胡晶 劉潔 徐冰雁 范婧瑩 羅晶婧 胡梅 何迎春

〔摘要〕 目的 研究益氣解毒方抑制鼻咽癌CNE2細胞增殖的效應。方法 采用實時無標記細胞功能分析技術（real-time unlabeled cell function analysis technique， RTCA）動態(tài)監(jiān)測不同濃度（0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL的益氣解毒方水提物對人鼻咽癌CNE2細胞增殖的影響;采用CCK-8法檢測不同濃度益氣解毒方水提物對人鼻咽癌CNE2細胞增殖能力的影響;通過高通量細胞成像多功能檢測系統(tǒng)Cytation5監(jiān)測不同濃度益氣解毒方水提物對鼻咽癌CNE2細胞增殖形態(tài)的影響;采用Western Blot技術檢測不同濃度益氣解毒方水提物對鼻咽癌CNE2細胞增殖相關蛋白Survivin、XIAP、PCNA表達的影響。結果 RTCA 和 CCK-8 法實驗結果顯示，與空白對照組比較，益氣解毒方水提物可以明顯抑制鼻咽癌CNE2細胞的增殖，而且隨著益氣解毒方水提物的作用時間越長，其抑制效應越顯著（P<0.05）;Cytation5結果顯示，與空白對照組比較，不同濃度益氣解毒方水提物處理CNE2細胞后，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，且濃度越高，作用時間越長，細胞膜皺縮，細胞核質濃縮、破碎更明顯;Western Blot結果顯示，與空白對照組比較，益氣解毒方水提物能明顯抑制CNE2細胞中增殖相關蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達（P<0.05）。結論 益氣解毒方水提物能明顯抑制鼻咽癌細胞增殖，該效應與其抑制增殖相關蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達有關。

〔關鍵詞〕 益氣解毒方;鼻咽癌;細胞增殖;Survivin;XIAP;PCNA

〔中圖分類號〕R285.5;R739.63 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.08.003

〔Abstract〕 Objective To study the inhibitory effects on the proliferation of ?human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells with Yiqi Jiedu Formula. Methods Real-time unlabeled cell function analysis technique （RTCA） was used to dynamically monitor the effects of different concentrations （0.125 mg/mL， 0.25 mg/mL， 0.5 mg/mL， 1.0 mg/mL） of Yiqi Jiedu Formula water extract on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells; CCK-8 assay was used to detect the effects of different concentrations of water extract of Yiqi Jiedu Formula on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells; the effects of drugs on the proliferation and morphology of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells were monitored by high throughput cell imaging multifunctional detection system Cytation5; Western Blot technique was used to detect the effect of drugs on the expression of proliferation-related proteins Survivin， XIAP and PCNA in nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells. Results The results of RTCA and CCK-8 showed that the water extract of Yiqi Jiedu Formula could significantly inhibit the proliferation of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells compared with the blank control group， and the longer the action time of the water extract of Yiqi Jiedu Formula， the more significant the inhibitory effect was （P<0.05）; Cytation5 results showed that compared with the blank control group， the morphology of CNE2 cells treated with different concentrations of Yiqi Jiedu Formula water extract changed， and the higher the concentration， the longer the action time was. The shrinkage of cell membrane， and the concentration and fragmentation of nucleoplasm were more obvious; The results of Western Blot showed that compared with the blank control group， the water extract of Yiqi Jiedu Formula could significantly inhibit the expression of proliferation-related proteins Survivin， XIAP and PCNA in CNE2 cells （P<0.05）. Conclusion Yiqi Jiedu Formula can significantly inhibit the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells， which is related to the inhibition of the expression of proliferation-related proteins Survivin， XIAP and PCNA.

〔Keywords〕 Yiqi Jiedu Formula; nasopharyngeal carcinoma; cell proliferation; Survivin; XIAP; PCNA

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是目前比較常見的頭頸部惡性腫瘤，在南方的發(fā)病幾率比較高[1]，其發(fā)病與遺傳因素、EB病毒感染、環(huán)境影響等關系密切[2-3]，目前公認鼻咽癌的有效治療方法為放療、化療，但放化療有其固有的局限性，如敏感性降低、放療后的不良反應大、復發(fā)甚至轉移等[4]，尋求一種更加安全高效的診療方式是耳鼻咽喉科醫(yī)生在臨床治療中迫切需要解決的問題。益氣解毒方（以下簡稱YQ）是湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院田道法教授依據(jù)臨床經(jīng)驗創(chuàng)立的經(jīng)驗方，能夠有效減輕放療化療所帶來的副反應[5]。前期體內外實驗研究表明，該方能夠有效抑制人鼻咽癌不同分化類型細胞株，如5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HNE1等細胞的增殖、遷移，并具有誘導其凋亡的效應[6-10]。

本研究選取CNE2細胞株，從增殖、形態(tài)變化方面觀察益氣解毒方水提物對鼻咽癌CNE2細胞增殖效應的影響，通過實時無標記細胞功能分析技術（real-time unlabeled cell function analysis technique， RTCA）和CCK-8法檢測益氣解毒方水提物在不同時間點對CNE2細胞的抑制增殖效應，采用Cytation5動態(tài)監(jiān)測益氣解毒方水提物對CNE2細胞形態(tài)變化的影響，最后用Western Blot檢測益氣解毒方水提物對CNE2細胞增殖相關蛋白Survivin、XIAP、PCNA表達的影響，探討益氣解毒方抑制CNE2細胞增殖的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 ?細胞株

人鼻咽癌細胞株CNE2，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，本實驗室傳代培養(yǎng)。

1.2 ?實驗藥物及試劑

益氣解毒方藥物組成及水提物的制備：黃芪30 g，黨參15 g，黃連10 g，白花蛇舌草10 g，茯苓15 g，天花粉10 g，甘草6 g。煎煮收集藥液濃縮，并冷凍干燥，干燥完全后將水提物-20 ℃密封保存，用培養(yǎng)基配成4.0 mg/mL的母液，主要參考廖雪等[11]的制備方法。RPMI-1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液（Hyclone公司）;胎牛血清（Gibco公司）;DMSO（Amresco公司）;CCK-8試劑盒（日本同仁公司）;一抗Survivin、XIAP、PCNA（CellSignalingTechnology，CST公司）。

1.3 ?實驗儀器

賀利氏HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾公司）;ELX800全自動酶標分析儀（BioTek公司）;5415R高速冷凍離心機（Eppendorf公司）;實時無標記細胞功能分析儀（艾森生物科技公司）;Cytation5高通量細胞成像多功能檢測系統(tǒng)（美國伯騰儀器有限公司）;倒置顯微鏡（Olympus 公司）;Odyssey CLX熒光掃描成像系統(tǒng)（Gene有限公司）。

1.4 ?方法

1.4.1 ?細胞培養(yǎng) ?將鼻咽癌CNE2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2、濕度飽和的恒溫細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，細胞生長至70%～80%傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4.2 ?RTCA監(jiān)測細胞增殖情況 ?取對數(shù)生長期CNE2細胞，消化重懸成單個細胞，調整濃度為每毫升5×104個細胞，接種到RTCA專用細胞增殖檢測培養(yǎng)板，每個孔加入100 μL CNE2細胞懸液，等細胞指數(shù)（cell index， CI）達到1.0時，加入不同濃度0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL益氣解毒方水提物（前期實驗結果顯示，此濃度范圍藥物對細胞無毒性），同時設空白對照組（Control組），每個組3個復孔，不同濃度組每孔加入藥液200 μL，Control組每孔加入細胞培養(yǎng)液200 μL，采用RTCA動態(tài)監(jiān)測，并用CI值表示CNE2細胞的增殖狀況。

CI=（Rn-Rb）/15

Rn表示某個孔接種了細胞后的電極阻抗值，Rb表示某個孔中只有培養(yǎng)基時的背景阻抗值[12]。根據(jù)曲線分析水提物的藥效隨濃度及時間變化的特征，并用儀器自帶的軟件計算出合適時間點的半數(shù)抑制率濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50） 。

1.4.3 CCK-8法檢測細胞增殖 ?取對數(shù)生長期的CNE2細胞，按照每100 μL培養(yǎng)液中5×103個細胞種入96孔板，過夜，待CNE2細胞貼壁后，藥物組每個孔分別加入不同濃度的200 μL含藥培養(yǎng)液，Control組每孔加入細胞培養(yǎng)液200 μL，實驗分組同“1.4.2”，每個組設置5個復孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間。另外，設定只加細胞培養(yǎng)液、不加CNE2細胞的空白孔（用于A值校正）。藥物作用24、48、72 h后，每個孔（包含空白孔）分別加100 μL現(xiàn)配的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，實驗重復3次。酶標儀檢測450 nm波長的吸光度值（A值），記錄實驗結果，計算出細胞的增殖率及各時間點的IC50值。

細胞增殖率=（A值實驗組-A 值空白孔）/（A值Control組-A值空白孔）×100%

1.4.4 ?高通量細胞成像多功能檢測系統(tǒng)Cytation5監(jiān)測細胞形態(tài)變化 ?取對數(shù)生長期的CNE2細胞，消化重懸成單個細胞，96孔板鋪板，按照5×103個細胞每個孔，加100 μL體積細胞懸液到每個孔，過夜，待CNE2細胞貼壁后，根據(jù)“1.4.2”結果，確定水提物處理CNE2細胞的濃度，藥物組每個孔分別加入不同濃度水提物0.25、0.50、1.00 mg/mL的含藥培養(yǎng)液200 μL，Control組每孔加入細胞培養(yǎng)液200 μL，采用Cytation5監(jiān)測細胞生長形態(tài)，并設定6 h拍攝一次細胞形態(tài)圖像，并記錄實驗結果。

1.4.5 ?Western Blot檢測細胞增殖相關蛋白的表達 ?根據(jù)“1.4.2”和“1.4.4”的結果確定水提物處理CNE2細胞的濃度和時間，待CNE2細胞生長至70%～80%，向培養(yǎng)皿中加入不同濃度水提物0.25、0.50、1.00 mg/mL的含藥培養(yǎng)液3 mL，Control組加入細胞培養(yǎng)液3 mL，處理36 h后提取蛋白，用Western Blot檢測細胞增殖相關蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達，采用熒光掃描成像系統(tǒng)分析相關蛋白的熒光信號值，并計算蛋白相對表達量。

蛋白相對表達量=蛋白熒光信號值/β-actin熒光信號值

1.5 ?統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料實驗數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，用“x±s”表示，單因素設計，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性，多重比較用LSD檢驗，方差不齊用Dunnet T3檢驗。計量資料不服從正態(tài)分布的，則采用秩和檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。所有的結果分析圖由GraphPad Prism 7.0軟件制作完成。

2 結果

2.1 ?RTCA動態(tài)監(jiān)測益氣解毒方對鼻咽癌CNE2細胞增殖的影響

RTCA動態(tài)監(jiān)測細胞生長情況，結果顯示，Control組增殖較快，益氣解毒方水提物組能夠抑制CNE2細胞增殖，并計算出48 h IC50為0.5 mg/mL。見圖1。2.2 ?CCK-8法檢益氣解毒方水提物對鼻咽癌CNE2細胞增殖的影響

CCK-8檢測結果顯示，與Control組比較，不同濃度0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL益氣解毒方水提物分別處理CNE2細胞24、48、72 h后，均可以抑制CNE2細胞增殖，都具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）;且0.250、0.500、1.000 mg/mL各藥物組在24、48、72 h 3個不同時間點之間均具有統(tǒng)計學差異（P值均<0.05），但0.125 mg/mL組在24、48、72 h 3個不同時間點之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。隨著藥物濃度增加、作用時間延長，其抑制效果更加明顯。見圖2。

2.3 ?Cytation5動態(tài)監(jiān)測益氣解毒方水提物對鼻咽癌CNE2細胞形態(tài)的影響

根據(jù)RTCA和CCK-8的結果，選擇0.25、0.50、1.00 mg/mL 3個濃度的益氣解毒方水提物分別作用于CNE2細胞，采用Cytation5動態(tài)監(jiān)測不同濃度組的細胞形態(tài)圖像，由于72 h的CNE2細胞圖像中，正常培養(yǎng)組細胞數(shù)太多，而不同濃度水提物組細胞數(shù)較少，且有部分細胞漂浮，故挑選加藥處理0、24、36、48 h 4個時間點的細胞形態(tài)結果，結果顯示，Control組細胞正常生長，細胞胞質形態(tài)均勻飽滿，細胞的輪廓清晰，呈梭形，細胞結合率比較高，生長緊密，48 h左右拍照區(qū)域細胞基本長滿。而不同濃度的水提物處理48 h后，不同濃度組細胞生長受到抑制，細胞間隙加大，細胞間的連接逐步消失，細胞數(shù)量明顯減少，細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞膜皺縮破裂，細胞核質出現(xiàn)濃縮、破碎、溶解。見圖3。

2.4 ?Western Blot檢測益氣解毒方水提物對鼻咽癌CNE2細胞增殖相關蛋白的影響

結合RTCA和Cytation5的結果，在益氣解毒方水提物處理CNE2細胞36 h左右，CNE2細胞生長受到明顯抑制，故我們選取36 h作為干預時間點采用Western Blot檢測相關蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達情況（以β-actin為內參照）。經(jīng)不同濃度益氣解毒方水提物處理36 h后，與Control組相比，不同濃度水提物組增殖相關蛋白Survivin、XIAP、PCNA的相對表達量均有下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖4。

3 討論

鼻咽癌是上皮源性惡性腫瘤，在我國頭頸部腫瘤發(fā)病率中占據(jù)首位[13]，患者在治療后多易復發(fā)，如何有效減輕患者的復發(fā)率，降低臨床患者的放化療反應，是目前臨床醫(yī)生需要關注解決的問題。近年來的臨床觀察研究表明[14]，配合使用中藥復方能夠明顯減輕放療過程中產(chǎn)生的不良反應。益氣解毒方是田道法教授多年的經(jīng)驗用方，其改善鼻咽癌患者放化療后的不良反應效果顯著[15]。由黃芪、黨參、天花粉、黃連、白花蛇舌草、茯苓、甘草組成，其作用主要是益氣解毒，生津潤燥，扶正祛邪，提升患者的免疫力，調節(jié)患者的氣虛體質。

腫瘤細胞的生長情況取決于細胞增殖和細胞凋亡之間的動態(tài)平衡，而細胞的惡性增殖通常是腫瘤發(fā)生轉化的關鍵因素。抑制腫瘤細胞的增殖可以在一定程度上抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。課題組的前期結果顯示，益氣解毒方水提物可以抑制CNE2細胞增殖。在本次實驗中，設置0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL不同濃度的水提物，采用RTCA、CCK-8、Cytation5分別監(jiān)測不同濃度益氣解毒方水提物對CNE2的細胞增殖的影響，結果初步表明，隨著益氣解毒方水提物濃度的增加，CNE2細胞形態(tài)發(fā)生改變，CNE2細胞的生長增殖受到抑制。

XIAP、Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，都是重要的抗凋亡分子，有實驗研究顯示，Survivin在腫瘤組織中過度表達，會縮短患者的生存期、加速腫瘤復發(fā)等[16]，能夠直接抑制凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-7的活性，也能夠與細胞周期調控因子CDK4形成Survivin-CDK4復合體，使p21從CDK復合體中釋放出來并異位到線粒體，間接抑制Caspase-3活性，發(fā)揮抑制細胞凋亡、相對促進細胞增殖的作用[17]。XIAP能夠影響腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲[18]，可以通過抑制Caspases 酶原的激活、降低成熟Caspases的催化活性，抑制腫瘤細胞凋亡[19]。PCNA則是細胞增殖核抗原，可反映細胞的增殖活躍程度，在DNA合成期，尤其在G1期到S期中發(fā)揮重要作用。PCNA的表達量影響到腫瘤細胞的活動過程，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20]，本次實驗顯示，不同濃度益氣解毒方水提物處理CNE2細胞36 h后，PCNA、Survivin、XIAP相關蛋白的相對表達量均有下降，初步判斷益氣解毒方水提物可以通過下調PCNA、Survivin、XIAP蛋白的表達，抑制人鼻咽癌CNE2細胞增殖，誘導細胞凋亡。

綜上所述，本實驗分別從增殖數(shù)量、增殖形態(tài)、相關蛋白的表達情況幾方面進行研究，初步說明益氣解毒方水提物能夠抑制人鼻咽癌CNE2細胞增殖，其抑制作用可能與抑制相關蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達有關。課題組將繼續(xù)深入探討益氣解毒方抑制CNE2細胞增殖的機制，為益氣解毒方治療鼻咽癌提供更充足的科學依據(jù)。

參考文獻

[1] KAMRAN S C， RIAZ N， LEE N. Nasopharyngeal carcinoma[J]. Surgical Oncology Clinics of North America，2015，24（3）：547-561.

[2] CHANG E T， ADAMI H O. The enigmatic epidemiology of nasopharyngeal carcinoma.[J]. Cancer Epidemiology， biomarkers & Prevention，2006，15（10）：1765-1777.

[3] 尚學蘭，謝志強，黃志碧.鼻咽癌的危險因素[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2008，35（2）：206-207.

[4] KONG F， CAI B， LIN S， et al. Assessment of radiotherapy combined with adjuvant chemotherapy in the treatment of patients with advanced nasopharyngeal carcinoma： a prospective study[J]. Journal of buon，2015，20（1）：206.

[5] 田道法，何迎春.鼻咽癌前病變“氣虛染毒病機理論研究”[J].中醫(yī)耳鼻喉科學研究雜志，2008，7（1）：24-29.

[6] 尚云峰，田道法，YANG PC.益氣解毒法不同組方對鼻咽癌CNE2Z細胞遷徙運動潛能及相關基因表達活性的影響[J].中國中西醫(yī)結合耳鼻咽喉科雜志，2013，21（3）：165-170，198.

[7] 江潔瓊，賀安意，田道法，等.益氣解毒方對TgN（p53mt-LMP1）/HT轉基因小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮細胞增殖及凋亡相關基因表達的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復，2008，12（42）：8201-8205.

[8] 胡 ?梅，田道法，劉群良，等.益氣解毒方提取物對CNE2細胞的體內外抑瘤作用[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（11）：41-43.

[9] 何 ?丹.益氣解毒方誘導鼻咽癌CNE2側群細胞凋亡的研究[D]. 長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2015.

[10] 羅晶婧.益氣解毒方水提物聯(lián)合鹽霉素抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移和誘導凋亡的效應[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學， 2016.

[11] 廖 ?雪，藺 ?婷，羅晶婧，等.益氣解毒方水提物對RAW264.7細胞免疫功能的影響[J].腫瘤基礎與臨床，2015，28（6）：473-476.

[12] 嚴國俊，裴燕芳，朱貞宏，等.實時細胞電子分析技術的應用研究進展[J].中國藥學雜志，2014，49（3）：169-173.

[13] 王 ?兵，侯 ?煒.中醫(yī)辨治鼻咽癌的幾點認識[J].世界中西醫(yī)結合雜志.2013，8（1）：89-91.

[14] 王 ?磊，梁 ?杰，阿提坎·卡吾力，等.復方苦參注射液治療鼻咽癌放射性口腔黏膜損傷療效觀察[J].中草藥，2015，46（6）：875-877.

[15] 胡 ?梅，田道法，劉群良，等.益氣解毒方提取物對CNE2細胞的體內外抑瘤作用[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，22（11）：41-43.

[16] FUKUDA S， PELUS L M. Survivin，a cancer target with an emerging role in normal adult tissues[J]. Molecular Cancer Therapeutics，2006，5（5）：1087-1098.

[17] UREN A G， WONG L， PAKUSCH M， et al. Survivin and the innercentromere protein INCENP show similar cell-cycle localization and gene knockout phenotype[J]. Current Biology，2000，10（21）：501319-501328.

[18] ZHAO W J，DENG B Y，WANG X M， et al. XIAP associ ated factor 1 （XAF1） represses expression of X-linked inhib itor of apoptosis protein （XIAP） and regulates invasion， cell cycle， apoptosis， and cisplatin sensitivity of ovarian carcino ma cells[J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention Apjcp，2015，16（6）： 2453-2458.

[19] FINLAY D. Small-molecule IAP antagonists sensitize cancer cells to TRAIL-induced apoptosis： roles of XIAP and cIAPs.[J]. Molecular Cancer Therapeutics，2014，13（1）：5-15.

[20] 劉志勇，易 ?堅，鄒小明.PCNA、E2F-1、RASSF1A蛋白表達與胃癌生物學關系研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2013，26（5）：768-771.