dá)及意義。方法 選取食管鱗癌病人103例，采用免疫組化法檢測鱗癌及癌旁組織中SATB1蛋白表達(dá)。培養(yǎng)人食管鱗癌Eca109細(xì)胞，將其隨機(jī)分為siRNA-SATB1組、siRNA-對照組和空白對照組，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測細(xì)胞中SATB1基因表達(dá)，MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力。結(jié)果 食管鱗癌組織SATB1蛋白陽性表達(dá)率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=33.669，P<0.05）;與高分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織比較，中低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管鱗癌組織SATB1蛋白陽性表達(dá)率顯著升高（χ2=14.766～27.333，P<0.05）。siRNA-SATB1組細(xì)胞中SATB1 mRNA相對表達(dá)量顯著低于siRNA-對照組和空白對照組（F=172.993，P<0.05）;siRNA-SATB1組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72和96 h時的吸光度值均顯著低于siRNA-對照組和空白對照組（F=10.286～29.154，P<0.05）;siRNA-SATB1組24和48 h時劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于siRNA-對照組和空白對照組（F=62.696～136.852，P<0.05）。結(jié)論 食管鱗癌組織中SATB1蛋白呈高表達(dá)，且參與腫瘤惡性進(jìn)展，沉默SATB1基因可減少食管鱗癌細(xì)胞增殖，抑制鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲。

[關(guān)鍵詞]食管腫瘤;癌，鱗狀細(xì)胞;核基質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)類;細(xì)胞增殖;腫瘤侵襲;腫瘤轉(zhuǎn)移

[中圖分類號]R735.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號] 2096-5532（2019）05-0572-05

doi：10.11712/jms201905017

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

食管癌作為我國高發(fā)的惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移率高、生存率低、預(yù)后差等特點，是嚴(yán)重威脅我國人群健康的重要腫瘤類型[1-2]。鱗狀細(xì)胞癌（簡稱鱗癌）是我國食管癌的主要病理學(xué)類型，占食管癌的90%以上[3]。目前，食管鱗癌的具體發(fā)病機(jī)制尚沒有完全的清楚。AT富集序列特異性結(jié)合蛋白1（SATB1）作為新近發(fā)現(xiàn)的一種基因調(diào)節(jié)因子，是在細(xì)胞或組織中特異性表達(dá)的核基質(zhì)結(jié)合域DNA結(jié)合蛋白，與細(xì)胞增殖、分化、凋亡關(guān)系密切[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SATB1參與了多種惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程[5-7]。本研究通過檢測SATB1蛋白在食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，探討其表達(dá)與食管鱗癌病人臨床病理特征之間的關(guān)系，并利用小分子干擾RNA（siRNA）技術(shù)沉默SATB1基因，觀察SATB1基因沉默后食管鱗癌Eca109細(xì)胞增殖和運(yùn)動能力的變化情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年3月—2017年4月，選擇在我院擇期行手術(shù)治療的食管鱗癌病人103例作為研究對象，所有研究對象術(shù)前均未進(jìn)行放化療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷為食管鱗癌。其中，男性62例，女性41例;年齡43～74歲，平均（59.2±12.6）歲;腫瘤部位：食管上段26例，中段52例，下段25例;分化程度：中低分化77例，高分化26例;TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期47例，Ⅲ～Ⅳ期56例;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例。手術(shù)過程中取腫瘤組織及距離腫瘤>5 cm的癌旁組織，用甲醛固定后石蠟包埋保存。

本研究獲我院倫理委員會批準(zhǔn)，病人或近親屬對研究方案知情并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和設(shè)備

兔抗人SATB1多克隆抗體購自美國Abcam公司，免疫組化試劑盒購自上海拜力生物科技公司，人食管鱗癌Eca109細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，RPMI-1640培養(yǎng)液、脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒、胎牛血清和總RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑及PCR試劑購自大連寶生物公司，SATB1及內(nèi)參引物由上海生工生物公司設(shè)計合成，SATB1干擾序列、對照序列均由上海吉瑪制藥有限公司設(shè)計合成，MTT試劑盒購自美國Sigma公司，Transwell小室購自北京樂博生物科技公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 研究方法

1.3.1 鱗癌及癌旁組織中SATB1蛋白表達(dá)的檢測

按照SP免疫組化試劑盒說明進(jìn)行操作。將石蠟標(biāo)本切片（約厚4 μm）脫蠟、梯度乙醇水化，加入體積分?jǐn)?shù)為0.03的過氧化氫溶液，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，以微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，使用山羊血清封閉15 min，加入兔抗人SATB1多克隆抗體（1∶800稀釋），在4 ℃條件下過夜孵育，以PBS沖洗3次，加入二抗，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，透明后封片，顯微鏡下觀察。隨機(jī)取5個高倍視野，按半定量法判定結(jié)果。按染色強(qiáng)度評分：0分，無著色;1分，染成淡黃色;2分，染成黃色;3分，染成棕褐色。按陽性細(xì)胞比例評分：0分，陽性細(xì)胞≤5%;1分，陽性細(xì)胞6%～25%;2分，陽性細(xì)胞26%～50%;3分，陽性細(xì)胞>50%。根據(jù)染色強(qiáng)度得分和陽性細(xì)胞比例得分乘積判定結(jié)果：0～1分為陰性，2～9分為陽性[8]。每張切片均由兩位病理科醫(yī)師采用盲法獨(dú)立完成判定。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 Eca109細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度>80%時進(jìn)行消化、傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行分組并轉(zhuǎn)染：空白對照組（A組）細(xì)胞只加入培養(yǎng)液;siRNA-對照組（B組）細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA對照序列;siRNA-SATB1組（C組）細(xì)胞利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染SATB1基因的干擾序列。SATB1基因的干擾序列和對照序列見表1。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測細(xì)胞中SATB1基因表達(dá) 取3組轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，裂解，提取總RNA，并檢測總RNA純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按PCR試劑盒說明書以cDNA為模板對引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列見表2。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、30 s，53 ℃、30 s，60 ℃、30 s，連續(xù)進(jìn)行40個循環(huán)。用2-△△Ct法計算細(xì)胞中SATB1基因表達(dá)量[9-10]。

1.3.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 取3組細(xì)胞，消化，按每孔5×103個接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)12、24、48、72和96 h時，將MTT液20 μL加入各孔，孵育4 h，棄去上清，將二甲基亞砜150 μL加入各孔，振蕩反應(yīng)15 min，于酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長處各孔吸光度（A）值[11-12]。

1.3.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 取各組細(xì)胞，消化，離心，用無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按每孔105個接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁融合度達(dá)90%以上時，用200 μL的移液器槍頭劃痕，以PBS沖洗3次，去除漂浮的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、24和48 h時，用顯微鏡觀察并測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-24或48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.3.6 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力 用無血清培養(yǎng)液按1∶10稀釋Matrigel膠，平鋪于上室，風(fēng)干備用。取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，消化，用無血清培養(yǎng)液按109/L重懸細(xì)胞。取細(xì)胞懸液200 μL加入上室，下室則加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的培養(yǎng)液500 μL，恒溫培養(yǎng)12 h，乙醇固定10 min，結(jié)晶紫染色，將小室內(nèi)散落的細(xì)胞用棉簽拭去，鏡下隨機(jī)取10個視野觀察穿膜細(xì)胞數(shù)[13-14]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗;計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌及癌旁組織中SATB1蛋白表達(dá)

SATB1蛋白主要表達(dá)于食管鱗癌細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，以細(xì)胞質(zhì)中為主，見圖1。SATB1蛋白在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率為78.6%，顯著高于癌旁組織的38.8%（χ2=33.669，P<0.05）。

2.2 SATB1蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

不同性別、年齡、部位和浸潤深度的食管鱗癌組織SATB1蛋白表達(dá)差異無顯著性（P>0.05）;與高分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織比較，中低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織SATB1蛋白陽性表達(dá)率顯著升高（χ2=14.766～27.333，P<0.05）。見表3。

2.3 各組細(xì)胞SATB1基因表達(dá)比較

SATB1 mRNA在siRNA-SATB1組、siRNA-對照組和空白對照組細(xì)胞中的相對表達(dá)量分別為1.15±0.16、9.25±1.01和9.66±1.17（n=6），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=172.993，P<0.01）。兩兩比較，siRNA-SATB1組細(xì)胞SATB1 mRNA相對表達(dá)量低于siRNA-對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.915、11.117，P<0.05）。

2.4 各組細(xì)胞增殖能力比較

與siRNA-對照組和空白對照組比較，siRNA-SATB1組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72和96 h時的A值均有顯著降低（F=10.286～29.154，P<0.05），提示siRNA-SATB1組細(xì)胞增殖能力被抑制。見圖2。

2.5 各組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較

siRNA-SATB1組24和48 h時劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于siRNA-對照組和空白對照組，差異有顯著意義（F=62.696～136.852，P<0.05）。見表4、圖3。

3 討論

食管癌是臨床常見的惡性腫瘤，不易早期診斷，加之腫瘤轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，病人臨床確診時多數(shù)已處于中晚期，錯失最佳治療時機(jī)[15-16]。盡管近年來食管癌的臨床診療手段不斷提高，但病人5年生存率依然較低，不足30%[17]。因此，近年來食管癌研究重點集中在發(fā)現(xiàn)影響腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的相關(guān)基因或分子機(jī)制，以期為食管癌治療干預(yù)提供靶標(biāo)。SATB1基因位于人染色體3p23區(qū)，與核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合后，在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、翻譯中發(fā)揮重要的作用[18]。有研究表明，SATB1基因在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，可作為一種基因調(diào)節(jié)因子參與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程[19]。有研究指出，SATB1可以通過調(diào)控影響腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的多個基因靶位，如Bcl-2、C-myc、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）等，而改變腫瘤細(xì)胞侵襲性，從而加速腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[20]。本研究結(jié)果顯示，食管鱗癌組織SATB1蛋白陽性表達(dá)率較癌旁組織高，表明SATB1蛋白可能發(fā)揮癌基因的作用而參與了食管鱗癌的發(fā)生。

本研究結(jié)果還顯示，SATB1蛋白在中低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的陽性表達(dá)率明顯升高，表明SATB1蛋白高表達(dá)與食管鱗癌惡性程度及轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示SATB1高表達(dá)可能增強(qiáng)了食管鱗癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。為進(jìn)一步探討SATB1對食管鱗癌Eca109細(xì)胞系的影響，本研究將SATB1基因特異性沉默，觀察SATB1基因沉默后食管鱗癌Eca109細(xì)胞增殖和運(yùn)動能力的變化情況。結(jié)果顯示，siRNA-SATB1組的SATB1 mRNA相對表達(dá)量較其他各組均有明顯的降低，提示siRNA-SATB1組細(xì)胞SATB1基因表達(dá)被成功抑制。siRNA-SATB1組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72和96 h時的A值均較siRNA-對照組和空白對照組顯著降低，提示抑制SATB1基因表達(dá)后，siRNA-SATB1組細(xì)胞增殖能力被顯著抑制[21]。

本文研究結(jié)果還顯示，siRNA-SATB1組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)較siRNA-對照組和空白對照組均明顯降低，說明沉默SATB1基因表達(dá)后，細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯降低[22]，提示SATB1基因可能與食管鱗癌細(xì)胞遷移及侵襲過程關(guān)系密切。

綜上所述，食管鱗癌組織中SATB1蛋白呈高表達(dá)，且參與腫瘤惡性進(jìn)展，沉默SATB1基因可減少食管鱗癌細(xì)胞增殖，抑制鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲，有望為食管鱗癌機(jī)制研究及基因治療提供新的靶位。

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（本文編輯 馬偉平）