何芝菲

摘 ? ?要：狂犬病是一種由狂犬病病毒引起的烈性傳染病。本試驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)一例疑似人感染狂犬病病毒的病例分7個(gè)時(shí)段采集其尿液及唾液標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。結(jié)果顯示，7個(gè)唾液樣本狂犬病病毒均為陽(yáng)性，7個(gè)尿液樣本中5個(gè)樣本為陽(yáng)性，2個(gè)樣本為陰性，唾液樣本Ct值明顯優(yōu)于尿液樣本。本試驗(yàn)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用到臨床檢測(cè)狂犬病病毒具有重要的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：狂犬病病毒;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65 ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1004-7344（2019）03-0272-02

狂犬?。╮abies）是由狂犬病毒（rabiesvirus，RABV）所致的人獸共患急性傳染病，發(fā)病后死亡率接近100%。全球每年約有5.5萬(wàn)人死于狂犬病，我國(guó)是狂犬病高發(fā)地區(qū)，因感染狂犬病死亡的人數(shù)居世界第二[1]。在我國(guó)，狂犬病是國(guó)家重點(diǎn)防控的乙類(lèi)傳染病。近年來(lái)，由于我國(guó)養(yǎng)犬、貓等寵物的家庭日漸增多，該病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]。據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心2017年的最新統(tǒng)計(jì)，2017年全國(guó)狂犬病發(fā)病數(shù)為516人，死亡502人。

狂犬病毒屬于彈狀病毒（Rhabdoviridae）狂犬病毒屬，是單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)度為11928～11932nt，編碼5種蛋白結(jié)構(gòu)，5種蛋白對(duì)應(yīng)5種結(jié)構(gòu)基因編碼，其中N基因具有毒株間的相對(duì)保守性和高拷貝復(fù)制性，是分子診斷的目標(biāo)序列[3]。近年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，核酸診斷技術(shù)被應(yīng)用到狂犬病的診斷中。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimePCR）是基于傳統(tǒng)PCR上發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)核算拷貝數(shù)量、靈敏度高、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于病毒性病原體的快速檢測(cè)中[4]。目前，國(guó)內(nèi)鮮有采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)人體感染狂犬病病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)一例人感染狂犬病病毒的病例進(jìn)行取樣檢測(cè)，旨在為實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用到臨床檢測(cè)狂犬病病毒提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?標(biāo)本信息

患者劉某，男，53歲，重慶市潼南區(qū)人。該患者于2018年7月被犬咬傷手臂，暴露程度Ⅲ度，傷口未處理。劉某于2018年11月28日出現(xiàn)煩躁、恐水、怕風(fēng)、抽出等癥狀，并于12月1日入院。2018年12月3日晚間19點(diǎn)至4日早上7點(diǎn)期間，時(shí)隔2h對(duì)患者中段尿及唾液進(jìn)行采集，共計(jì)14個(gè)樣本（1～7號(hào)為尿液樣本，8～14號(hào)為唾液樣本），采集后的樣品于-20℃下保存。

1.2 ?試劑與儀器

病毒核酸提取試劑盒（磁珠法）和狂犬病毒核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）均購(gòu)自江蘇碩世生物科技有限公司，Real-TimePCRSystem（stepone），全自動(dòng)核酸提取儀（SSNP-2000A）。

1.3 ?方 法

1.3.1 ?核酸提取

將樣品于室溫條件下融凍，向病毒核酸提取試劑盒對(duì)應(yīng)孔位分別加入樣品200μl，置于全自動(dòng)核酸提取儀中進(jìn)行核酸提取，具體操作見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。提取完成后吸出樣品核酸于保存管中，-20℃下保存。

1.3.2 ?實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

①反應(yīng)體系：每人份PT-PCR反應(yīng)液7.5μl，酶混合液5μl，狂犬病反應(yīng)液4μl，去RNA酶水3.5μl，樣品5μl，總體積25μl。②反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)50℃30min，預(yù)變性95℃5min，變性95℃10s，退火、延伸及檢測(cè)熒光55℃40s45個(gè)循環(huán)。

1.3.3 ?結(jié)果判定方法

（1）陽(yáng)性對(duì)照：Ct≤30且擴(kuò)增曲線呈典型S型顯示。

（2）陰性對(duì)照：無(wú)典型S型擴(kuò)增曲線顯示。

（3）樣本陽(yáng)性：Ct≤35且曲線呈S型。若樣本檢測(cè)結(jié)果35（4）樣本陰性：Ct>38或者未檢出。

2 ?結(jié) 果

2.1 ?實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)尿液樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)7個(gè)時(shí)段采集的病人中段尿樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖可知2號(hào)和6號(hào)樣本為陰性，其余樣本實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Ct值分別為1號(hào)：35.68，3號(hào)：35.77，4號(hào)：36.63，5號(hào)：36.12，7號(hào)：35.92。

2.2 ?實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)唾液樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)7個(gè)時(shí)段采集的病人唾液樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2，由圖可知7個(gè)唾液樣本均含有狂犬病病毒，各樣本實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Ct值分別為8號(hào)：30.12，9號(hào)：31.22，10號(hào)：30.91，11號(hào)31.75，12號(hào)：29.33，13號(hào)：29.89：14號(hào)29.78。

3 ?討 論

本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)以一例真實(shí)發(fā)病的病人7個(gè)時(shí)段唾液及尿液為樣本進(jìn)行檢測(cè)。由結(jié)果可知尿液樣本中2號(hào)和6號(hào)樣本結(jié)果為陰性，其余時(shí)段尿液均有病毒檢出，而7個(gè)唾液樣本所有時(shí)均為陽(yáng)性，且曲線的CT值明顯優(yōu)于尿液樣本。這是由于狂犬病的最主要傳染源是發(fā)病和攜帶病毒的動(dòng)物，這些動(dòng)物的唾液中含有大量病毒[5]，并通過(guò)咬傷、抓傷進(jìn)行傳染，因此唾液樣本的病毒含量遠(yuǎn)高于尿液樣本。而狂犬病毒的分泌量由一定的波動(dòng)性[6]，因此在尿液樣本中出現(xiàn)兩個(gè)陰性。

目前，對(duì)狂犬病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、熒光抗體技術(shù)（FAT）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimePCR）等。目前FAT技術(shù)是WHO和OIE推薦的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法，但此方法需要異硫氰酸熒光素鹽為熒光標(biāo)記物標(biāo)記抗體以定位抗原，同時(shí)還需要使用熒光顯微鏡，操作較繁瑣，對(duì)試驗(yàn)操作人員專(zhuān)業(yè)素質(zhì)要求較高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以其快速、靈敏、重復(fù)性好的特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于高通量的病毒檢測(cè)，目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)應(yīng)用這一技術(shù)建立了多種檢測(cè)RABV的熒光定量PCR方法，針對(duì)我國(guó)狂犬病的流行特征，許運(yùn)斌[7]等均成功合成引物和探針建立了熒光定量PCR檢測(cè)RABV的方法。但實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在試驗(yàn)過(guò)程中容易造成樣本的污染導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)，這一情況有待進(jìn)一步研究改善。

狂犬病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)生命安全的疫病，急需一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的診斷方法。本試驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了一例人感染狂犬病病毒的尿液及唾液樣本，一定程度上填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)使用此方法用于臨床檢測(cè)報(bào)道的空白，對(duì)未來(lái)實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于臨床檢測(cè)人感染狂犬病病毒的檢測(cè)及推廣有一定的參考價(jià)值。

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收稿日期：2018-12-7