李雁云 周防震 孫夢凡

摘 要：利用正交試驗設(shè)計優(yōu)化藤茶果實中二氫楊梅素的提取工藝。以甲醇為溶劑，利用索式提取的方法提取藤茶果實和種子中的二氫楊梅素;在此基礎(chǔ)上，以甲醇體積、提取溫度和提取時間為因素，采用等水平正交表L9（34）設(shè)計三因素三水平試驗。結(jié)果表明：藤茶果實中二氫楊梅素的含量顯著高于藤茶種子;二氫楊梅素提取的最佳工藝條件為1 g藤茶樣本，甲醇用量150 mL，提取溫度85℃，提取時間4 h，該條件下藤茶果實中二氫楊梅素含量為44.77 mg·g-1。藤茶果實二氫楊梅素含量高于藤茶籽，更適于作為二氫楊梅素提取的材料;甲醇提取較之乙醇，更有利于藤茶果實中二氫楊梅素的提取，而溫度是決定提取率的最主要因素。

關(guān)鍵詞：藤茶; 二氫楊梅素; 正交試驗

Abstract： The orthogonal experimental design was used to optimize the extraction technology of dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata fruits. With the methanol as solvent， the dihydromyricetin was extracted from the fruits and seeds of Ampelopsis grossedentata by using the method of soxhlet extraction. On this basis， the volume of methanol， extraction temperature and extraction time were taken as factors to design the three-factor and three-level orthogonal experiment L9（34）. The results showed that the content of dihydromyricetin in Ampelopsis grossedentata fruits was significantly higher than that in Ampelopsis grossedentata seeds. The optimal technological conditions for the extraction of dihydromyricetin were as follows： 1 g Ampelopsis grossedentata as the sample， 150 mL methanol， 85℃ extraction temperature， 4 h extraction time， and the content of dihydromyricetin in Ampelopsis grossedentata fruit was 44.77 mg·g-1 under these conditions. As the content of dihydromyricetin in Ampelopsis grossedentata fruit was higher than that in Ampelopsis grossedentata seed， Ampelopsis grossedentata fruit was more suitable material for the extraction of dihydromyricetin. Compared with ethanol， the extraction by methanol was more beneficial to the extraction of dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata fruits， and the temperature was the main factor determining the extraction rate.

Key words： Ampelopsis grossedentata; Dihydromyricetin; Orthogonal experimental

藤茶Amepelopsis grossedentata，又名顯齒蛇葡萄，是葡萄科蛇葡萄屬的一種野生藤本植物，是一種非常古老的中草藥資源、類茶植物資源和藥食兩用植物資源。二氫楊梅素是藤茶的主要活性成分，具有抗氧化、保肝護肝、消炎、止咳、降血糖、降血脂、增強免疫和抗腫瘤[1]等多種生理藥理活性。

目前藤茶二氫楊梅素的提取和制備主要采用藤茶幼嫩莖葉為原料[2-4]，而有關(guān)藤茶果實二氫楊梅素的提取和制備方面的研究鮮見報道。本試驗以藤茶果實為原料，以二氫楊梅素含量為指標(biāo)，通過正交試驗設(shè)計優(yōu)化溶劑體積、提取溫度和提取時間，確定藤茶果實中二氫楊梅素的最佳提取條件，以期進一步促進藤茶果實的開發(fā)與利用。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 酶標(biāo)儀、電子天平、索氏提取器、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、干燥箱、DFY500粉碎機（江陰市新友機械制造有限公司）、恒溫水浴鍋、移液槍。

1.1.2 材料 試驗用藤茶果實于2018年10月4日采摘于來鳳縣大河鎮(zhèn)。甲醇、乙醇、二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品（98%，HPLC）購于上海同田生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

李雁云等：藤茶果實中二氫楊梅素的提取工藝研究2019年第5期

2019年第5期李雁云等：藤茶果實中二氫楊梅素的提取工藝研究

1.2.1 原料處理 藤茶果實采摘于恩施市來鳳縣大河鎮(zhèn)兩河口，洗凈后，分為兩部分。其中1份剝皮、留籽，將籽洗凈、平鋪晾干至恒重，而后置于粉碎機中粉碎成粉末，放于容器中貼好標(biāo)簽備用。另1份藤茶果實直接晾干至恒重，粉碎，備用。

1.2.2 測定波長的確定 稱取少量二氫楊梅素純品，溶解取樣置于96孔板中，于酶標(biāo)儀中掃描測定得掃描圖譜，根據(jù)掃描圖譜確定二氫楊梅素的最大吸收波長。

1.2.3 試驗材料的確定 各稱取1.0000 g藤茶果實粉末和藤茶籽粉末，分別用150 mL甲醇和150 mL乙醇、在80℃的條件下用索氏提取抽提4 h，取樣置于酶標(biāo)儀測量。利用OriginPro 8.0軟件進行數(shù)據(jù)作圖分析，確定試驗材料。

1.2.4 索氏提取 用電子天平稱取1.0000 g樣本粉末，用濾紙包成圓柱形，放入索氏提取器內(nèi)，在燒瓶里加入甲醇，水浴加熱回流提取，自然冷卻，用傾瀉法將燒瓶中的提取液轉(zhuǎn)移到燒杯中，用少量甲醇洗滌燒瓶2～3次，合并提取液，定容至250 mL容量瓶。

1.2.5 正交試驗設(shè)計 以二氫楊梅素的含量為指標(biāo)，對影響二氫楊梅素含量的甲醇用量（100、150、200 mL）、提取溫度（75℃、80℃、85℃）、提取時間（4、6、8 h）3個因素進行L9（34）等水平正交試驗設(shè)計，確定最佳提取條件。

1.3 含量測定

1.3.1 二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 稱取適量二氫楊梅素純品，制得濃度梯度為2、4、6、8、10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液，并依次于酶標(biāo)儀中測量。求得291 nm處吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 藤茶果實中二氫楊梅素含量測定 采用紫外分光光度法測定藤茶中二氫楊梅素的含量[5]。稱取1.000 g藤茶果實粉末，索氏提取后，將容量瓶中的提取液用200 μL移液槍移至96孔板中，移4～6個置于酶標(biāo)儀中，測量291 nm下的吸光度，取其平均值，然后在二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用OriginPro 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用SPSS 20.0進行正交試驗數(shù)據(jù)的方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氫楊梅素的掃描吸收光譜

結(jié)合掃描吸收光譜與相關(guān)文獻報道，確定最大吸收峰為291 nm，故采用291 nm作為二氫楊梅素濃度測定的波長（圖1）。

2.2 溶劑及果實部位對二氫楊梅素提取量的影響

藤茶果實中的二氫楊梅素顯著高于藤茶種子;且藤茶果實的甲醇提取物中二氫楊梅素含量顯著高于乙醇提取物（圖2）。故采用甲醇作為藤茶果實中二氫楊梅素的抽提試劑。

2.3 二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)曲線

以二氫楊梅素濃度為橫坐標(biāo)，291 nm吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制散點圖（圖3），通過非線性回歸分析，建立回歸方程為：y =-0.04114+0.03626×e0.2039x，R=0.93719;回歸方程極顯著。

2.4 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果表明，3個因素對藤茶果實二氫楊梅素提取影響程度大小依次為溫度、甲醇用量、時間，各因素最優(yōu)水平組合為A2B3C2（表1）。

方差分析表明（表2），在顯著性水平α=0.10時，甲醇用量A和時間C兩因素的各水平間差異不顯著（P>0.10）;而溫度B各水平間差異顯著（P<0.10）。綜合表1～2結(jié)果，得到最佳可行提取工藝組合為A2B3C1，即溫度85℃、甲醇用量150 mL、時間4 h，此提取條件下的OD值為2.84。

2.5 驗證試驗結(jié)果

將最適條件下提取液分別稀釋0、5、10、20倍，測得其吸光度值分別為2.7955、0.4999、0.3356、0.1839。其中，稀釋20倍的樣本吸光數(shù)值處在二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)曲線取值范圍內(nèi)，因此將數(shù) 據(jù)0.1839代入回歸方程 中，求得x=8.95 μg·mL-1，在該條件下藤茶果實中二氫楊梅素提取量為179.06 μg·mL-1，換算得出藤茶果實中二氫楊梅素含量44.77 mg·g-1。

3 討論與結(jié)論

目前，有關(guān)用藤茶提取二氫楊梅素的提取工藝已有大量研究報道[6-9]，但大多均是以藤茶幼嫩莖葉為材料進行提取，圍繞藤茶果實及種子的二氫楊梅素提取工藝鮮見報道。

研究表明，湖南省張家界藤茶果實中二氫楊梅素含量為6.255%，而葉片中二氫楊梅素含量為13.3%～25.5%[10]，果實中二氫楊梅素含量顯著低于葉片中二氫楊梅素含量。其他研究表明產(chǎn)自湖南郴州、湖南湘潭和福建武夷山的藤茶（存放1年）葉片、花和葉柄中二氫楊梅素含量分別為3.83～3.99 mg·g-1、1.29～1.44 mg·g-1和0.98～1.04 mg·g-1;采用曬干方式加工藤茶的二氫楊梅素平均含量為4.72 mg·g-1，是采用熱風(fēng)烘干方式的1.2倍;且不同存放時間藤茶二氫楊梅素含量由高到低為存放2年、存放1年、存放3年，存放2年的藤茶二氫楊梅素含量平均含量達到14.42 mg·g-1，是存放3年的13.87倍[3]。可以看出不同產(chǎn)地、不同器官、不同加工方法，甚至不同存放時間對藤茶中二氫楊梅素的含量均有較大影響。

本試驗顯示影響藤茶果實二氫楊梅素提取效果的因素中，溫度>甲醇用量>時間，這一結(jié)果與藤茶干燥莖葉基于索氏提取的文獻報道一致[11-12]。試驗測得藤茶果實索氏提取法最佳提取條件為溫度85℃，甲醇用量150 mL，時間4 h;在此條件下，藤茶果實中二氫楊梅素含量為44.77 mg·g-1。該試驗結(jié)果可為藤茶果實的開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）