侯含 王升平 張超群 等

摘 ?要：基于已有的植物Catalase 2基因（CAT2）序列設(shè)計(jì)煙草Nicotiana tabacum CAT2的特異性引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增克隆獲得Nicotiana tabacum var. NC89 CAT2 全長(zhǎng)mRNA序列，包含1479 bp完整的讀碼框（ORF），可編碼492個(gè)氨基酸殘基。遺傳進(jìn)化分析顯示，煙草NC89 CAT2與N. benthamiana CAT2基因親緣關(guān)系最近。利用Quantitative Real-time PCR技術(shù)分析了CAT2基因在NC89煙草中的組織特異性表達(dá)和其應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫的表達(dá)差異。結(jié)果表明，CAT2基因在煙草NC89的根、莖、葉、花瓣、花萼、種子中均有表達(dá)，其中在花中相對(duì)表達(dá)量最高，其次為葉、莖、種子和根。生物和非生物脅迫處理煙株，其CAT2誘導(dǎo)表達(dá)分析顯示，機(jī)械損傷、滲透壓、低溫和高溫、干旱和感染PVY時(shí)CAT2表達(dá)量均上調(diào)。上述研究表明煙草CAT2基因可能參與了應(yīng)對(duì)非生物和生物脅迫的過(guò)程。

關(guān)鍵詞：煙草;Catalase 2;非生物脅迫;生物脅迫

中圖分類號(hào)：S572.03 ?????????文章編號(hào)：1007-5119（2019）01-0001-08 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.001

Abstract： The full-length cDNA of Catalase 2 （CAT2） from Nicotiana tabacum var. NC89 was cloned usingspecific primers designed according to CAT2 mRNA sequences in other plants. Amino acid sequence alignment indicated that CAT2 contains a complete reading frame （ORF） of 1479 bp， which encodes 492 amino acid residues. Phylogenetic analysis showed that NC89 CAT2 shares high similarity with the CAT2 gene from N. benthamiana. Quantitative real-time PCR （qPCR） analysis revealed that CAT2 is highly expressed in petal and calyx， while less expressed in leaves， stems， seeds， and roots. The expression of NC89 CAT2 was enhanced by abiotic and biotic stressors， such as mechanical damage， osmotic pressure， low temperature， high temperature， drought and PVY infection. It was suggested that CAT2 plays an important role in growth， development， and interplay of abiotic and biotic stresses in plant.

Keywords： Nicotiana tabacum; Catalase2; abiotic stress; biotic stress

過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）又稱觸酶，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的抗氧化酶，LOEW[1]將其命名為Catalase，其廣泛存在于能呼吸的生物體內(nèi)，在植物體內(nèi)主要存在于葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而在動(dòng)物體內(nèi)主要存在于肝和紅細(xì)胞中。

CATs與SOD、POD、ASP一起被稱為酶保護(hù)

基金項(xiàng)目：江西省煙草公司科技項(xiàng)目“江西煙草病毒病綠色防控技術(shù)研究與應(yīng)用”（201701002）;四川省煙草公司科技項(xiàng)目“煙草病毒病快速檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用”（SCYC201804）;廣西壯族自治區(qū)煙草公司科技項(xiàng)目“廣西煙草綠色防控重大專項(xiàng)技術(shù)研究與推廣應(yīng)用”（201745000024095）;湖南省煙草公司科技項(xiàng)目“湖南煙區(qū)主要病毒病防控關(guān)鍵技術(shù)研究”（201743010020088）

作者簡(jiǎn)介：侯 ?含（1991-），女，研究生，研究方向：分子植物病理學(xué)。E-mail：angelichh@163.com。*通信作者，E-mail：yangjinguang@caas.cn

收稿日期：2018-07-17 ?????????????????修回日期：2018-10-19

系統(tǒng)[2]，其主要功能是將過(guò)氧化氫分解為水和氧氣，從而清除植物光呼吸、脂肪酸β氧化和線粒體電子傳遞等過(guò)程中產(chǎn)生的H2O2，在植物防御、脅迫應(yīng)答、控制細(xì)胞的氧化還原平衡和延緩衰老等方面起著重要作用[3]。前人已有研究，增強(qiáng)植物體內(nèi)抗氧化酶活性和抗氧化代謝水平可以提高植物本身的抗逆性[4-5]。在植物體內(nèi)，CATs家族由多基因編碼，其表達(dá)隨時(shí)空的不同而變化，也受到干旱、重金屬、高鹽、溫度、光照等非生物因子和病原等生物因子的雙重影響[6]。

本研究基于已經(jīng)報(bào)道的CAT2基因的序列，對(duì)煙草NC89（Nicotiana tabacum var. NC89）CAT2基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)分析，揭示了煙草CAT2基因在植物應(yīng)對(duì)生物脅迫和非生物脅迫中的功能，為深入研究植物的抗病和抗逆機(jī)制提供重要理論依據(jù);同時(shí)利用基因工程技術(shù)，為提高植物對(duì)各種脅迫的適應(yīng)能力和改善生態(tài)環(huán)境提供新的思路。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試材料

煙草材料及毒源：NC89、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）毒源為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所保存。除特別注明，煙草材料在25 ℃，14 h光照/10 h黑暗條件下培養(yǎng)。

1.2 ?研究地點(diǎn)與方法

1.2.1 ?試驗(yàn)地點(diǎn) ?中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所氣候室。

1.2.2 ?培養(yǎng)方法 ?藥品材料：LB固體和液體培養(yǎng)基;RNA提取試劑盒，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，pEASY-T1載體，大腸桿菌DH5α購(gòu)于青島群昌科貿(mào)有限公司（TRANS）;dNTP Mixture，Taq酶，Loading buffer，DNA marker、DNA凝膠回收試劑盒等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）;氨芐青霉素鈉鹽購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。引物合成由寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）完成。

1.2.3 ?總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄 ?將煙草組織采集后

放入液氮中速凍并轉(zhuǎn)入?80 ℃超低溫冰箱保存。不同組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，引物為通用引物OligdT18。

1.2.4 ?克隆、鑒定及測(cè)序 ?PCR擴(kuò)增體系：cDNA 1 μL、引物各2 μL、10×Trans Taq HiFi Buffer Ⅱ 5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、Trans Taq TMHiFi DNA Polymerase 1 μL、ddH2O 35 μL，總體積為50 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳后，按凝膠回收試劑盒的說(shuō)明，回收得到的目的DNA片段，并連接到載體pEASY-T1上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α上，對(duì)獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序（由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測(cè)定）。

1.2.5 ?樣品預(yù)處理 ?不同組織：分別取正常生長(zhǎng)條件下成熟煙草NC89的根、莖、葉、花瓣、花萼和種子。

機(jī)械損傷：對(duì)NC89從上往下第2片葉進(jìn)行針刺傷害處理，每片葉針刺50次，4、8、12、16 h 后分別取材，以正常生長(zhǎng)為對(duì)照。

滲透壓：采用250 mmol/L NaCl噴施葉面處理2、4、6、8、10 h，取上部第2片葉，以清水處理為對(duì)照。

溫度處理：以25 ℃處理為對(duì)照，在4 ℃和40 ℃環(huán)境下培養(yǎng)NC89幼苗，分別于4、8、12、16 h取上部第2片葉，以相同溫度的清水澆灌。

干旱處理：于消除澆水1、3、5、7 d采集上部第2片葉，以正常澆水為對(duì)照。

紫外處理：紫外照射2、4、6、8、10 h，采集上部第2片葉片，以正常條件下葉片作對(duì)照。

接毒處理：NC89接種PVY病毒24、48和72 h后取上部第2片葉，以清水處理為對(duì)照。

每個(gè)處理3次生物重復(fù)，處理后取樣研磨分裝保存，置于?80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 ?Quantitative real-time PCR對(duì)表達(dá)差異的分析 ?提取各處理樣品總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)克隆獲得的煙草CAT基因序列，通過(guò)Primer軟件進(jìn)行Quantitative real-time PCR特異性引物設(shè)計(jì)[7]，然后利用Oligo 6.0軟件和在線數(shù)據(jù)庫(kù)Oligo

Calc（http：//www.basic.northwestern.edu/biotools/ oligocalc.html）對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行評(píng)價(jià)，并通過(guò)在線BLSAT程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）進(jìn)行驗(yàn)證，以避免引物序列與煙草基因組其他序列同源。引物為CAT2-F、CAT2-R、18sF、18sR，其中18s rRNA為內(nèi)參基因（表1）。Quantitative real-time PCR反應(yīng)在AB7500（Applied Biosystems 7500 Real-time）PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)體系的配制均按TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。測(cè)定值用平均值加標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用CT值來(lái)比較各基因的相對(duì)表達(dá)量，目的基因相對(duì)表達(dá)量用目的基因mRNA表達(dá)水平比內(nèi)參基因mRNA表達(dá)水平的相對(duì)倍數(shù)來(lái)表示，分析CAT2基因在不同組織、非生物和生物脅迫下表達(dá)差異。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?基因克隆及序列分析

根據(jù)GenBank中已有的植物CAT2基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)煙草CAT2的特異性引物（CAT2F、CAT2R），通過(guò)煙草葉片的總RNA提取，PCR擴(kuò)增和測(cè)序，獲取片段為1489 bp（圖1），其序列如下：

通過(guò)NCBI的ORF finder軟件對(duì)CAT2全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行分析，其中包含1479 bp完整的讀

碼框（ORF），可編碼492個(gè)氨基酸殘基。經(jīng)過(guò)ExPASy網(wǎng)站ProtParam在線工具分析（http：//www. expasy. org/proteomics）預(yù)測(cè)NC89 CAT2分子量為56.41 kDa，等電點(diǎn)（pI）為6.87。

利用MEGA 4.0軟件通過(guò)Neighbor-Joining（N-J鄰接法）對(duì)已確定不同物種的CAT序列與NC89的CAT2序列進(jìn)行比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。在選取的13個(gè)物種中，明顯分為3大類。水稻、小麥、玉米和大豆分為一簇;普通煙草、辣椒、番茄和擬南芥分為一簇;NC89、白花單葉煙草、茄子、龍葵和馬鈴薯分為另一大簇，而在這一簇中茄子單獨(dú)一組，馬鈴薯和龍葵一組，而NC89和白花單葉煙草一組親緣性關(guān)系較近。

2.2 ?不同器官表達(dá)特異性分析

煙草NC89不同組織CAT2基因表達(dá)量分析顯示（圖3），CAT2基因在煙草NC89的根、莖、葉、

花瓣、花萼、種子中均有表達(dá)，但是不同組織間存在較大的差異。CAT2基因在根組織表達(dá)量最低，花萼組織中表達(dá)量最高，約是根組織的585 000倍，其次是花瓣，約是根組織的74 990倍，而葉組織中表達(dá)量約是根組織的7250倍，莖和種子組織表達(dá)量也很低與根組織表達(dá)量相近。

2.3 ?CAT2脅迫表達(dá)分析

為檢測(cè)CAT2基因在植物抗逆過(guò)程中的作用，對(duì)NC89煙苗在生物脅迫和非生物脅迫條件下基因表達(dá)水平進(jìn)行了qPCR分析（圖4），可知機(jī)械損傷4 h后，CAT2基因表達(dá)量較對(duì)照已有增長(zhǎng);處理8、12 h后CAT2基因表達(dá)量升高，分別為對(duì)照的11倍、15倍;在機(jī)械損傷處理16 h后表達(dá)量是對(duì)照的45倍。

NaCl處理2 h后CAT2基因的表達(dá)量與對(duì)照相近;處理4 h后CAT2的表達(dá)量增長(zhǎng)至對(duì)照的2倍;處理6 h后CAT2表達(dá)量為對(duì)照的60倍。處理8 h、10 h后CAT2基因的相對(duì)表達(dá)量明顯下降，與對(duì)照基本持平。

在低溫（4 ℃）脅迫4 h時(shí)CAT2基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到較高值為對(duì)照的8倍;處理8 h后CAT2的表達(dá)量降低為對(duì)照的3倍;在處理后12 h、16 h出現(xiàn)其表達(dá)量明顯下降，并在16 h后達(dá)到最低值。

高溫（40 ℃）脅迫4 h后，CAT2基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照基本相同;CAT2在高溫處理8 h后表達(dá)量為對(duì)照的2750倍;CAT2在處理12 h和16 h后基因相對(duì)表達(dá)量分別降低為對(duì)照的240倍、1550倍。

干旱處理1 d后CAT2基因表達(dá)量達(dá)到高峰，為對(duì)照的7倍;處理3 d后表達(dá)量降低至與對(duì)照持平，而處理5 d、7 d后CAT2的表達(dá)量與對(duì)照一致。

紫外處理2 h、4 h時(shí)CAT2基因表達(dá)量低于對(duì)照;處理6 h后，CAT2表達(dá)量開(kāi)始增長(zhǎng)與對(duì)照持平;處理8 h后CAT2基因表達(dá)量出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)，達(dá)到對(duì)照的5000倍;處理10 h后CAT2達(dá)到高峰為對(duì)照的6000倍。

接種PVY 24 h后（圖5）CAT2基因相對(duì)表達(dá)量增長(zhǎng)至對(duì)照的44倍;處理48 h后CAT2的表達(dá)量上升為對(duì)照的1035倍;處理72 h其表達(dá)量下降至與對(duì)照持平。

3 ?討 ?論

CAT基因家族由多基因編碼，曾在煙草、擬南芥、玉米、南瓜和大米等被子植物中發(fā)現(xiàn)3種過(guò)氧化氫酶[8-12]。本研究從N. tabacum var. NC89葉片成功克隆獲得CAT2基因的cDNA序列，對(duì)全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)NC89 CAT2有1479 bp完整的讀碼框（ORF），可編碼492個(gè)氨基酸;預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為56.41 kDa，等電點(diǎn)（pI）為6.87。通過(guò)Neighbor-Joiniing（N-J鄰接法）NC89和白花單葉煙草的CAT2同源性高。

已有研究表明，CAT2基因家族的表達(dá)具有組織和器官特異性。在正常生長(zhǎng)條件下，CAT2在發(fā)芽后的盾片表達(dá)豐富，而在葉片和上胚軸表達(dá)量較低[13];在南瓜中，CAT2在綠色子葉、成熟葉、莖和綠色胚軸都有表達(dá)[8]。擬南芥CAT2在花序和種子內(nèi)都表達(dá)[14]。本研究結(jié)果為CAT2基因在煙草NC89的根、莖、葉、花瓣、花萼、種子中都有表達(dá)，而CAT2在花萼組織中表達(dá)量最高，花瓣和葉片次之，在根、莖、種子中表達(dá)量較低，其中根組織表達(dá)量最低。本研究結(jié)果表明，NC89 CAT2基因的表達(dá)具有組織和器官特異性，CAT2在葉、花瓣、花萼中表達(dá)量豐富，可能與植物地上部的光呼吸產(chǎn)生的H2O2清除有關(guān)，而對(duì)于地下部的光呼吸產(chǎn)生的H2O2清除則可能與其他同源基因的表達(dá)有關(guān)。

機(jī)械損傷脅迫可以顯著提高CAT2表達(dá)量。在玉米未成熟的種子中，機(jī)械損傷處理能夠誘導(dǎo)提高3種CAT基因表達(dá)量;而在成熟葉片中，僅有CAT1和CAT3表達(dá)量提高，都在處理12 h后表達(dá)量顯著提高，CAT基因參與了玉米對(duì)損傷的適應(yīng)[15]。JUNG等[16]研究表明，Norflurazon （NF）誘導(dǎo)玉米CAT2轉(zhuǎn)錄水平的提高主要發(fā)生在葉內(nèi)，而在盾片中無(wú)明顯變化。本研究中，NC89在遭受機(jī)械損傷時(shí)，CAT2基因家族表達(dá)量變化與玉米的CAT2基因表達(dá)趨勢(shì)一致。CAT2在16 h表達(dá)量達(dá)到最高，從而推測(cè)NC89在遭受機(jī)械損傷時(shí)，CAT2基因與玉米CAT2有同樣的功能，與機(jī)械損傷過(guò)程中H2O2的清除有關(guān)。

滲透壓處理提高CAT2基因的相對(duì)表達(dá)量。在鹽脅迫條件下大麥等植物體內(nèi)CAT的活性明顯增加[17]，暗示H2O2可能在植物鹽脅迫調(diào)節(jié)過(guò)程中起作用，調(diào)節(jié)CAT基因的表達(dá)。但在高鹽（400 mmol/L）脅迫下，Bruguiera parviflora的CAT活性下降的同時(shí)，伴隨著POX和GR活性的增強(qiáng)[18]。本研究中，鹽脅迫能夠提高NC89 CAT2基因表達(dá)量，清除高鹽脅迫下產(chǎn)生的H2O2，從而參與高鹽脅迫的適應(yīng)。進(jìn)而推測(cè)CAT2基因隨著高鹽脅迫時(shí)間和濃度的變化，其活性也會(huì)有不同的變化，同時(shí)還可能伴隨著其他抗氧化酶的變化。

低溫和高溫處理可誘導(dǎo)CAT2基因的表達(dá)量提高。擬南芥隨著冷馴化時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠體基質(zhì)中CAT2的含量都有不同程度地增加[19]，線粒體中富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白（GRP2）通過(guò)調(diào)節(jié)CAT等酶的活性而提高了擬南芥對(duì)冷害和凍害脅迫忍耐能力[20]。FARIDUDDIN等[21]發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫導(dǎo)致番茄產(chǎn)量降低，而耐熱品種比熱敏感品種產(chǎn)量降低少，在耐熱品種中CAT酶活性都明顯增加。本研究結(jié)果與前人研究一致。從而推測(cè)，通過(guò)提高CAT酶活性能夠顯著增強(qiáng)植物低溫脅迫耐受性。而在高溫脅迫過(guò)程中，CAT2基因表達(dá)量提高說(shuō)明CAT2基因可能在夏季高溫天氣適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

干旱脅迫能夠誘導(dǎo)NC89 CAT表達(dá)量提高。樟樹(shù)具有較強(qiáng)的抗旱能力和傷害修復(fù)及超補(bǔ)償能力，在干旱脅迫條件下樟樹(shù)CAT活性顯著增加[22]?？购敌詮?qiáng)的玉米品種，其SOD、CAT、GPX等酶活性較高，研究發(fā)現(xiàn)玉米抗旱性與水分脅迫下CAT等保護(hù)酶活性呈顯著正相關(guān)[23]。小麥中CAT2的表達(dá)量在受到嚴(yán)重干旱時(shí)表達(dá)量顯著增強(qiáng)[24]。本研究表明在NC89遭受干旱脅迫時(shí)，CAT2基因的表達(dá)量提高，因此我們推測(cè)其在適應(yīng)干旱條件有著重要作用。

紫外脅迫能夠引起CAT基因表達(dá)量的變化。在N. plumbaginifolia L.上的研究表明3種CAT基因在受到55 MJ/m2強(qiáng)度的紫外線影響下，表達(dá)量變化是不一樣的，CAT1基因的表達(dá)量受到抑制，而CAT2和CAT3基因能夠誘導(dǎo)的表達(dá)[25-26]。而有研究表明在胡蘿卜中，CAT2基因在紫外處理6 h后能夠誘導(dǎo)表達(dá)[27]。反義表達(dá)CAT的轉(zhuǎn)基因煙草增強(qiáng)了煙草對(duì)光的敏感性，葉片在中等光強(qiáng)下即產(chǎn)生壞死斑，光合能力受到抑制[28]。本研究CAT2基因表達(dá)量變化，可推測(cè)在紫外光脅迫下可能引起NC89葉片光合作用的光失活，而CAT1基因表達(dá)受到光抑制，而此時(shí)NC89體內(nèi)H2O2的清除可能由CAT2基因發(fā)揮作用。

接種PVY處理提高了CAT2基因的相對(duì)表達(dá)量[29]。陳學(xué)平等[30]研究感染TMV煙草結(jié)果表明，抗病品種CAT活力值在處理后與感病品種相比明顯低;吳元華等[31]對(duì)感病煙草品種NC89接種PVY進(jìn)行研究，僅在接種后第2天CAT活性比對(duì)照略有升高，而后均比對(duì)照低，在第6天和第10天CAT活性降低的幅度較大。研究結(jié)果表明，敏感植株在接種病毒后前5 d CAT酶活性升高，隨后降低。而本研究中隨接種PVY時(shí)間的變化，NC89 CAT2基因的表達(dá)量先上升后下降，處于表達(dá)量上調(diào)的過(guò)程，從而推測(cè)其在抗PVY侵染過(guò)程中CAT2基因有著重要的作用。

4 ?結(jié) ?論

本研究對(duì)煙草NC89 CAT2基因初步進(jìn)行了定量實(shí)驗(yàn)，分析了其在不同器官的表達(dá)量及生物脅迫、非生物脅迫處理下的表達(dá)量差異。通過(guò)機(jī)械損傷、滲透壓、低溫、高溫、干旱、紫外因子和感染PVY等方法處理并檢測(cè)CAT2基因表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示生物脅迫與非生物脅迫均引起CAT2基因表達(dá)

量上調(diào);不同器官（花、葉、根、莖、種子）基因表達(dá)量有差異性，其中CAT2基因在花中的表達(dá)量最高，在根中的表達(dá)量最低。這暗示CAT2基因可能參與了應(yīng)對(duì)脅迫的過(guò)程，為深入地研究植物的抗逆機(jī)制及利用基因工程技術(shù)提高植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力和改善生態(tài)環(huán)境提供了重要理論依據(jù)。

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