殷 娟，范雅倫，李 倩，付融冰，陳 玲

(同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092)

1 前 言

污染場(chǎng)地被視為潛在的污染源，不僅會(huì)對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響，還可能引發(fā)地下水污染。污染場(chǎng)地土壤的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，傳統(tǒng)方法是利用化學(xué)分析手段測(cè)定污染物的總量，再與規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較，從劑量-反應(yīng)關(guān)系評(píng)估其危害。但高的總濃度并不總能轉(zhuǎn)化為高遷移性、生物利用性和毒性[1-2]，因此單純依靠化學(xué)分析手段有可能會(huì)高估場(chǎng)地的污染情況。同時(shí)，我國土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅制定了有限環(huán)境項(xiàng)目的管控標(biāo)準(zhǔn)，難以對(duì)不同污染類型場(chǎng)地的污染程度做出準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。而生物毒性測(cè)試方法可有效彌補(bǔ)化學(xué)分析方法的局限性，反映污染物質(zhì)對(duì)生物體的綜合效應(yīng)，為特定場(chǎng)地的實(shí)際生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估給予技術(shù)支撐。

2 生物毒性測(cè)試方法

2.1 陸生生物毒性測(cè)試方法

陸生生物毒性測(cè)試方法能夠直接接觸環(huán)境毒性，被視為診斷場(chǎng)地污染物生物可利用部分危害的有用工具[3-4]。表1歸納了目前比較常用的生物毒性測(cè)試方法，表明不同的受試生物、毒性終點(diǎn)對(duì)不同污染類型的土壤表現(xiàn)出不同的敏感性。具體介紹如下：

表1 陸生生物毒性測(cè)試方法Tab.1 Terrestrial biological toxicity test methods

2.1.1 高等植物法

高等植物測(cè)試方法被視為評(píng)價(jià)污染土壤質(zhì)量的重要方法，尤其當(dāng)有植物毒性相關(guān)污染物存在時(shí)，植物測(cè)定就更為相關(guān)[5-6]。小麥、白菜、蘿卜、萵苣等具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物常被用于毒性測(cè)試，較為成熟的測(cè)試方法主要有根伸長抑制、種子萌發(fā)和植物早期生長等。根系由于直接與土壤接觸，通常可以快速靈敏地反映污染物的生態(tài)毒性，而且許多研究發(fā)現(xiàn)植物的根生長抑制通常比種子萌發(fā)更為敏感[7-8]。高等植物測(cè)試方法操作簡單、成本低，作為生產(chǎn)者其生長狀況是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)。但植物生長過程容易受到其他因素的影響，且測(cè)試時(shí)間長(至少需一周左右時(shí)間)，因此不建議用于場(chǎng)地污染的快速診斷。

2.1.2 陸生無脊椎動(dòng)物法

陸生無脊椎動(dòng)物物種豐富，相對(duì)容易采樣，并且可以快速響應(yīng)土壤干擾[9]。對(duì)于土壤污染，蚯蚓因其與土壤的緊密接觸及其在陸地食物網(wǎng)中的重要性而被廣泛用作試驗(yàn)物種。除蚯蚓外，其他動(dòng)物物種如鞘翅目、彈尾蟲、螨蟲、等足類動(dòng)物、線蟲和原生動(dòng)物等在土壤生態(tài)毒性評(píng)估中也顯示出良好的潛力[10]。主要的測(cè)試終點(diǎn)有死亡率、生長發(fā)育相關(guān)指標(biāo)(如體重?fù)p失)、繁殖及回避行為等[3，11～13]。生物標(biāo)志物如超氧化物歧化酶活性、活性氧水平、脂質(zhì)過氧化水平和DNA損傷程度等也越來越多地用于生態(tài)毒理學(xué)[13-14]。在較低層次的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，回避試驗(yàn)(測(cè)試周期 < 48h)作為早期篩選工具具有很大的潛力，因?yàn)樗鼈兠舾小⒊杀拘б娓咔揖哂猩鷳B(tài)相關(guān)性。而且Gainer等人發(fā)現(xiàn)[15]在受石油烴污染的土壤中，土壤無脊椎動(dòng)物的回避行為能夠達(dá)到與敏感植物物種生長測(cè)量對(duì)污染物相似的響應(yīng)范圍。但是陸生無脊椎動(dòng)物法也有一些局限性，如試驗(yàn)成本較高、需要特殊儀器裝置等。

2.1.3 土壤微生物法

作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分之一，微生物常被用來評(píng)估重金屬或農(nóng)藥(如除草劑)污染土壤的毒性[16～18]。尤其是對(duì)于重金屬污染而言，土壤微生物比其他陸地生物對(duì)金屬濃度升高更敏感[19]。微生物測(cè)試方法常用的毒性指標(biāo)包括土壤呼吸、土壤酶活性以及群落水平上的微生物生物量、群落結(jié)構(gòu)多樣性、活性等。相比于植物和動(dòng)物，在技術(shù)層面上來說微生物方法最易實(shí)現(xiàn)對(duì)群落水平的研究。一些先進(jìn)的分子生物學(xué)方法如基因芯片、高通量測(cè)序(Illumina平臺(tái))、變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)等也逐漸應(yīng)用到生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域中。如Romdhane等人[16]以細(xì)菌的群落多樣性和活性為測(cè)試終點(diǎn)來評(píng)價(jià)除草劑的生態(tài)毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于16S rRNA的高通量測(cè)序與代謝組學(xué)方法的結(jié)合是評(píng)估和比較天然和合成三酮對(duì)土壤細(xì)菌群落的生態(tài)毒理學(xué)影響的有力方法。與植物和動(dòng)物法相比，微生物法操作簡便、試驗(yàn)周期短、有良好的重現(xiàn)性，但鑒于不同土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)與數(shù)量不同，對(duì)污染物的靈敏度不盡相同，導(dǎo)致不同類型場(chǎng)地土壤的測(cè)試結(jié)果無法進(jìn)行比較。

2.2 水生生物毒性測(cè)試方法

考慮到水體部分是大多數(shù)土壤污染物的最終受體，需要采用更全面的方法來評(píng)估其與陸地環(huán)境的相互作用。常用的如魚類毒性測(cè)試、發(fā)光菌毒性測(cè)試以及大型蚤(Daphniamagna)毒性測(cè)試等方法列于表2。比較發(fā)現(xiàn)，在魚類毒性試驗(yàn)中，斑馬魚(Daniorerio)由于繁殖快、易于飼養(yǎng)和世代時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，成為生態(tài)毒理學(xué)研究中的一種理想模式生物。而與成魚相比，斑馬魚胚胎具有敏感、快速、體外測(cè)試、高通量且倫理爭議少等優(yōu)點(diǎn)逐漸取代成魚(或幼魚)，在環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。發(fā)光菌毒性測(cè)試方法由于靈敏、價(jià)格低可以用于污染土壤浸提液生態(tài)毒性的快速篩選[23]。目前國內(nèi)常用的3 種發(fā)光細(xì)菌為：明亮發(fā)光桿菌(Photosbacteriumphosphoreum)、費(fèi)氏弧菌(Vibriofischeri)和青海弧菌(Vibrioqinghaiensis)。國外的發(fā)光菌毒理學(xué)研究開展得較早，成套方法一般稱為Microtox檢驗(yàn)，也有特殊的專為土壤樣品而設(shè)計(jì)Microtox-STP?(固相測(cè)試)程序[24]。大型蚤(Daphniamagna)毒性試驗(yàn)在土壤污染測(cè)試中，研究的指標(biāo)主要有死亡率、繁殖率和運(yùn)動(dòng)抑制率，其中繁殖率和運(yùn)動(dòng)抑制率對(duì)重金屬污染土壤的浸提液表現(xiàn)出較高的敏感性[25-26]。另外，利用敏感的水生植物對(duì)水體污染情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，也是有效反映水環(huán)境生態(tài)毒性的重要手段之一。

通過孔隙水吸收是水生生物對(duì)污染物的重要暴露途徑[27]，對(duì)土壤浸出液進(jìn)行水生生物測(cè)定能夠分析化學(xué)品的遷移的可能性以及其對(duì)不同營養(yǎng)等級(jí)非目標(biāo)生物的不利影響[28]。但是受試物種對(duì)浸提液pH有嚴(yán)格要求，如斑馬魚胚胎急性毒性測(cè)試要求pH在6.8～8.4，發(fā)光菌Microtox方法要求pH在6～8等。

表2 水生生物毒性測(cè)試方法Tab.2 Aquatic biological toxicity test methods

3 生物毒性測(cè)試方法選擇

生物毒性測(cè)試方法能檢測(cè)有關(guān)污染化學(xué)品的信息以及可能危害環(huán)境的物質(zhì)的生物可利用性。但是毒性測(cè)試方法對(duì)不同污染類型的場(chǎng)地土壤敏感性各異，僅利用單一的毒性測(cè)試方法無法準(zhǔn)確而全面地反映污染場(chǎng)地的生態(tài)毒性效應(yīng)，成組的生物毒性測(cè)試方法可更加準(zhǔn)確地揭示土壤的生態(tài)毒性。污染場(chǎng)地土壤通常是復(fù)雜的混合物，通過使用一系列包含不同功能水平、暴露途徑和測(cè)試終點(diǎn)的一組測(cè)試物種，可以正確評(píng)估其毒性，基本要求是有效性(污染場(chǎng)地條件的相關(guān)性)和生物測(cè)定的靈敏度[27]。生物毒性測(cè)試的條件和受試物種可借鑒國際上的標(biāo)準(zhǔn)方法?？紤]到場(chǎng)地土壤污染物的復(fù)雜性和現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境條件的多變性，標(biāo)準(zhǔn)方法不可能適用于所有地區(qū)，受試物種、試驗(yàn)方法、時(shí)間等需根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。如在選擇受試生物時(shí)，既要考慮國際上公認(rèn)的模式生物，同時(shí)也應(yīng)該結(jié)合當(dāng)?shù)氐膭?dòng)植物的實(shí)際情況，選擇更為常見、重要且敏感性好的物種。苗秀蓮等人[33]探究了我國5個(gè)優(yōu)勢(shì)跳蟲物種在瓊脂培養(yǎng)基條件下對(duì)鎳(Ni2+)的毒性響應(yīng)。Santorufo等人[4]利用彈尾蟲物種(O.pseudostachianus)作為受試生物，研究其對(duì)土壤毒性評(píng)估的作用。相比于標(biāo)準(zhǔn)物種跳蟲(F.candida)，該物種是歐洲本土物種，且廣泛分布于意大利，對(duì)當(dāng)?shù)丨h(huán)境更具有代表性。

孫鐵珩等人[34]指出土壤生態(tài)毒理診斷的方法體系應(yīng)建立在土壤的不同功能和特殊用途的基礎(chǔ)上。國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)17616中也提到在診斷不同類型的土壤(如農(nóng)業(yè)土壤與自然棲息地)毒性時(shí)，要選擇不同的生物毒性測(cè)試方法[35]。2018年6月我國頒布了農(nóng)用地(GB15618-2018)和建設(shè)用地(GB36600-2018)土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[36-37]。針對(duì)農(nóng)用土壤而言，建議結(jié)合高等植物、動(dòng)物、微生物毒性測(cè)試來綜合評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量；而對(duì)于建設(shè)用地，建議重點(diǎn)對(duì)動(dòng)物毒性進(jìn)行測(cè)定，而植物和微生物毒性可選擇性測(cè)定。污染物通過地表徑流、淋溶等途徑進(jìn)入到地表水和地下水中，從而引起地表水體和地下水體污染，土壤污染被認(rèn)為是對(duì)附近水生生態(tài)系統(tǒng)的主要威脅[38]。因此針對(duì)污染場(chǎng)地的生物毒性測(cè)試一般應(yīng)將陸生與水生生態(tài)毒性相結(jié)合。無論是農(nóng)用土壤還是建設(shè)用地，水生生物毒性測(cè)試都是必不可少的。

在眾多的生物學(xué)指標(biāo)中挑選出快速、敏感的測(cè)試終點(diǎn)來評(píng)估場(chǎng)地土壤污染物的生態(tài)毒性一直是領(lǐng)域內(nèi)專家的重點(diǎn)研究方向。除了靈敏性之外，目前人們?cè)絹碓疥P(guān)注“生物指標(biāo)的早期預(yù)警性”，希望通過“組學(xué)”手段來發(fā)展新型的生物標(biāo)志物。另有研究發(fā)現(xiàn)存在一些特異性生物標(biāo)志物能夠指示某種特定類型的污染。如金屬硫蛋白(Metallothionein)參與調(diào)節(jié)痕量金屬的代謝并防止重金屬毒性和氧化應(yīng)激[39]。在過去幾年中，已經(jīng)提出使用金屬硫蛋白作為環(huán)境金屬污染的生物標(biāo)志物，使用包括脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物在內(nèi)的不同生物[40-41]。

4 結(jié) 論

4.1 利用生物毒性測(cè)試方法結(jié)合化學(xué)分析能夠較全面地評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量。而每種生物毒性測(cè)試方法都有適用范圍，在對(duì)不同污染類型的場(chǎng)地進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)時(shí)，需綜合考慮其靈敏度、生態(tài)相關(guān)性、方法的重現(xiàn)性、土壤利用類型等選擇合適的受試生物和測(cè)試終點(diǎn)。

4.2 陸生生物毒性測(cè)試方法適用于對(duì)實(shí)際原土的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，反映土壤的棲息地功能。其中高等植物法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確可信、成本低。動(dòng)物測(cè)試一般以存活、繁殖、畸形、行為反應(yīng)等為毒性終點(diǎn)。微生物法試驗(yàn)周期短、重現(xiàn)性好，利用高通量測(cè)序、DGGE等較先進(jìn)的技術(shù)分析群落結(jié)構(gòu)多樣性，能有效地評(píng)估污染土壤的毒性。

4.3 水生生物毒性測(cè)試方法利用水生生物(如魚類、發(fā)光菌、大型蚤等)來診斷土壤浸提液的生態(tài)毒性，常被用來評(píng)價(jià)土壤的滯留功能。其中斑馬魚(Daniorerio)是毒理學(xué)的理想模式生物，通過對(duì)斑馬魚的毒性測(cè)試能為人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供一定參考。