洪嘉煒　陳明強(qiáng)　鄧正華　李有寧　馬振華　顧志峰　王雨

摘要：【目的】明確恩諾沙星對馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）腸道微生物群落的影響，了解其變化規(guī)律，為制定馬氏珠母貝細(xì)菌感染的最佳治療方案提供參考依據(jù)。【方法】采用16S rDNA測序定量評價(jià)不同恩諾沙星處理濃度（0、5和10 mg/L）下馬氏珠母貝腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的變化情況，并運(yùn)用生物信息學(xué)手段在門和屬水平上比較分析各處理間馬氏珠母貝腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異性。【結(jié)果】從9個(gè)馬氏珠母貝腸道內(nèi)容物樣品（PA1、PA2、PA3、PB1、PB2、PB3、PC1、PC2和PC3）中共獲得755159個(gè)有效序列，分別歸屬于9個(gè)門48個(gè)屬。在門水平上，對照處理（PA，0 mg/L）馬氏珠母貝腸道的優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）和厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度分別為40.65%、33.87%和15.75%;兩個(gè)恩諾沙星處理（PB，5 mg/L;PC，10 mg/L）的優(yōu)勢菌均為變形菌門，相對豐度分別為91.61%和85.00%。在屬水平上，PA處理馬氏珠母貝腸道的優(yōu)勢菌屬為支原體屬（Mycoplasma）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、檸檬酸細(xì)菌屬（Citrobacter）和埃希氏菌—志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella），相對豐度分別為26.33%、12.22%、10.62%和9.66%;PB處理的優(yōu)勢菌屬為弧菌屬（Vibrio），相對豐度為52.10%;PC處理的優(yōu)勢菌屬為弧菌屬和發(fā)光桿菌屬（Photobacterium），相對豐度分別為40.24%和23.43%。操作分類單元（OTU）聚類分析結(jié)果表明，3個(gè)處理（PA、PB和PC）的共有OUTs為138個(gè)，占OTUs總數(shù)的54.76%;PB和PC處理的共有OUTs達(dá)176個(gè)，即這兩個(gè)處理間具有更高的相似性?！窘Y(jié)論】恩諾沙星處理濃度達(dá)5 mg/L時(shí)即對馬氏珠母貝腸道微生物群落產(chǎn)生影響，并使其暴露于弧菌等致病菌的威脅下，因此在馬氏珠母貝養(yǎng)殖生產(chǎn)中須謹(jǐn)慎使用恩諾沙星。

關(guān)鍵詞： 馬氏珠母貝;恩諾沙星;腸道微生物;α多樣性;相對豐度;高通量測序

中圖分類號： S968.316 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）05-1104-07

Abstract：【Objective】The aim of the study was to investigate the possible impact of enrofloxacin on Pinctada fucata martensii， find out the changing rule and provide a reference for the optimal treatment of bacterial infection in P. fucata martensii. 【Method】The microbial shifts in the intestine of P. fucata martensii in response to enrofloxacin treatments at di-fferent dosages（0， 5， and 10 mg/L） were quantitatively evaluated using 16S rDNA gene sequencing， and the similarities and differences of intestinal microbial community structure among different treatments were compared and analyzed by bioinformatics at the phylum and genus levels. 【Result】A total of 755159 effective sequences were obtained from 9 intestinal contents samples of P. fucata martensii（PA1， PA2， PA3， PB1， PB2， PB3， PC1， PC2 and PC3），belonging to ? 48 genera and 9 phyla. At the phylum level， the dominant genera of the control （PA， 0 mg/L） was Proteobacteria， Tenericutes and Firmicutes， whose relative abundances were 40.65%，33.87% and 15.75%， respectively. Nevertheless， the dominant phylum in two enrofloxacin treatment groups（PB， 5 mg/L; PC， 10 mg/L） were Proteobacteria， the relative abundance of which have reached 91.61% and 85.00% respectively. At the genus level， the dominant phylum of PA treatment were Mycoplasma， Exiguobacterium， Citrobacter， Escherichia-Shigella， the relative abundance of which were 26.33%， 12.22%，10.62% and 9.66%，respectively. Vibrio held the dominant position of PB， and its relative abundance was 52.10%. Vibrio and Photobacterium made up the most share of microbial community of PC， which collectively accounted for 40.24% and 23.43% respectively. OTU cluster analysis showed that there were 138 OTUs in three treatments（PA， PB and PC）， accounting for 54.76% of the total OTUs. 176 OUTs were shared by PB and PC， which meaned that there was a higher similarity between the two treatments. 【Conclusion】Overall， enrofloxacin alters the microbial community diversity of P. fucata martensii as the dosage reaches 5 mg/L， and exposes them to the threat of pathogenic bacteria such as Vibrio. Therefore， the use of enrofloxacin should be carefully considered in the culture of P. fucata martensii.

Key words： Pinctada fucata martensii; enrofloxacin; intestinal microorganisms; α diversity; relative abundance; high-throughput sequencing

0 引言

【研究意義】動物腸道寄宿有大量微生物，在腸道中維持著一種動態(tài)和穩(wěn)定平衡，并在宿主的消化、營養(yǎng)吸收和免疫等方面發(fā)揮重要作用（Burgents et al.，2004;Pérez et al.，2010;米海峰等，2015;Yamashiro，2017）。當(dāng)腸道菌群結(jié)構(gòu)遭受破壞時(shí)，微生物相互間的動態(tài)平衡被打破，而增加宿主患病的風(fēng)險(xiǎn)，致使宿主健康受到極大威脅（Ring et al.，2003;Round and Mazmanian，2009），即維持腸道菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定十分重要。馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）是我國南方地區(qū)主要養(yǎng)殖的珍珠貝類之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值（王大鵬等，2011;楊創(chuàng)業(yè)等，2015;李俊輝等，2017），但作為無脊椎動物其缺乏特殊的免疫系統(tǒng)以抵抗各種病原體的侵染和減緩環(huán)境壓力的影響（吳寧等，2017），因此，明確馬氏珠母貝的腸道微生物結(jié)構(gòu)及其功能顯得尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，由于養(yǎng)殖海區(qū)水體環(huán)境的不斷惡化，各種病害頻繁暴發(fā)導(dǎo)致珍珠貝類養(yǎng)殖生產(chǎn)遭受巨大損失，其中由細(xì)菌引起的疾病已受到廣泛關(guān)注。恩諾沙星（Enrofloxacin）作為一種高效的廣譜抗菌劑，對許多細(xì)菌性疾病具有顯著抑制作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于動物細(xì)菌性疾病的防治（馬驛等，2007;郭荔等，2017），如水產(chǎn)常見的出血性敗血癥、爛鰓病和腸炎病等（劉開永和汪開毓，2004;劉禮輝等，2015;陸專靈等，2016），但其產(chǎn)生的副作用亦不容忽視。恩諾沙星與其他抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖上所產(chǎn)生的副作用一樣，主要包括產(chǎn)生耐藥菌株、藥物殘留、抑制免疫系統(tǒng)及破壞微生態(tài)平衡（胡夢紅，2006）。其中，微生態(tài)平衡的破壞不僅對周圍水體環(huán)境有害，還會對水產(chǎn)動物腸道的微生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生影響，尤其當(dāng)不合理施用抗生素時(shí)，將嚴(yán)重破壞腸道微生態(tài)平衡而危害宿主健康（陸武等，2009）。目前，關(guān)于抗生素對動物腸道微生物群落影響的研究主要集中于人類和陸生哺乳動物（老鼠、豬和雞等），一致認(rèn)為抗生素的施用可抑制腸道菌群正常定植，引起菌群紊亂，使腸道微生物的多樣性降低，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性而影響宿主的生理代謝及免疫等相關(guān)功能（李同洲等，1999;王俐等，2003;王愛麗等，2009;劉穎等，2017;紀(jì)明宇等，2017）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，關(guān)于水產(chǎn)動物（特別是貝類）暴露于抗生素（尤其是恩諾沙星）后其腸道微生物群落變化的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用第三代測序技術(shù)（單分子測序技術(shù)）分析恩諾沙星對馬氏珠母貝腸道微生物多樣性的影響，以期了解其變化規(guī)律，進(jìn)而為制定針對馬氏珠母貝細(xì)菌感染的最佳治療方案提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)動物

供試馬氏珠母貝（殼長59.55±0.64 mm，殼高60.40±0.27 mm，殼寬22.18±0.36 mm，體重33.63±0.71 g）購自海南省陵水新村市場，運(yùn)至中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心后，參照Chen等（2016）的方法暫養(yǎng)2周，選擇大小相近、健康無傷的個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)。

1. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理，分別為0、5和10 mg/L恩諾沙星。在3個(gè)體積為400 L的玻璃鋼桶中分別調(diào)制出3個(gè)恩諾沙星濃度的海水，水體中恩諾沙星濃度根據(jù)Fang等（2012）的方法進(jìn)行確定，然后將30只健康的馬氏珠母貝分組吊養(yǎng)在不同玻璃鋼桶中（每桶10只）。浸泡周期24 h，試驗(yàn)期間不投喂餌料。浸泡結(jié)束后，從每處理中隨機(jī)取3只馬氏珠母貝，分別記作0 mg/L（標(biāo)號PA1、PA2和PA3）、5 mg/L（標(biāo)號PB1、PB2和PB3）和10 mg/L（標(biāo)號PC1、PC2和PC3）。對馬氏珠母貝進(jìn)行解剖并取出其內(nèi)臟團(tuán)，以無菌生理鹽水沖洗干凈后用滅菌剪刀和鑷子取其腸道，經(jīng)無菌水沖洗干凈，以75%乙醇浸泡3 min，再用無菌水反復(fù)沖洗3次，然后將腸道內(nèi)容物放入1.5 mL無菌離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 DNA提取及擴(kuò)增

參照陳明強(qiáng)等（2019）的方法提取馬氏珠母貝腸道微生物總DNA，采用Qubit? 3.0熒光光度計(jì)和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的含量和質(zhì)量。以Illumina MiSeq平臺設(shè)計(jì)的特異引物擴(kuò)增馬氏珠母貝腸道微生物16S rDNA序列V3～V4可變區(qū)，其中，上游引物為：5'-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVG AAT-3'，下游引物為：5'-GGACTACNVGGGTWTCT AATCC-3'。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：2.5 μL TransStart緩沖液，2.0 μL dNTPs，上游、下游引物各1.0 μL，20 ng模板DNA，以去離子水補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 5 s，57 ℃ 90 s，72 ℃ 10 s，進(jìn)行24個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，擴(kuò)增產(chǎn)物混合后以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，并按Quick Gel提取試劑盒（QIAGEN公司）說明對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離與純化，再構(gòu)建基因文庫。

1. 4 高通量測序及生物信息學(xué)分析

采用Qubit? 3.0分光光度計(jì)檢測基因文庫，并定量至10 nM，然后上樣至Illumina MiSeq設(shè)備進(jìn)行高通量測序（Illumina，San Diego，CA，USA），采用PE 250/300測序策略進(jìn)行測序。測序后，對所得原始序列進(jìn)行質(zhì)控過濾，采用Flash對通過質(zhì)控的序列進(jìn)行連接（Mago? and Salzberg，2011），并用Qiime對連接上的序列進(jìn)行過濾，過濾原則：舍棄序列長度>200 bp、含模糊或錯(cuò)配堿基且平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥20的序列，再用Uchime Algorithm去除嵌合體后得到有效數(shù)據(jù)（Caporaso et al.，2010）。以相似性為97%為標(biāo)準(zhǔn)，運(yùn)用Uparse對所得的有效序列進(jìn)行操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）聚類，所得結(jié)果輸入Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫，利用RDP Classifier貝葉斯算法進(jìn)行物種注釋（Wang et al.，2007），得到不同組別馬氏珠母貝腸道微生物組成情況。根據(jù)OUT聚類分析結(jié)果，繪制樣品的稀釋曲線及含系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類熱圖，直觀顯示各處理間的相似性和差異性。同時(shí)，分析各處理間的共有或特有OUT，繪制韋恩圖。最后，采用Qiime計(jì)算馬氏珠母貝腸道微生物群落的α多樣性指數(shù)，包括ACE、Chao1、Shannon、Simpson和覆蓋率（Goods_coverage）等指數(shù)。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），分析不同恩諾沙星處理組間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 腸道微生物α多樣性

9個(gè)馬氏珠母貝腸道內(nèi)容物樣品經(jīng)高通量測序后，分別得到109453（PA1）、129088（PA2）、141645（PA3）、51689（PB1）、50522（PB2）、110106（PB3）、129984（PC1）、53587（PC2）和66401（PC3）條原始序列，經(jīng)連接、過濾及去除嵌合體后，分別得到97606、115752、131113、43011、45565、98874、116546、45906和60786條有效序列。有效序列在相似性為97%的水平上進(jìn)行OTU聚類，共得到252個(gè)OTUs，3個(gè)處理分別聚類得到196、198和198個(gè)OTUs。從9個(gè)樣品的稀釋曲線（圖1）可看出，隨測序深度的增加，OTU數(shù)量隨之增加，稀釋曲線趨于平緩，OTU數(shù)量達(dá)峰值，測序結(jié)果可靠。同時(shí)，3個(gè)處理組的Goods_coverage均為100.0%，說明各樣品的全部微生物均被檢測到。

由表1可看出，PB處理馬氏珠母貝腸道微生物的ACE指數(shù)（162.69）、Chao1指數(shù)（166.48）、Shannon指數(shù)（4.94）和Simpson指數(shù)（0.93）最高，但與PA和PC處理的差異不顯著（P>0.05），表明不同恩諾沙星濃度處理下馬氏珠母貝腸道微生物的豐度和多樣性無明顯差異。

2. 2 腸道微生物群落結(jié)構(gòu)

OTU代表序列經(jīng)RDP Classifier分類工具物種注釋后，共檢測到9個(gè)菌門48個(gè)菌屬。在門水平上，腸道微生物的相對豐度如圖2-A所示。數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，9個(gè)被檢測到的菌門分別為：變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、軟壁菌門（Tenericutes）、螺旋菌門（Spirochaetae）和異常球菌—棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）。其中，PA處理馬氏珠母貝腸道的優(yōu)勢菌門為變形菌門、軟壁菌門和厚壁菌門，相對豐度分別為40.65%、33.87%和15.75%;PB和PC處理馬氏珠母貝腸道的優(yōu)勢菌門相同，均為變形菌門，相對豐度分別達(dá)91.61%和85.00%。

在屬水平上，馬氏珠母貝腸道微生物的相對豐度如圖2-B所示。其中，PA處理馬氏珠母貝腸道的優(yōu)勢菌屬為支原體屬（Mycoplasma）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和埃希氏菌—志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella），相對豐度分別為26.33%、12.22%、10.62%和9.66%;PB處理馬氏珠母貝腸道的優(yōu)勢菌屬為弧菌屬（Vibrio），相對豐度為52.10%;PC處理馬氏珠母貝腸道的優(yōu)勢菌屬為弧菌屬和發(fā)光桿菌屬（Photobacterium），相對豐度分別為40.24%和23.43%。

2. 3 各處理間微生物群落的相似性

根據(jù)OTU聚類分析結(jié)果，分析不同處理馬氏珠母貝腸道微生物的共有和特有OTU，結(jié)果（圖3）顯示，3個(gè)處理的共有OTUs為138個(gè)，占OTUs總數(shù)的54.76%。PA處理馬氏珠母貝腸道微生物特有的OTUs數(shù)最多，為32個(gè)，而PB和PC處理分別為8和10個(gè)。此外，PB和PC處理馬氏珠母貝腸道微生物的共有OTUs達(dá)176個(gè)，表明這兩個(gè)處理間具有更高的相似性。

按照各處理馬氏珠母貝腸道微生物在屬水平下前30個(gè)相對豐度最高的物種分布繪制其聚類熱圖，通過熱圖顏色差異可直觀顯示各物種的相似性和差異性。結(jié)果（圖4）顯示，低濃度恩諾沙星處理（PB）和高濃度恩諾沙星處理（PC）聚為一支，二者與對照處理（PA）的距離相對較遠(yuǎn)，即聚類熱圖顯示的結(jié)果與依據(jù)韋恩圖得出的結(jié)果一致。

3 討論

腸道微生態(tài)系統(tǒng)對動物機(jī)體來說十分重要，其與宿主共同形成一個(gè)生理上的統(tǒng)一體，兩者互相依存、互相影響，在正常情況下保持著相對穩(wěn)定的平衡狀態(tài)（陶可等，2008）。當(dāng)腸道菌群的微生態(tài)平衡受外界因素（環(huán)境條件、病原體和藥物等）破壞時(shí)，其生理功能（營養(yǎng)代謝和免疫力等）將受到影響，從而影響宿主的生長發(fā)育及其健康水平（尹軍霞和林德榮，2004;米海峰等，2015）?？股匾驯蛔C實(shí)可對腸道微生態(tài)產(chǎn)生一定負(fù)面影響（丁麗等，2009），因此，利用16S rDNA測序技術(shù)研究恩諾沙星對馬氏珠母貝腸道微生物群落的影響，對制定馬氏珠母貝細(xì)菌感染的最佳治療方案具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，從9個(gè)樣品（PA1、PA2、PA3、PB1、PB2、PB3、PC1、PC2和PC3）中共獲得755159個(gè)有效序列，歸屬于9個(gè)門，分別為變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門、放線菌門、藍(lán)藻門、擬桿菌門、軟壁菌門、螺旋菌門和異常球菌—棲熱菌門。目前，關(guān)于水產(chǎn)動物腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果基本相似。在南移池塘養(yǎng)殖的仿刺身腸道中以厚壁菌門和變形菌門為主（楊求華等，2016），凡納濱對蝦腸道的優(yōu)勢菌門是變形菌門（何遠(yuǎn)法等，2017），牙鲆初孵仔魚腸道的優(yōu)勢菌為厚壁菌門和變形菌門（劉增新等，2017），攝食全豆粕蛋白飼料的牛蛙腸道中則以變形菌門、梭桿菌門和厚壁菌門占主導(dǎo)地位（王健等，2018）。本研究結(jié)果也表明，門水平下的馬氏珠母貝腸道微生物群落以變形菌門、軟壁菌門和厚壁菌門為主，相對豐度分別為40.65%、33.87%和15.75%。

本研究通過對比發(fā)現(xiàn)，馬氏珠母貝經(jīng)恩諾沙星處理后，不管是低濃度處理（PB，5 mg/L）還是高濃度處理（PC，10 mg/L）其腸道優(yōu)勢菌相對于對照處理（PA，0 mg/L）均發(fā)生明顯變化，其中，變形菌門相對豐度分別驟升到91.61%和85.00%，軟壁菌門相對豐度則大幅降至1.36%和2.41%。軟壁菌門是一類缺乏細(xì)胞壁的獨(dú)特細(xì)菌，對人類有較高的致病性（Razin et al.，1998），對水產(chǎn)動物是否具有致病作用尚未明確，但根據(jù)軟壁菌門對恩諾沙星具有較強(qiáng)的敏感性，可選用恩諾沙星作為抑菌劑以降低軟壁菌門可能存在的致病風(fēng)險(xiǎn)。此外，Shin等（2015）研究認(rèn)為變形菌門在腸道中占比的增加是腸道微生態(tài)失調(diào)的重要標(biāo)志，同時(shí)是一種潛在的疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果表明，在恩諾沙星曝露下馬氏珠母貝腸道中變形菌門的相對豐度大幅上升，經(jīng)恩諾沙星處理后均超過85.00%，暗示馬氏珠母貝腸道微生態(tài)已失去平衡。抗生素的過度使用破壞了腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，削弱對病原菌定殖的抵抗力，變形菌門乘機(jī)大量繁殖。變形菌門中很多種類為條件致病菌，如大腸桿菌和霍亂弧菌等（林養(yǎng)等，2009），用藥后變形菌門的增加可能會導(dǎo)致其顯現(xiàn)出致病性，因此，恩諾沙星導(dǎo)致以變形菌門大量繁殖為特征的腸道微生態(tài)紊亂應(yīng)受到高度重視，臨床上須謹(jǐn)慎選擇合理的治療方案，以減少恩諾沙星引起的不良影響。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，變形菌門中的弧菌屬在施藥后明顯增加，恩諾沙星低濃度處理（PB，5 mg/L）和高濃度處理（PC，10 mg/L）的弧菌屬相對豐度分別達(dá)52.10%和40.24%?；【鷱V泛流行于全國范圍內(nèi)的海域環(huán)境中，作為一種條件致病菌可引起海水養(yǎng)殖魚類、貝類及甲殼類等暴發(fā)細(xì)菌性疾病，最終導(dǎo)致養(yǎng)殖生物大量死亡（吳后波和潘金培，2001;楊少麗等，2005）?；【鷮僭诳股靥幚硐虏唤捣瓷默F(xiàn)象，與許燕等（2018）用氟苯尼考干預(yù)斑石鯛的結(jié)果存在差異，可能是弧菌對于兩種抗生素的敏感性不一致所引起。本研究中，弧菌屬大量繁殖表明馬氏珠母貝在恩諾沙星治療中會受到致病弧菌的威脅，因此在馬氏珠母貝養(yǎng)殖生產(chǎn)中須謹(jǐn)慎考慮恩諾沙星的使用。

4 結(jié)論

恩諾沙星處理濃度達(dá)5 mg/L時(shí)即對馬氏珠母貝腸道微生物群落產(chǎn)生影響，并使其暴露于弧菌等致病菌的威脅下，因此在馬氏珠母貝養(yǎng)殖生產(chǎn)中須謹(jǐn)慎使用恩諾沙星。

參考文獻(xiàn)：

陳明強(qiáng)，李有寧，鄧正華，于剛，馬振華，鄭興，洪嘉煒，魏海軍，王雨. 2019. 恩諾沙星曝露下企鵝珍珠貝腸道微生物多樣性及優(yōu)勢菌變化規(guī)律[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，50（4）：851-859. [Chen M Q，Li Y N，Deng Z H，Yu G，Ma Z H，Zheng X，Hong J W，Wei H J，Wang Y. 2019. Intestinal microbial diversity and dominant bacteria change analysis of Pteria penguin（R?ding） under enrofloxacin exposure[J]. Journal of Southern Agriculture，50（4）：851-859.]

丁麗，周維仁，章世元，宦海琳，徐小明，顧金. 2009. 益生菌在水產(chǎn)上的應(yīng)用及其對魚類腸道菌群的影響[J]. 飼料工業(yè)，30（20）：27-30. [Ding L，Zhou W R，Zhang S Y，Huan H L，Xu X M，Gu J. 2009. Application of probio-tics in aquaculture and effects on intestinal microflora in fish[J]. Feed Industry，30（20）：27-30.]

郭荔，胡冬民，戴小華，王麗平. 2017. 糖尿病大鼠P-糖蛋白編碼基因Abcb1 mRNA的表達(dá)及其對口服恩諾沙星藥動學(xué)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，33（4）：874-880. [Guo L，Hu D M，Dai X H，Wang L P. 2017. Abcb1 mRNA expre-ssion levels in different organs of diabetic rats and the effect on pharmacokinetics of oral enrofloxain[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，33（4）：874-880.]

何遠(yuǎn)法，遲淑艷，譚北平，張含樂，董曉慧，楊奇慧，劉泓宇，章雙. 2017. 酵母培養(yǎng)物對凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，37（4）：21-27. [He Y F，Chi S Y，Tan B P，Zhang H Y，Dong X H，Yang Q H，Liu H Y，Zhang S. 2017. Effect of yeast culture on intestinal microbiota of Litopenaeus vannamei[J]. Journal of Guangdong Ocean University，37（4）：21-27.]

胡夢紅. 2006. 抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用、存在的問題及對策[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào)，33（5）：217-221. [Hu M H. 2006. The application，problems and countermeasures of antibio-tics in aquaculture[J]. Fisheries Science & Technology Information，33（5）：217-221.]

紀(jì)明宇，汪運(yùn)山，楊煒華. 2017. 早期使用抗生素對小兒腸道微生態(tài)及生長發(fā)育的影響[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，29（6）：731-734. [Ji M Y，Wang Y S，Yang W H. 2017. Influence of early-life pulsed antibiotic treatment on gut microbio-me and growth of infants[J]. Chinese Journal of Microe-cology，29（6）：731-734.]

李俊輝，羅燕秋，鐘雅詩，黃怡，黃榮蓮，王慶恒，鄧岳文. 2017. 近交對馬氏珠母貝生長性狀、遺傳多樣性及礦化基因表達(dá)的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，48（1）：132-138. [Li J H，Luo Y Q，Zhong Y S，Huang Y，Huang R L，Wang Q H，Deng Y W. 2017. Effects of inbreeding on growth traits，genetic diversity and biomineraliazation gene expression of Pinctada fuctada martensii[J]. Journal of Southern Agriculture，48（1）：132-138.]

李同洲，臧素敏，李德發(fā). 1999. 飼用抗生素對仔豬腸道菌群及腸道物質(zhì)代謝影響的研究[J]. 飼料研究，（5）：3-5. [Li T Z，Zang S M，Li D F. 1999. Effects of feeding antibiotics on intestinal microflora and metabolism of intestinal substances in piglets[J]. Feed Research，（5）：3-5.]

林養(yǎng)，白樺，吳春芳. 2009. 變形桿菌對常用抗生素的耐藥性分析[J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，15（4）：327-328. [Lin Y，Bai H，Wu C F. 2009. Analysis of antibiotics resistance of proteus[J]. Journal of Hainan Medical College，15（4）：327-328.]

劉開永，汪開毓. 2004. 恩諾沙星在水產(chǎn)中的應(yīng)用與研究[J]. 中國獸藥雜志，38（10）：32-34. [Liu K Y，Wang K Y. 2004. Study and practice on enrofloxacin in fishery[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug，38（10）：32-34.]

劉禮輝，張德鋒，李寧求，石存斌，顏曦，付小哲，林強(qiáng). 2015. 鯪魚源無乳鏈球菌的鑒定、血清型分析及藥敏試驗(yàn)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，46（11）：2053-2058. [Liu L H，Zhang D F，Li N Q，Shi C B，Yan X，F(xiàn)u X Z，Lin Q. 2015. Identification，serotype analysis and drug sensitivity test of Streptococcus agalactiae from Cirrhinus molitorella[J]. Journal of Southern Agriculture，46（11）：2053-2058.]

劉穎，王海斌，周剛，霍永久，董麗，王海飛，包文斌，喻禮懷. 2017. 抗生素對仔豬腸道微生物的影響[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，29（8）：2912-2922. [Liu Y，Wang H B，Zhou G，Huo Y J，Dong L，Wang H F，Bao W B，Yu L H. 2017. E-ffects of antibiotics on intestinal microorganisms of piglets[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition，29（8）：2912-2922.]

劉增新，柳學(xué)周，史寶，徐永江，劉權(quán). 2017. 牙鲆（Paralichthys olivaceus）仔稚幼魚腸道菌群結(jié)構(gòu)比較分析[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，38（1）：111-119. [Liu Z X，Liu X Z，Shi B，Xu Y J，Liu Q. 2017. Composition of intestinal bacterial community of Japanese flounder（Paralichthys olivaceus） during early life stages[J]. Progress in Fishery Sciences，38（1）：111-119.]

陸武，沈紅芬，劉軍. 2009. 抗菌藥物致腸道菌群失調(diào)的機(jī)制及防治[J]. 藥學(xué)服務(wù)與研究，9（3）：222-224. [Lu W，Shen H F，Liu J. 2009. Imbalance of intestinal flora induced by antibacterials，and its treatment and prevention[J]. Pharmaceutical Care and Research，9（3）：222-224.]

陸專靈，鐘一治，趙忠添，雷燕，韋友傳，張益峰. 2016. 黃喉擬水龜白眼病病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，47（11）：1974-1978. [Lu Z L，Zhong Y Z，Zhao Z T，Lei Y，Wei Y C，Zhang Y F. 2016. Isolation，identification and drug sensitivity test of pathogen causing withe eye disease of Mauremys mutica[J]. Journal of Southern Agriculture，47（11）：1974-1978.]

馬驛，陳杖榴，曾振靈. 2007. 恩諾沙星對土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，27（8）：3400-3406. [Ma Y，Chen Z L，Zeng Z L. 2007. Effects of enrofloxacin on functional diversity of soil microbial communities[J]. Acta Ecologica Sinica，27（8）：3400-3406.]

米海峰，孫瑞健，張璐，李寶圣，王武剛，吳業(yè)陽，王用黎. 2015. 魚類腸道健康研究進(jìn)展[J]. 中國飼料，（15）：19-22. [Mi H F，Sun R J，Zhang L，Li B S，Wang W G，Wu Y Y，Wang Y L. 2015. Research progress on the fish intestine[J]. China Feed，（15）：19-22.]

陶可，王永才，童曉莉，周勤飛，譚智忠，熊宜強(qiáng). 2008. 兔不同時(shí)期胃腸道內(nèi)微生物區(qū)系的變化與消化道疾病的調(diào)控[J]. 中國養(yǎng)兔雜志，（5）：44-46. [Tao K，Wang Y C，Tong X L，Zhou Q F，Tan Z Z，Xiong Y Q. 2008. A review on bacterial flora of the rabbit gastrointestinal tract in diffe-rent stage and the controlling of digestive system disease[J]. Chinese Journal of Rabbit Farming，（5）：44-46.]

王愛麗，武慶斌，孫慶林. 2009. 抗生素對新生大鼠腸道菌群和腸道免疫發(fā)育的影響[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，21（6）：512-514. [Wang A L，Wu Q B，Sun Q L. 2009. Influences of antibiotics administration on the intestinal flora and immune system development of neonatal rats[J]. Chinese Journal of Microecology，21（6）：512-514.]

王大鵬，何安尤，曹占旺，甘西. 2011. 北海營盤新馬氏珠母貝養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)殖容量的研究[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，42（12）：1555-1559. [Wang D P，He A Y，Cao Z W，Gan X. 2011. Carrying capacity of Yingpan new Pinctada martensii culture area in Beihai City，Guangxi[J]. Journal of Sou-thern Agriculture，42（12）：1555-1559.]

王健，王玲，魯康樂，宋凱，張春曉. 2018. 攝食全豆粕蛋白飼料的牛蛙腸道微生物組成[J]. 集美大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），23（4）：241-248. [Wang J，Wang L，Lu K L，Song K，Zhang C X. 2018. An analysis of the gut microbial co-mmunity of bullfrog[Rana（Lithobates） catesbeiana] fed with soybean meal based diets[J]. Journal of Jimei University（Natural Science），23（4）：241-248.]

王俐，蔡輝益，劉國華. 2003. 不同抗生素對肉雞腸道微生物的影響[J]. 中國飼料，（6）：21-22. [Wang L，Cai H Y，Liu G H. 2003. The effect of application different antibio-tics on microorganism of broiler[J]. China Feed，（6）：21-22.]

吳后波，潘金培. 2001. 弧菌屬細(xì)菌及其所致海水養(yǎng)殖動物疾病[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，8（1）：89-93. [Wu H B，Pan J P. 2001. Progress in studies of vibriosis in aquaculture[J]. Journal of Fishery Sciences of China，8（1）：89-93.]

吳寧，陳夢玫，王素芳. 2017. 貝類免疫機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 藥物生物技術(shù)，24（1）：68-71. [Wu N，Chen M M，Wang S F. 2017. Research progress of shellfish immune mechanism[J]. Pharmaceutical Biotechnology，24（1）：68-71.]

許燕，王印庚，張正，姜燕，廖梅杰，李彬，王凱，李文生. 2018. 不同健康程度和抗生素氟苯尼考干預(yù)下斑石鯛腸道菌群的結(jié)構(gòu)差異[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，42（3）：388-398. [Xu Y，Wang Y G，Zhang Z，Jiang Y，Liao M J，Li B，Wang K，Li W S. 2018. Variance analysis of bacterial community in the intestine of cultured spotted knifejaw（Oplegnathus punctatus） at different healthy levels and intervened with florfenicol[J]. Journal of Fisheries of China，42（3）：388-398.]

楊創(chuàng)業(yè)，吳丹陽，王慶恒，鄧岳文，杜曉東. 2015. 馬氏珠母貝生長性狀遺傳力估計(jì)[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，31（23）：25-29. [Yang C Y，Wu D Y，Wang Q H，Deng Y W，Du X D. 2015. Heritability estimation for growth traits of Pinctada martensii[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，31（23）：25-29.]

楊求華，陸振，林琪，黃瑞芳，何麗斌，葛輝，周宸，杜虹. 2016. 南移池塘養(yǎng)殖仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)分析[J]. 漁業(yè)研究，38（3）：192-201. [Yang Q H，Lu Z，Lin Q，Huang R F，He L B，Ge H，Zhou C，Du H. 2016. Bacterial component analysis of the gut of South Apostichopus japonicus cultured in pond[J]. Journal of Fisheries Research，38（3）：192-201.]

楊少麗，王印庚，董樹剛. 2005. 海水養(yǎng)殖魚類弧菌病的研究進(jìn)展[J]. 海洋水產(chǎn)研究，26（4）：75-83. [Yang S L，Wang Y G，Dong S G. 2005. Progress of research on vibriosis in marine cultured fish[J]. Marine Fisheries Research，26（4）：75-83.]

尹軍霞，林德榮. 2004. 腸道菌群與疾病[J]. 生物學(xué)通報(bào)，39（3）：26-28. [Yin J X，Lin D R. 2004. Intestinal microbiota and diseases[J]. Bulletin of Biology，39（3）：26-28.]

Burgents J E，Burnett K G，Burnett L E. 2004. Disease resistance of Pacific white shrimp，Litopenaeus vannamei，fo-llowing the dietary administration of a yeast culture food supplement[J]. Aquaculture，231（1-4）：1-8.

Caporaso J G，Kuczynski J，Stombaugh J，Bittinger K，Bushman F D，Costello E K，F(xiàn)ierer N，Pe?a A G，Goodrich J K，Gordon J I，Huttley G A，Kelley S T，Knights D，Koenig J E，Ley R E，Lozupone C A，McDonald D，Muegge B D，Pirrung M，Reeder J，Sevinsky J R，Turnbaugh P J，Walters W A，Widmann J，Yatsunenko T，Zaneveld J，Knight R. 2010. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nature Methods，7（5）：335-336.

Chen H，Song Q，Diao X，Zhou H. 2016. Proteomic and metabolomic analysis on the toxicological effects of Benzo[a]pyrene in pearl oyster Pinctada martensii[J]. Aquatic Toxicology，175：81-89.

Fang X，Liu X，Liu W，Lu C. 2012. Pharmacokinetics of enrofloxacin in allogynogenetic silver crucian carp，Carassius auratus gibelio[J]. Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，35（4）：397-401.

Mago? T，Salzberg S L. 2011. FLASH：Fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies[J]. Bioinformatics，27（21）：2957-2963.

Pérez T，Balcázar J L，Ruiz-Zarzuela I，Halaihel N，Vendrell D，de Blas I，Múzquiz J L. 2010. Host-microbiota interactions within the fish intestinal ecosystem[J]. Mucosal Immunology，3（4）：355-360.

Razin S，Yogev D，Naot Y. 1998. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas[J]. Microbiology & Molecular Biology Reviews，62（4）：1094-1156.

Ring E，Olsen R E，Mayhew T M，Myklebust R. 2003. Electron microscopy of the intestinal microflora of fish[J]. Aquaculture，227（1-4）：395-415.

Round J L，Mazmanian S K. 2009. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease[J]. Nature Reviews Immunology，9（5）：313-323.

Shin N R，Whon T W，Bae J W. 2015. Proteobacteria：Microbial signature of dysbiosis in gut microbiota[J]. Trends in Biotechnology，33（9）：496-503.

Wang Q，Garrity G M，Tiedje J M，Cole J R. 2007. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequen-ces into the new bacterial taxonomy[J]. Applied and Environmental Microbiology，73（16）：5261-5267.

Yamashiro Y. 2017. Gut microbiota in health and disease[J]. Annals of Nutrition & Metabolism，71（3-4）：242-246.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）