張喜武 李秋晗 李英鵬 李永吉 徐坐帝 竇金金

摘 要 目的：制備丁香苦苷固體脂質納米粒（SYR-SLN），優(yōu)化處方，并對其進行表征。方法：采用乳化蒸發(fā)法制備SYR-SLN，以包封率為指標，在單因素試驗考察基礎上，通過正交試驗設計對處方中卵磷脂-單甘酯質量比、有機相-水相體積比、泊洛沙姆188（F68）濃度、投藥量進行優(yōu)化，確定最優(yōu)處方工藝，考察所制納米粒的包封率、載藥量、形態(tài)、粒徑、Zeta電位、穩(wěn)定性等。結果：卵磷脂-單甘酯質量比為3 ∶ 1，有機相-水相體積比為1 ∶ 2，F(xiàn)68的濃度為0.4%，投藥量為10 mg，最優(yōu)處方工藝為單甘酯80 mg、卵磷脂240 mg、F68濃度0.4%、SYR 10 mg、無水乙醇5 mL、蒸餾水10 mL，乳化溫度為65 ℃，攪拌速度為600 r/min。所得SYR-SLN的包封率為（42.35±0.60）%（n=3），載藥量為（5.33±0.03）%（n=3），其外觀圓整，分布均勻，平均粒徑為（180.30±5.31） nm，Zeta電位為 （-41.9±0.8） mV，4 ℃條件下貯存15 d穩(wěn)定性良好。結論：本方法成功制得SYR-SLN，且處方工藝簡單，包封率高。

關鍵詞 丁香苦苷；固體脂質納米粒；制備；處方工藝；表征

Preparation and Characterization of Syringopicroside Solid Lipid Nanoparticles

ZHANG Xiwu1，LI Qiuhan1，LI Yingpeng2，LI Yongji3，XU Zuodi1，DOU Jinjin4（1.Academy of TCM， Heilongjiang University of TCM， Harbin 150040， China；2.College of TCM， Tianjin University of TCM， Tianjin 301617， China；3.College of Pharmacy， Heilongjiang University of TCM， Harbin 150040， China；4.College of Clinical Medicine， Heilongjiang University of TCM， Harbin 150040， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Syringopicroside solid lipid nanoparticles （SYR-SLN）， and optimize the formula and characterize SYR-SLN. METHODS： SYR-SLN were prepared by emulsion evaporation method. Using entrapment efficiency as index， based on single factor， orthogonal design was adopted to optimize the mass ratio of lecithin-monoglyceride， volume ratio of organ phase to water phase， poloxamer 188 （F68） concentration and drug dosage. The optimal formula technology was established to investigate entrapment efficiency， drug-loading amount， morphology， particle size， Zeta potential， stability， etc. RESULTS： The mass ratio of lecithin-monoglyceride was 3 ∶ 1； the volume ratio of organic phase to water phase was 1 ∶ 2； the concentration of F68 was 0.4%； drug dosage was 10 mg. The optimal formula included that monoglyceride 80 mg， lecithin 240 mg， 0.4% F68， syringopicroside 10 mg， absolute ethyl alcohol 5 mL， distilled water 10 mL， emulsification temperature at 65℃ and stirring at 600 r/min. Encapsulation efficiency of SYR-SLN was （42.35±0.60）% （n=3）； drug-loading amount was （5.33±0.03）% （n=3）； SYR-SLN had a spherical morphology and was evenly distributed. The average particle size was （180.30±5.31） nm with Zeta potential of （-41.9±0.8） mV， and the SYR-SLN could maintain stable for 15 days at 4℃. CONCLUSIONS： SYR-SLN is prepared successfully， and the technology is simple with high encapsulation efficiency.

KEYWORDS Syringopicroside； Solid lipid nanoparticle； Preparation； Formula technology； Characterization

丁香苦苷（Syringopicroside，SYR）是從木犀科丁香屬植物紫丁香的干燥葉中提取得到的單體化合物[1]，具有抗病毒、抗菌、抗炎作用[2-3]，有研究表明SYR對乙型肝炎病毒作用顯著[4-5]。由于SYR屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物，在體內代謝快導致其生物利用度低，限制了該藥物的開發(fā)。固體脂質納米粒（Solid lipid nanoparticle，SLN）是一種較為新型的納米粒給藥系統(tǒng)，可控制藥物釋放，延長藥物作用時間，同時也能夠起到定位靶向的作用[6-8]。本研究將SYR研制成SLN制劑，以包封率為考察指標對處方進行了優(yōu)化，并對最優(yōu)處方制劑進行了表征，為SYR新制劑的開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀系統(tǒng)，包括2996-2695Empower 色譜工作站（美國Waters公司）；85-2A恒溫磁力攪拌器（金壇市榮華儀器制造有限公司）；Zatasizer-3000HSA Zeta電位分析儀和Mastersizer S激光粒度儀（英國 Malvern公司）；Tem Tecnaig2透射電子顯微鏡（荷蘭 Philips公司）。

1.2 藥品與試劑

SYR對照品（批號：20170430，經(jīng)面積歸一化法測定純度：>98%）、SYR原料藥（批號：20170501，純度：>95%）均由黑龍江中醫(yī)藥大學自制；單硬脂酸甘油酯（單甘脂，湖南爾康制藥有限公司，批號：20170324）；卵磷脂（上海愛康精細化工有限公司，批號：20170821）；泊洛沙姆188（F68，巴斯夫中國有限公司，批號：20170102）；葡聚糖凝膠（Sephadex） G-50（瑞典Pharmacia公司）；甲醇（美國Dikma公司，色譜純）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 SYR-SLN與空白SLN的制備

稱取單甘酯100 mg、卵磷脂200 mg、SYR 10 mg，加入10 mL無水乙醇中，加熱使溶解，構成有機相；另取0.4% F68（m/V）的水溶液10 mL，加熱至與有機相相同溫度，構成水相，在1 000 r/min的攪拌速度下，將有機相注入水相中，攪拌1 h，揮發(fā)有機溶劑，體積濃縮至5 mL左右，可得半透明納米乳劑，將所得納米乳劑在攪拌下快速分散于0～2 ℃的稀釋相中，繼續(xù)攪拌2 h，即得SYR-SLN膠體溶液。同時按上述方法制備不含SYR的空白SLN膠體溶液。

2.2 SYR分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（50 ∶ 50，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：221 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液的制備 （1）對照品溶液的制備：稱取SYR對照品35 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，制成質量濃度為1.456 mg/mL的SYR對照品溶液。（2）供試品溶液的制備：精密吸取SYR-SLN膠體溶液1 mL，加入甲醇破乳并定容至25 mL量瓶中，1 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。（3）空白SLN溶液的制備：精密量取空白SLN膠體溶液1 mL，加入甲醇破乳并定容至25 mL量瓶中，1 000 r/min離心10 min，取上清液，即得空白SLN溶液。

2.2.3 專屬性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液及空白SLN溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果顯示，在該色譜條件下，SYR色譜峰與其他色譜峰的分離度均符合相關標準，表明空白SLN溶液對SYR的測定無干擾，方法的專屬性良好。色譜圖見圖1。

2.2.4 線性關系考察 精密量取SYR對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.25、7.5 mL，置于50 mL量瓶中，制備成系列標準溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積。以峰面積（A）為縱坐標，SYR質量濃度（c）為橫坐標，進行回歸分析。得回歸方程為A=16 226c-58 247（R2=0.999 9），結果表明，SYR在29.1～218.4 μg/mL質量濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗 精密量取SYR對照品溶液適量，制備成質量濃度為58.18 μg/mL的標準溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，同日連續(xù)進樣6次，考察日內精密度；每日進樣1次，連續(xù)測定6 d，考察日間精密度。結果顯示，日內RSD=0.81%（n=6），日間RSD=0.93%（n=6），表明本方法日內、日間精密度良好。

2.2.6 準確度試驗 取已知SYR含量的供試品溶液9份，分別加入質量濃度為50、55、60 μg/mL的SYR溶液，每個濃度各3份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，以測得值與真實值的比值計算回收率。結果顯示，平均回收率為100.49%、100.04%、99.05%（n=3），總平均回收率為99.86%（RSD<2%，n=3），符合含量測定要求。

2.2.7 重復性試驗 平行量取同一批供試品溶液6份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積。結果顯示，峰面積的RSD=0.67%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 精密量取供試品溶液，室溫下放置0、2、4、8、12、18、24 h后，按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，計算含量。結果顯示，SYR含量分別為58.11、57.79、57.91、57.62、57.24、57.13、57.07 μg/mL，RSD=0.71%（n=7），表明供試品溶液在24 h內基本穩(wěn)定。

2.3 包封率和載藥量檢測

精密量取SYR-SLN膠體溶液，加入至Sephadex G-50凝膠柱頂部，蒸餾水洗脫，分離出游離的SYR溶液。取游離的SYR溶液，用甲醇破乳并定容至25 mL量瓶中，1 000 r/min離心10 min，取上清液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測，計算游離SYR的含量。再計算SYR-SLN的包封率和載藥量，包封率（%）=（W總-W游離）/ W總×100%，載藥量（%）=（W總-W游離）/WP×100%，式中W總表示SYR-SLN膠膠體溶液中SYR的總含量；W游離表示游離SYR的含量；WP表示SYR-SLN的總量。

2.4 SYR-SLN處方篩選與優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗 在預試驗的基礎上，以包封率為考察指標，對乳化劑的選擇、乳化劑用量、有機相中乳化劑與載體材料比例、載體材料用量、投藥量、有機相-水相比例、攪拌速度、乳化條件進行了單因素考察，確定選用卵磷脂和F68為乳化劑，F(xiàn)68濃度為0.4%，有機相中卵磷脂-單甘酯質量比為3 ∶ 1，單甘酯用量為80 mg，投藥量為10 mg，有機相-水相體積比為1 ∶ 2，攪拌速度為600 r/min，乳化溫度為65 ℃時SYR-SLN的包封率最高。

2.4.2 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，確定以卵磷脂-單甘酯質量比（A）、有機相-水相體積比（B）、F68濃度（C）、投藥量（D）為考察因素，包封率為考察指標，采用L9（34）的正交試驗設計方案，每個因素取3個水平。因素與水平見表1，正交試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

由表3結果可知，除因素A對試驗結果具有顯著影響外，其他因素的影響均不顯著。綜合考慮，確定最優(yōu)處方為A2B2C2D2，即卵磷脂-單甘酯質量比為3 ∶ 1，有機相-水相體積比為1 ∶ 2，F(xiàn)68濃度為0.4%，投藥量為10 mg。

2.5 最優(yōu)處方工藝驗證

按“2.4”項下結果，確定最優(yōu)處方工藝：稱取10 mg SYR、240 mg卵磷脂、80 mg的單甘酯，加入5 mL無水乙醇中，加熱使之完全溶解，構成有機相；另取0.4%的F68水溶液10 mL，水浴加熱至與有機相相同溫度，構成水相，在65 ℃水浴中，600 r/min的攪拌速度下，將有機相注入水相中，乳化1 h，揮發(fā)有機溶劑，體積濃縮至5 mL左右，將所得納米乳劑在攪拌下快速分散于5 mL 0～2 ℃的稀釋相中，繼續(xù)攪拌1.5 h，即得SYR-SLN的膠體溶液。按上述處方工藝制備3批SYR-SLN的膠體溶液，再按“2.3”項下方法考察其包封率和載藥量，結果顯示，3批樣品的工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。驗證試驗結果見表4。

2.6 SYR-SLN的表征

2.6.1 粒子形態(tài) （1）肉眼觀察。用肉眼對SYR-SLN進行觀察，顯示SYR-SLN為透明略帶乳光的澄清液體，無沉淀及粒子存在。SYR-SLN的外觀見圖2。

（2）透射電鏡觀察。取SYR-SLN膠體溶液稀釋后，滴于封口膜上，用鑷子輕輕夾取涂好膜的銅網(wǎng)，放在SYR-SLN液滴上，漂浮沾取樣品后用鑷子將銅網(wǎng)置于2%磷鎢酸染液上漂浮染色，干燥完成后用透射電鏡進行觀察并拍照。結果顯示，SYR-SLN呈類球形實體粒子，外觀圓整，分布均勻。SYR-SLN的透射電鏡圖見圖3。

2.6.2 粒徑分布與Zeta電位 用激光粒度儀及Zeta電位分析儀對 SYR-SLN的粒徑與Zeta電位進行測定。結果顯示，SYR-SLN的平均粒徑為（180.30±5.31） nm（n=3），Zeta電位為（-41.9±0.8） mV。SYR-SLN的粒徑分布見圖4，Zeta電位分布見圖5。

2.6.3 穩(wěn)定性 將3批SYR-SLN樣品于室溫（25 ℃）及4 ℃冰箱冷藏保存，分別于0、1、3、7、15 d取樣，肉眼觀察外觀，并檢測其包封率，考察穩(wěn)定性。SYR-SLN在15 d內的外觀變化結果見表5，穩(wěn)定性試驗結果見表6。

從表4和表5結果可知，SYR-SLN在4 ℃條件下存放15 d，外觀均勻，包封率幾乎無變化。25 ℃條件下，SYR-SLN包封率隨存放時間的延長明顯下降，當存放7 d時，肉眼可見少許絮凝，且包封率有所降低；當存放15 d時，出現(xiàn)不可逆沉降，且包封率明顯下降。由此表明，SYR-SLN在4 ℃條件下存放15 d內比較穩(wěn)定。

3 討論

SYR-SLN的制備方法有很多，如薄膜超聲法、微乳法、復乳法和乳化蒸發(fā)法、乳化聚合法、溶劑分散法等[9-11]。本研究考慮SYR親水性極強，其中乳化聚合法、復乳法及乳化蒸發(fā)法均適合于水溶性藥物。預試驗發(fā)現(xiàn)，復乳法所制SYR-SLN粒徑較大，穩(wěn)定性不好；乳化聚合法制備SYR-SLN，得到的包封率較好，但載藥量極低；乳化蒸發(fā)法制備得到SYR-SLN的包封率和載藥量都很高，并且粒徑圓整、不粘連。另外筆者還比較了薄膜超聲法、乳化蒸發(fā)法、溶劑分散法所制SYR-SLN的包封率，結果發(fā)現(xiàn)，還是乳化蒸發(fā)法制備的SYR-SLN包封率最高，所以確定用乳化蒸發(fā)法作為SYR-SLN的制備方法。

在單因素考察過程中，雖然單獨使用卵磷脂作為乳化劑的包封率較高，但所得納米粒粘連、大小不均勻、粒徑偏大；單獨使用F68所得納米粒大小均勻、粒徑小，但包封率較低。F68是一種親水性表面活性劑，與卵磷脂合用作為乳化劑能得到較小的粒徑和較高包封率，且穩(wěn)定性好。因此選擇卵磷脂和F68合用作為乳化劑。其中F68作為水相的主要成分，而卵磷脂是有機相的成分之一，故在考察乳化劑和載體材料的質量比時，只選擇了卵磷脂與單甘脂進行比較。

包封率是評價SYR-SLN的重要指標，測定SLN包封率的方法有多種，如葡聚糖凝膠柱法、魚精蛋白沉淀法、冷凍超速離心法、微型柱法、透析法及超濾法等，其原理都是采用一定的方法使包封的藥物與游離藥物分離，測定包封或游離藥物的濃度，計算包封率[12-13]。透析法將納米粒溶液注入到適當?shù)耐肝龃鼉?，利用游離藥物可透過半透膜而納米粒不能透過的原理，從而達到分離的目的[14]。但是透析法時間較長，并且過程中會導致包封在納米粒中的藥物泄露，因此所測得包封率偏低。超速離心法是利用納米粒與其分散介質密度的不同而達到分離的目的，對設備的要求較高，操作費時且能源消耗較大。葡聚糖凝膠柱層析法是利用分子篩的原理，使混合組分依據(jù)分子的大小不同而得到分離[15]，納米粒由于其分子比游離藥物大，不易進入凝膠內部而先被洗脫，游離藥物后被洗脫。該法操作簡便，避免了超速離心法在離心過程中可能發(fā)生的納米粒變形與破裂現(xiàn)象。因此，最終選用葡聚糖凝膠柱層析法作為SYR-SLN測定包封率的方法。

綜上所述，本研究成功制得SYR-SLN，且處方工藝簡單、包封率高。

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（收稿日期：2019-01-03 修回日期：2019-03-15）

（編輯：鄒麗娟）