苑伏香 周占宇 童念庭 趙善瑤 王良雨

[摘要] 視網(wǎng)膜色素變性（RP）是一類以進(jìn)行性視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和感光上皮細(xì)胞功能障礙為特征并且會(huì)在疾病終末階段致使視網(wǎng)膜萎縮和視功能喪失的遺傳性疾病，是目前世界上所發(fā)現(xiàn)眼部疾病中主要的致盲病之一。RP作為國(guó)內(nèi)外眼科研究的熱點(diǎn)性疾病之一，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前仍然缺乏有效的治療方法。本文主要就該病的發(fā)病機(jī)制、動(dòng)物模型及治療方法進(jìn)行綜述。

[關(guān)鍵詞]?視網(wǎng)膜變性;模型，動(dòng)物;治療;綜述

[中圖分類號(hào)]?R774.13

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]?A

[文章編號(hào)]??2096-5532（2019）06-0743-05

doi：10.11712/jms201906028

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

視網(wǎng)膜色素變性（RP）是一種遺傳性致盲性眼病，其比較主要的臨床癥狀和體征為視野漸進(jìn)性缺損、赤道及周邊視網(wǎng)膜出現(xiàn)視網(wǎng)膜骨細(xì)胞狀色素沉著（常以在血管旁聚集更為明顯）、夜盲、視網(wǎng)膜動(dòng)脈變細(xì)、視盤呈蠟黃色萎縮、視覺敏感度降低等。從遺傳學(xué)方面分析，RP主要的遺傳方式有4種：常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X連鎖隱性遺傳和散發(fā)[1]。由于RP具有多種遺傳方式，與之有關(guān)的發(fā)病基因較多，目前世界上已發(fā)現(xiàn)130多種與RP相關(guān)的致病基因，估計(jì)還有一半以上的致病基因暫時(shí)未被發(fā)現(xiàn)[2-3]。因其發(fā)病機(jī)制和確切病因尚未完全明確，RP至今仍然缺乏有效治療方法，有國(guó)內(nèi)外學(xué)者嘗試運(yùn)用視覺假體的方法治療RP取得了一些進(jìn)展。RP的動(dòng)物模型多種多樣且各自有其特征，故在實(shí)驗(yàn)過程中選擇合適的動(dòng)物模型是研究此種疾病的重要步驟。本文主要對(duì)RP的發(fā)病機(jī)制、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型以及治療進(jìn)展幾個(gè)方面進(jìn)行綜述。

1?發(fā)病機(jī)制

1.1?轉(zhuǎn)錄因子功能障礙

目前研究已經(jīng)證實(shí)，在RP病人體內(nèi)存在編碼轉(zhuǎn)錄因子以及轉(zhuǎn)錄后相關(guān)RNA修飾因子的基因突變，例如前體信使RNA剪接因子（RPPF），其在機(jī)體內(nèi)不同的組織細(xì)胞中普遍存在，編碼前體mRNA剪接必須存在的蛋白成分，該基因被稱為管家基因[4]。NRL、CRX基因可以編碼轉(zhuǎn)錄因子，這兩種基因發(fā)生突變可以導(dǎo)致RP的發(fā)生。其中NRL基因突變將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中視紫紅質(zhì)（RHO）合成功能障礙;CRX基因突變不僅會(huì)阻斷蛋白質(zhì)在光感受器細(xì)胞核內(nèi)的運(yùn)輸[5]，而且其與NRL基因的結(jié)合在一定程度上也將受到影響，從而致使感光細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄功能發(fā)生障礙[6]。

1.2?基因突變導(dǎo)致光感受器細(xì)胞的外節(jié)盤膜代謝紊亂

視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的外節(jié)盤膜代謝對(duì)于維持感光細(xì)胞的正常生理功能異常重要，但也加重了光感受器以及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的負(fù)擔(dān)。

視網(wǎng)膜變性慢蛋白（RDS）基因翻譯產(chǎn)物只在光感受器細(xì)胞的外節(jié)特異性表達(dá)，并且其與視桿細(xì)胞外節(jié)盤膜蛋白1（ROM1）相互作用，共同維持光感受器細(xì)胞外節(jié)的正常功能。FARJO等[7]研究發(fā)現(xiàn)，RDS是經(jīng)含有谷氨酸的蛋白將盤膜固定于環(huán)核苷酸的門控性通道中，若RDS基因出現(xiàn)表達(dá)缺失或突變將會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致視桿細(xì)胞外節(jié)盤膜的形成障礙，光感受器細(xì)胞會(huì)逐漸凋亡;RDS丟失后的視錐細(xì)胞仍然能夠生成具有生物學(xué)活性的外盤膜，但該盤膜缺乏層狀結(jié)構(gòu)導(dǎo)致光轉(zhuǎn)錄效應(yīng)減小。

RHO基因可以編碼由348個(gè)氨基酸組成的視蛋白，后者與視黃醛結(jié)合形成RHO。347位脯氨酸位于視蛋白分子的末端，該位點(diǎn)的基因突變可以導(dǎo)致與視蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的氨基酸序列發(fā)生改變，進(jìn)一步干擾了視蛋白的正常代謝，使視蛋白積聚在視桿細(xì)胞內(nèi)，不能轉(zhuǎn)運(yùn)到外節(jié)盤膜，從而引起視網(wǎng)膜代謝功能障礙，觸發(fā)RP。

2?實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

因RP病人具有多種遺傳方式，為了便于對(duì)該病進(jìn)行研究以及為治療提供相應(yīng)指導(dǎo)，選擇合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂兄匾饬x。RP實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶ㄗ匀粍?dòng)物模型以及人工模型。

2.1?自然動(dòng)物模型

2.1.1?rd小鼠?rd小鼠是常染色體隱性遺傳RP動(dòng)物模型。由于與原發(fā)性RP常染色體隱性遺傳病人具有同樣的基因變異以及相似的基因表型，故該模型優(yōu)于其他視網(wǎng)膜變性動(dòng)物模型，成為探討視網(wǎng)膜變性發(fā)病機(jī)制較為理想的研究對(duì)象。rd小鼠是由于Pde6b基因的缺失所致，因Pde6b基因產(chǎn)生無(wú)義突變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)磷酸二酯酶β亞基的功能障礙[8]，使擁有純合子Pde6b基因的小鼠出生早期即出現(xiàn)嚴(yán)重的視網(wǎng)膜變性。

2.1.2?RCS大鼠?RCS大鼠為常染色體隱性遺傳RP動(dòng)物模型，是首先應(yīng)用于RP病因和治療方法研究的一種相對(duì)成熟的視網(wǎng)膜退化的動(dòng)物模型，作為研究多種類型視網(wǎng)膜變性的經(jīng)典動(dòng)物模型[9-12]，與人類RP有許多相似之處。該模型由BOURNE等[9]首先報(bào)道。RCS大鼠在出生后2周開始睜眼，視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞在出生后17 d發(fā)育完成;出生后25 d已出現(xiàn)光感受器變性體征;出生后35 d，大量的光感受器細(xì)胞出現(xiàn)凋亡;出生后8周時(shí)，后極部視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞開始丟失;出生后60 d，約99%的光感受器細(xì)胞發(fā)生變性[11，13];出生后70 d，在視網(wǎng)膜色素上皮缺失區(qū)域，毛細(xì)血管內(nèi)皮窗消失，細(xì)胞變厚，這種多中心發(fā)生的退行性改變可以在視網(wǎng)膜的不同部位出現(xiàn)[14];出生后3個(gè)月左右，光感受器細(xì)胞全部消失[15]。發(fā)生退行性變光感受器細(xì)胞邊緣的某些色素上皮細(xì)胞比同齡正常的同類細(xì)胞要多，且細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體增多，細(xì)胞基底面的皺褶也顯著增多。

2.1.3?rds小鼠?rds小鼠為常染色體顯性遺傳RP動(dòng)物模型，是研究RP的經(jīng)典動(dòng)物模型，該鼠因peripherin/rds基因的外顯子中插入了9.2 kb的基因組重復(fù)元件，而不能產(chǎn)生正常的蛋白。Peripherin/rds基因表達(dá)產(chǎn)物是脊椎動(dòng)物光感受器外節(jié)盤膜的結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白有維持膜盤穩(wěn)定性以及正常形態(tài)的重要功能[17]。Peripherin/rds基因發(fā)生純合突變，可使正常的盤膜蛋白生成障礙從而進(jìn)一步導(dǎo)致光感受器外節(jié)盤膜的正常形成也發(fā)生障礙[16]，在人類可導(dǎo)致RP以及遺傳性黃斑變性等多種視網(wǎng)膜病變。光感受器細(xì)胞外節(jié)在純合子小鼠中不發(fā)育，外叢狀層和外核層于出生后2周起逐漸變薄，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞于出生后12個(gè)月左右消失殆盡，而視網(wǎng)膜內(nèi)層基本不受影響[18]。

2.1.4?貓類及犬類動(dòng)物模型?有研究顯示，貓眼與人眼黃斑部的視網(wǎng)膜中央?yún)^(qū)域具有相似結(jié)構(gòu)[19]。研究表明，貓對(duì)藥物劑量敏感性與靈長(zhǎng)類動(dòng)物接近，這為靈長(zhǎng)類動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究提供了便利。Abyssinian貓是常染色體隱性遺傳RP的動(dòng)物模型，亦有學(xué)者稱該動(dòng)物模型具備顯性遺傳的模式，該動(dòng)物模型早期表現(xiàn)為視桿細(xì)胞受影響，晚期出現(xiàn)視桿、視錐細(xì)胞均受損，但目前其基因型還未被證實(shí)[20]。犬類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型除了極少數(shù)為X連鎖遺傳外，大部分為常染色體隱性遺傳。迄今為止，研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多犬類RP模型，并建立了一些種系以供實(shí)驗(yàn)研究。

2.2?人工模型

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在常染色體顯性遺傳RP動(dòng)物模型中占據(jù)重要地位。

2.2.1?RPE-65基因敲除小鼠?RPE-65編碼的視網(wǎng)膜色素上皮特異蛋白，分子量為65 000，在視網(wǎng)膜色素上皮表面廣泛表達(dá)。該蛋白與視網(wǎng)膜色素上皮中維生素A的代謝有關(guān)[21]，主要參與維生素A的代謝和RHO的再生。敲除RPE-65基因可致小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞功能障礙，使全反視黃醇過度積聚和11-順-視黃醇脂缺乏[22]。RPE-65在視循環(huán)中對(duì)11-順-視黃醇的再異構(gòu)發(fā)揮重要作用。RPE-65基因敲除小鼠主要為常染色體隱性遺傳。

2.2.2?RHO基因敲除小鼠?RHO基因被認(rèn)為是與RP發(fā)病相關(guān)的基因，世界上對(duì)RHO基因突變有很多研究報(bào)道，在常染色體顯性遺傳RP發(fā)病中的報(bào)道則更為廣泛[23-24]。DRYJA等[23]在1990年第1次進(jìn)行報(bào)道，至今已連續(xù)發(fā)現(xiàn)了100多種RHO基因突變，其中錯(cuò)義突變占多數(shù)。

3?治療進(jìn)展

3.1?基因治療

基因治療是將外源性正?；?qū)胂鄳?yīng)靶細(xì)胞，對(duì)基因缺陷等導(dǎo)致的某些疾病進(jìn)行糾正，從而治療病變。即通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將外源基因?qū)氩∪四承┦荏w細(xì)胞內(nèi)，利用外源基因形成的產(chǎn)物治療某類疾病，故要求外源基因必須成功地導(dǎo)入感光細(xì)胞中，并能在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。目前常用基因載體包括病毒載體以及非病毒載體，病毒載體主要有腺相關(guān)病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體等[25]，目前眼科較常用的為腺相關(guān)病毒載體。

3.1.1?核酶治療?核酶是具有催化功能的RNA分子，它是一種生物催化劑，可以降解體內(nèi)特異性的mRNA序列，抑制某些基因的表達(dá)。有研究者使用具有催化活性的核酶治療由RHO基因P23H突變引起的RP，結(jié)果顯示光感受器細(xì)胞較治療前損傷明顯減輕[26]。

3.1.2?神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因?有研究顯示，將腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因植入RCS大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞后，其細(xì)胞凋亡在一定時(shí)間內(nèi)明顯減少[27]。

3.1.3?RNA干擾（RNAi）技術(shù)?RNAi是普遍存在于生物體內(nèi)的、由雙鏈RNA引起、同源信使RNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是動(dòng)植物體在生命進(jìn)化過程中出現(xiàn)的一種保護(hù)性機(jī)制。CHADDERTON等[28]應(yīng)用RNAi技術(shù)在RHO基因突變引起的色素變性小鼠視網(wǎng)膜下隙注入攜帶RHO-siRNA的腺相關(guān)病毒載體，并同時(shí)植入野生型RHO基因，結(jié)果顯示該法對(duì)由RHO基因突變引起的RP有良好的治療效果。

3.1.4?抑制凋亡?B細(xì)胞白血病-2（Bcl-2）基因是目前用于實(shí)驗(yàn)研究的抑制細(xì)胞凋亡的比較常見的基因，將該基因轉(zhuǎn)載入慢性色素變性的小鼠細(xì)胞內(nèi)后發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少[29]。

3.2?神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是由機(jī)體產(chǎn)生的可以對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育、存活、生長(zhǎng)、分化和凋亡等起重要作用的一類蛋白質(zhì)因子。它們通過對(duì)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡過程進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。目前，用于RP研究的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子主要有睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（CNTF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、非促分裂人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（nmhaFGF）、膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）等，其療效已在多種RP動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證[30-32]。BELTRAN等[33]將CNTF注入RPGR犬的玻璃體腔后發(fā)現(xiàn)，周邊部視網(wǎng)膜發(fā)生重塑，但光感受器仍出現(xiàn)進(jìn)行性缺失，由此可見，CNTF對(duì)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用有一定局限性。BDNF來源于視網(wǎng)膜的M?ller細(xì)胞，它的主要作用是促進(jìn)M?ller細(xì)胞分泌CNTF以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，并且可以使后者對(duì)光感受器細(xì)胞的保護(hù)作用進(jìn)一步增加。

3.3?視覺假體

自1929年有研究者發(fā)現(xiàn)電刺激視皮質(zhì)可以產(chǎn)生光幻視以來，至今世界上已經(jīng)有20多個(gè)研究小組致力于人工視覺的研究[34]。HUMAYUN等[35]于2003年首次報(bào)道了RP病人視網(wǎng)膜假體植入，該假體植入治療的機(jī)制是應(yīng)用電極刺激視覺通路的完整部分，從而達(dá)到引起視覺的目的。依據(jù)刺激部位的不同，視覺假體可分為視皮質(zhì)假體、視神經(jīng)假體以及視網(wǎng)膜假體。由于RP病人晚期視網(wǎng)膜外層細(xì)胞變性、凋亡，而視網(wǎng)膜內(nèi)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)保持完整，故目前視網(wǎng)膜假體應(yīng)用較為廣泛。

3.4?藥物治療

3.4.1?維生素A?維生素A是視網(wǎng)膜組織中合成RHO的重要原料，機(jī)體維生素A缺乏或利用障礙時(shí)會(huì)產(chǎn)生夜盲，這是RP病人最早出現(xiàn)的癥狀。維生素A棕櫚酸酯是最常用于RP治療的藥物。已有研究證實(shí)，對(duì)RP病人進(jìn)行大劑量維生素A治療，可以減緩病程進(jìn)展速度[36]。

3.4.2?抗氧化劑?視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷是指光子可以激發(fā)視網(wǎng)膜組織產(chǎn)生大量自由基，后者可以引起視網(wǎng)膜組織發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)一步損傷視網(wǎng)膜。視網(wǎng)膜組織中存在自身保護(hù)機(jī)制，對(duì)活性氧和自由基是通過維生素C、維生素E、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽等系統(tǒng)[37]來發(fā)揮保護(hù)作用的。目前有研究結(jié)果表明，維生素C和維生素E對(duì)視網(wǎng)膜的光損傷具有保護(hù)作用[38]，而具有抗氧化作用的谷胱甘肽（Gpx）1或Gpx4可以對(duì)抗SOD1或SOD2的表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

3.4.3?鈣離子拮抗劑?細(xì)胞內(nèi)鈣超載可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡。使用鈣離子拮抗劑是通過抑制光感受器細(xì)胞的凋亡來治療RP。也有研究認(rèn)為，鈣離子拮抗劑可以加快視網(wǎng)膜局部代謝產(chǎn)物的清除[39]。鈣離子拮抗劑可能成為治療cGMP磷酸二酯酶亞單位突變所致的RP的一種有效方法。

3.4.4?二十二碳六烯酸（DHA）?DHA是長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸，在感光細(xì)胞外節(jié)盤膜中含量較高，它可以有效調(diào)節(jié)遞質(zhì)以及第二信使cCMP的代謝，減少病人視桿細(xì)胞視網(wǎng)膜電流圖的功能性喪失。研究表明，DHA不僅可以促進(jìn)受損感光細(xì)胞的恢復(fù)，還能提高神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的功能[40-41]。

3.4.5?葉黃素?葉黃素主要存在于視網(wǎng)膜黃斑區(qū)的外叢狀層內(nèi)，是一種重要的抗氧化劑。已有研究表明，補(bǔ)充葉黃素可以促進(jìn)視野的恢復(fù)并可輕微地改善視功能[42]。

3.4.6?丙戊酸（VPA）?VPA在臨床上作為抗驚厥劑及情緒穩(wěn)定劑被廣泛應(yīng)用，它通過調(diào)節(jié)體內(nèi)γ-氨基丁酸（GABA）的水平來發(fā)揮療效。最新證據(jù)表明，VPA通過調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)應(yīng)答來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[43-45]。在視網(wǎng)膜組織中，VPA可以通過調(diào)節(jié)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡來下調(diào)特定光感受器細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中的損傷[46-48]。另有研究結(jié)果表明，VPA具有通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化來逆轉(zhuǎn)光感受器細(xì)胞損傷的特性[49]。目前已經(jīng)證明，VPA可以刺激膠質(zhì)細(xì)胞分化成為光感受器樣細(xì)胞[50]。VPA為RP病人提供了一種新的、具有潛力的治療方法。

3.5?細(xì)胞移植

視網(wǎng)膜細(xì)胞移植是指將正常的細(xì)胞植入到視網(wǎng)膜內(nèi)代替受到破壞的感光細(xì)胞，建立新的神經(jīng)聯(lián)系，從而達(dá)到改善視功能的目的。目前最有前景的移植細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞（ESCs）和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）。人ESCs在體外誘導(dǎo)可以分化成光感受器細(xì)胞、雙極細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等視網(wǎng)膜細(xì)胞。將體外誘導(dǎo)的光感受器細(xì)胞成功植入視網(wǎng)膜變性小鼠的視網(wǎng)膜下隙后可恢復(fù)小鼠的感光功能。目前ESCs使用中存在的主要問題是如何控制腫瘤的產(chǎn)生、如何克服倫理以及排斥反應(yīng)問題[51-53]。MSCs是來自基質(zhì)的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，最常來源于骨髓。干細(xì)胞移植治療RP的作用機(jī)制如下：①視網(wǎng)膜內(nèi)變性的細(xì)胞可以由健康的干細(xì)胞代替[54];②植入的健康干細(xì)胞可以通過分泌營(yíng)養(yǎng)因子為其周圍的細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)支持，改善細(xì)胞生存的微環(huán)境，利于細(xì)胞生長(zhǎng)[55];③使細(xì)胞抗凋亡基因上調(diào)達(dá)到對(duì)視錐細(xì)胞以及視網(wǎng)膜血管的保護(hù)目的[56];④促進(jìn)細(xì)胞間形成新的突觸連接[57]。TOMITA等[58]報(bào)道，成年大鼠視網(wǎng)膜機(jī)械損傷后，將MSCs注射到其玻璃體腔內(nèi)，不久就可以發(fā)現(xiàn)MSCs分化成為視網(wǎng)膜視神經(jīng)細(xì)胞。有研究用MSCs治療RP，可見病人視力、顏色分辨能力增加，畏光減輕，考慮到MSCs的同源性、易于分離以及不存在倫理問題，認(rèn)為該方法具有較樂觀的應(yīng)用前景[59]。

3.6?加壓氧治療

加壓氧治療可以提高機(jī)體內(nèi)的氧化代謝速度，促進(jìn)ATP的產(chǎn)生。RP病人需要更高的氧分壓來維持殘存的視功能，利用加壓氧進(jìn)行治療，一方面有利于RHO的形成，另一方面可以提高鳥苷酸環(huán)化酶的生物學(xué)活性，從而改善RP病人的視功能[60]。

4?展望

隨著對(duì)視網(wǎng)膜變性疾病發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，更多與RP相關(guān)的致病基因被發(fā)現(xiàn)，色素上皮變性致病基因的確認(rèn)以及對(duì)其發(fā)病機(jī)制的正確認(rèn)識(shí)是遺傳性視網(wǎng)膜疾病正確治療的基礎(chǔ)，建立和應(yīng)用合適的動(dòng)物模型也會(huì)起到重要的作用。相信經(jīng)過臨床眼科與基礎(chǔ)科研工作者的共同努力，人們對(duì)RP將會(huì)有更全面的認(rèn)識(shí)。

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（本文編輯?馬偉平）