范婧瑩 婁余 張娜 彭瑤 朱瑩

〔摘要〕 目的 探討三物白散對(duì)Survivin-RNA基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡、遷移的影響。方法 將實(shí)驗(yàn)分成6組：空白對(duì)照組、LV-RNAi 組、Survivin-RNAi-LV組、空白對(duì)照+中藥組、LV-RNAi+中藥組、Survivin-RNAi-LV+中藥組;采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果 細(xì)胞凋亡率：Survivin-RNAi-LV組明顯高于空白對(duì)照組和LV-RNAi組（P<0.05）;Survivin-RNAi-LV+中藥組與空白對(duì)照+中藥組、LV-RNAi+中藥組比較明顯較高（P<0.05）;Survivin-RNAi-LV+中藥組高于Survivin-RNAi-LV組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。胃癌細(xì)胞的24 h遷移率：Survivin-RNAi-LV組明顯低于空白對(duì)照組和LV-RNAi組（P<0.05）;Survivin-RNAi-LV+中藥組與空白對(duì)照+中藥組、LV-RNAi+中藥組比較，其結(jié)果明顯低于后兩組（P<0.05）;Survivin-RNAi -LV+中藥組與Survivin-RNAi-LV組比較，細(xì)胞遷移率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染，增強(qiáng)了三物白散誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡和抑制其遷移的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 Survivin;三物白散;胃癌;細(xì)胞凋亡;遷移

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R735.2 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.08.002

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of Sanwubai Powder on apoptosis and migration of gastric cancer SGC-7901 cells transfected with Survivin-RNA gene silencing. Methods The experiment was divided into 6 groups： a blank control group， a LV-RNAi group， a Survivin-RNAi-LV group， a blank control group + TCM group， a LV-RNAi + TCM group， a Survivin-RNAi -LV + TCM group. The cell apoptosis was observed by flow cytometry， and the cell migration was assessed by cell scratch experiment. Results The apoptotic rate of the Survivin-RNAi -LV group was significantly higher than that of blank control group and LV-RNAi group （P<0.05）; The apoptosis rate of the Survivin-RNAi-LV + TCM group was significantly higher than that of the blank control group + TCM group and the LV-RNAi + TCM group （P<0.05）; The Survivin-RNAi-LV+ TCM group was higher than the Survivin-RNAi-LV group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The 24 hour cell migration rate in the Survivin-RNAi -LV group was significantly lower than that in the blank control group and the LV-RNAi group （P<0.05）. The Survivin-RNAi -LV + TCM group was significantly lower than that of the blank control group + TCM group and the LV-RNAi + TCM group （P<0.05）; Compared with the Survivin-RNAi-LV group， the cell migration rate of the Survivin-RNAi-LV + TCM group was significantly decreased， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion After Survivin gene silencing transfection， the sensitivity of SGC-7901 cells to Sanwubai Powder was significantly enhanced， which further promoted the apoptosis of SGC-7901 cells and inhibited their migration.

〔Keywords〕 Survivin; Sanwubai Powder; gastric cancer; apoptosis; migration

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其高發(fā)病率及死亡率嚴(yán)重威脅了人類的健康。我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，胃癌的發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的42.6%和45.0%[1]。中醫(yī)藥對(duì)腫瘤有著明確的治療效果，且毒副作用小，但與常規(guī)化療藥物相比，中藥抗腫瘤的效果一般[2]，尋找新的途徑提高中藥的抗腫瘤效果，具有重要的研究意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，三物白散可抑制胃癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制Survivin的表達(dá)有關(guān)。RNA干擾（RNA interference， RNAi）是抑制靶基因表達(dá)的核酸操作技術(shù)，廣泛應(yīng)用于腫瘤基因治療的研究[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌MGC-803細(xì)胞經(jīng)Cdx2基因沉默轉(zhuǎn)染后，對(duì)人參黃芪復(fù)方的敏感性明顯增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的凋亡等[2]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過RNA干擾Survivin基因沉默，觀察三物白散對(duì)Survivin基因沉默的胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡、遷移的影響，以期通過干預(yù)基因的表達(dá)增強(qiáng)中藥對(duì)胃癌細(xì)胞的作用效果。

1 材料

1.1 ?細(xì)胞株及慢病毒

人胃癌細(xì)胞SGC-7901購自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司，Survivin基因沉默的重組慢病毒顆粒由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司構(gòu)建。

1.2 ?動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（動(dòng)物合格證號(hào)：43004700030743），飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[場地許可證號(hào)：SKY（湘）2013-0005]，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)定。

1.3 ?藥物

根據(jù)本課題組前期研究[7]，三物白散混懸液由巴豆霜（含10%油）、浙貝母、桔梗以1∶3∶3組成，所需飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房。

1.4 ?主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基、PBS沖洗液（Hyclone公司）;胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）;胎牛血清（杭州四季青公司）;二甲基亞砜（DMSO，AMRESCO公司）;Puromycin（Clontech公司）;D-Hanks（上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司）;Annexin-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（eBioscience公司）。SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;HERAcell 150iCO2培養(yǎng)箱賀利氏（賽默飛世爾公司）;DW-HL3985超低溫冰箱（中科美菱低溫科技股份有限公司）;倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;Guava easyCyte HT流式細(xì)胞儀（默克密理博）等。

2 方法

2.1 ?三物白散含藥血清制備

將20只SD雄性大鼠隨機(jī)分為空白組和三物白散組，按0.07 g/kg劑量灌胃，1次/d，采用“通法”灌藥，連灌7 d;空白組灌胃給予等體積生理鹽水。于末次給藥后1 h后，腹主動(dòng)脈采血，4 ℃下靜置4 h，3 000 r/min離心20 min，分離血清。經(jīng)56 ℃水浴鍋滅活30 min及0.22 μm微孔濾膜無菌過濾后，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 ?細(xì)胞培養(yǎng)

將SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。至細(xì)胞生長至70%～80%傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 ?慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞

取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，如完全培養(yǎng)基制成（3～5）×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液，按2 mL/孔接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)保證轉(zhuǎn)染時(shí)鋪板量達(dá)到15%～30%左右。將SGC-7901細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組、LV-RNAi 組（陰性對(duì)照空載體慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組）、Survivin-RNAi-LV組（Survivin基因沉默慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組）。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在細(xì)胞密度達(dá)到20%、MOI值為10時(shí)，用含有5 μg/mL polybrene的1 mL新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，在LV-RNAi組加入4 μL/孔病毒，Survivin-RNAi-LV組加入6.67 μL/孔病毒，空白對(duì)照組無特殊處理。轉(zhuǎn)染后16 h更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，中途可對(duì)細(xì)胞換液，保持細(xì)胞活性。轉(zhuǎn)染后72 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Survivin的表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)正常，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 ?流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡

（1）慢病毒轉(zhuǎn)染后對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響，分3組：空白對(duì)照組、LV-RNAi組、Survivin-RNAi-LV組。（2）慢病毒轉(zhuǎn)染后加上三物白散含藥血清干預(yù)對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響，分為3組：空白對(duì)照+中藥組、LV-RNAi+中藥組、Survivin-RNAi-LV+中藥組。將以上6組細(xì)胞懸液以5×104個(gè)/孔分別相應(yīng)地接種到6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)。12 h后，棄培養(yǎng)基，前3組每孔加入DMEM培養(yǎng)基2 mL，后3組每孔加入含5%含藥血清的培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用胰酶消化各組細(xì)胞，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞;經(jīng)Annexin V-FITC/PI染色后，流式細(xì)胞儀檢測各組SGC-7901細(xì)胞的凋亡率。

2.5 ?劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的遷移能力

（1）慢病毒轉(zhuǎn)染后對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響，分為3組：空白對(duì)照組、LV-RNAi組、Survivin-RNAi-LV組。（2）慢病毒轉(zhuǎn)染后加上三物白散含藥血清干預(yù)對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響，分為3組：空白對(duì)照+中藥組、LV-RNAi+中藥組、Survivin-RNAi-LV+中藥組。將以上6組的細(xì)胞懸液以3×104個(gè)/孔分別相應(yīng)地接種到96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔培養(yǎng)基100 μL，6個(gè)組均37 ℃培養(yǎng)24 h。第2天細(xì)胞達(dá)到90%以上融合度，使用劃痕儀對(duì)準(zhǔn)96孔板的下端中央部位，向上輕推形成劃痕;使用無血清DMEM培養(yǎng)基輕輕漂洗2～3遍，前3組每孔加入DMEM培養(yǎng)基100 μL，后3組每孔加入含5%含藥血清的DMEM培養(yǎng)基100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，選擇0、8、24 h在熒光顯微鏡拍照，計(jì)算各組細(xì)胞遷移率。

2.6 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以“x±s”表示，并進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性以及方差齊性則使用單因素方差分析，如不滿足，則行秩和檢驗(yàn)。P<0.05 時(shí)判定差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 ?細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

選取分裂活躍，代謝旺盛的對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

3.2 ?慢病毒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞

將人胃癌SGC-7901細(xì)胞取MOI值為10進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到80%，轉(zhuǎn)染72 h后，LV-RNAi組與Survivin-RNAi-LV組均可見綠色熒光，空白對(duì)照組未見熒光。見圖2。

3.3 ?各組對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，Survivin-RNAi-LV組的細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對(duì)照組和LV-RNAi組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;Survivin-RNAi-LV+中藥組的細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照+中藥組、LV-RNAi+中藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;Survivin-RNAi-LV組與Survivin-RNAi-LV+中藥組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3-4。

3.4 ?各組對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的遷移能力，得到不同拍照時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞遷移率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：胃癌細(xì)胞的8 h遷移率各組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;胃癌細(xì)胞的24 h遷移率：（1）Survivin-RNAi-LV組明顯低于空白對(duì)照組和LV-RNAi組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;（2）Survivin-RNAi-LV+中藥組與空白對(duì)照+中藥組、LV-RNAi+中藥組比較，其結(jié)果明顯低于后兩者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;（3）Survivin-RNAi-LV+中藥組與Survivin-RNAi-LV組比較，細(xì)胞遷移率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖5-6。

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，其病機(jī)普遍都伴隨著寒凝、痰結(jié)、毒積、血瘀的病理特點(diǎn)，因而運(yùn)用具有溫下攻逐作用的加味三物白散治療進(jìn)展期胃癌，取得了一定的臨床療效[8]。三物白散出自《傷寒論·太陽病脈證并治》第141條：“寒實(shí)結(jié)胸，無熱證者，與三物白散”。原方由巴豆、浙貝母、桔梗三物組成，方中巴豆辛熱有毒，有溫通寒實(shí)，攻逐痰水之功，貝母有止咳化痰，清熱散結(jié)之用，桔梗有開肺散結(jié)祛痰之效。三藥合用，能散寒而除實(shí)，共奏溫下逐瘀，化痰散結(jié)之功。有研究表明，三物白散可以抑制胃癌細(xì)胞增殖，通過阻滯細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低胃癌細(xì)胞P53、RasP21等基因的表達(dá)率，逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞多藥耐藥性，防止胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[9]。

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟和多階段的復(fù)雜過程，需要眾多基因的參與[10]。Survivin是凋亡蛋白抑制因子家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）成員，具有最強(qiáng)的凋亡抑制作用，其在正常胃黏膜中的表達(dá)呈缺失狀態(tài)，胃癌細(xì)胞系呈過表達(dá)狀態(tài)，且因其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能，參與抑制細(xì)胞凋亡、細(xì)胞有絲分裂和新生血管的生成[11];再者，高表達(dá)的Survivin基因使得腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性降低[12]，故而Survivin已成為腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)沉默Survivin基因的表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的化療敏感性[13]。而Survivin基因沉默后能否增加胃癌細(xì)胞對(duì)中藥復(fù)方三物白散的敏感性，以增強(qiáng)三物白散對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡等作用，尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過RNA干擾Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞，觀察三物白散對(duì)干預(yù)后的胃癌細(xì)胞凋亡、遷移的影響，為研究提高三物白散抗胃癌的治療效果提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，Survivin基因沉默促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的凋亡并抑制其遷移，再經(jīng)三物白散處理后（Survivin-RNAi-LV+中藥組）與單用中藥三物白散（空白對(duì)照+中藥組）或僅抑制Survivin基因的表達(dá)（Survivin-RNAi-LV組）比較，其促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移能力顯著升高。因此，RNA干擾Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)三物白散的敏感性，提高了對(duì)胃癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡、抑制遷移的作用。其作用機(jī)制極可能與Survivin有著強(qiáng)大的抗凋亡作用有關(guān)，其可直接作用于Caspase，抑制Caspase-3及Caspase-7的活性，阻斷細(xì)胞的凋亡過程[14]，而凋亡抑制及相關(guān)細(xì)胞凋亡抑制基因的表達(dá)能夠引起多藥耐藥的產(chǎn)生[15]。當(dāng)然，亦可能存在其他的作用機(jī)制，Survivin參與腫瘤新生血管的生成，與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）關(guān)系密切。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的調(diào)控血管生成的效應(yīng)因子，已成為腫瘤生長的藥物靶點(diǎn)之一，而Survivin可調(diào)控VEGF抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)血管生成，為腫瘤的生長和侵襲提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)[16]。

綜上所述，RNA干擾Survivin基因沉默后，三物白散對(duì)人胃癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡、抑制遷移的作用顯著增強(qiáng)，其機(jī)制極可能是Survivin基因的表達(dá)下調(diào)，凋亡抑制作用降低，增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性;亦可能因Survivin與EVGF表達(dá)的正相關(guān)性，當(dāng)Survivin基因的表達(dá)下調(diào)，增加了血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，抑制了腫瘤血管的生成，提高了藥物的療效。因此，還需進(jìn)一步深入研究探討其作用。

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