宋曉培 宋文靜 蘆偉龍 等

摘 ?要：為研究不同硫酸鉀用量對(duì)植煙土壤微生物的影響，采用連續(xù)8年田間定位試驗(yàn)分析了土壤細(xì)菌群落多樣性。對(duì)各處理植煙土壤16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行高通量測序，得到各處理植煙土壤細(xì)菌群落的α多樣性指數(shù)、群落種類組成及豐度信息，并對(duì)群落組成及豐度進(jìn)行了PCA聚類分析及UPGMA聚類分析，將排名前十優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門與土壤pH、土壤酶活性、鉀和硫含量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明：（1）與空閑地相比，不施肥連年栽煙土壤細(xì)菌數(shù)量降低;而施肥處理中，K2O的投入量為247.57 kg/hm2，S的投入量為125.46 kg/hm2時(shí)，細(xì)菌群落豐度、多樣性和均勻度明顯增加。（2）不同處理的土壤中變形菌門、酸桿菌門和放線菌門均為優(yōu)勢(shì)菌群，隨著硫酸鉀施用量的增多，酸桿菌門相對(duì)含量明顯減少，而變形菌門與放線菌門均呈不同程度增加趨勢(shì)。（3）細(xì)菌群落相似性分析結(jié)果表明，長期施用硫酸鉀能顯著改變土壤群落組成。（4）相關(guān)性分析表明，土壤pH、土壤蔗糖酶、脲酶活性、鉀和硫含量對(duì)于該地區(qū)土壤細(xì)菌群落的豐度、多樣性及優(yōu)勢(shì)種群相對(duì)豐度起著重要作用。

關(guān)鍵詞：硫酸鉀;烤煙;土壤;細(xì)菌群落多樣性

中圖分類號(hào)：S572.01 ?????????文章編號(hào)：1007-5119（2019）01-0033-08 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.005

Abstract： To study the effects of different potassium sulfate dosages on the bacterial community diversity of tobacco planting soils， soil bacterial community diversity was analyzed by consecutive field experiment for 8 years. High-throughput sequencing of the 16S rRNA V3-V4 region of each treated tobacco planting soil was carried out， and α diversity index， community species composition and abundance information of the bacterial communities were obtained. The community composition and abundance were analyzed by PCA cluster analysis and UPGMA cluster analysis. The correlations between the top ten dominant bacteria and soil pH， soil enzyme activity， potassium and sulfur content were analyzed. The results showed that： （1） Compared with the natural vegetation， the amount of bacteria of CK was reduced. In the fertilization treatments， the abundance， diversity and uniformity of the bacterial community increased significantly when the input of K2O was 247.57 kg/ha， and the input of S was 125.4 kg/ha. （2） Proteobacteria， Acidobacteria and Actinobacteria were the dominant bacteria in all treated planting soils of this experiment， and with the increase of potassium sulfate application， the relative content of the Acidobacteria was significantly reduced， while Proteobacteria and Actinobacteria increased in different degrees. （3） The results of bacterial community similarity analysis for each treatment showed that long-term application of potassium sulfate could significantly change the soil bacterial community composition. （4） Correlation analysis showed that soil pH， soil sucrase activity and urease activities， the content of potassium and sulfur played an important role in the abundance， diversity and relative abundance of soil bacterial communities in the region.

Keywords： potassium sulfate; flue-cured tobacco; soil; bacterial community diversity

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，時(shí)刻進(jìn)行著活躍的新陳代謝，在土壤有機(jī)質(zhì)分解、物質(zhì)轉(zhuǎn)化與能量傳遞等方面有著重要的作用[1-2]。土壤微生物群落對(duì)環(huán)境變化十分敏感，能通過對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析反映土壤質(zhì)量的變化。細(xì)菌作為土壤微生物重要的組成部分，對(duì)土壤養(yǎng)分的形成與分解有促進(jìn)作用[3-4]。已有大量研究證明，耕作方式與施肥措施對(duì)土壤微生物數(shù)量及活性有重要影響，能顯著提高土壤微生物的數(shù)量與活性[5]，從而有利于土壤質(zhì)量的維護(hù)[6]。靳振江等[7]研究表明添加有機(jī)質(zhì)對(duì)微生物豐度提高具有決定性的作用，因?yàn)橥寥烙袡C(jī)碳與土壤養(yǎng)分不但為微生物提供了豐富的可利用底物，而且發(fā)達(dá)的根系通過其穿插作用，改善了土壤結(jié)構(gòu)，為微生物的生存提供了良好的外部環(huán)境。王慧穎等[8]、周晶等[9]研究表明，與不施化肥相比，施用化肥會(huì)顯著降低土壤微生物的數(shù)量，這可能是由于長期施用化肥引起土壤pH下降，而土壤細(xì)菌群落與pH密切相關(guān)。

施肥可以改善根際土壤養(yǎng)分有效性和根際微生物區(qū)系，從而提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量[10]。硫酸鉀是煙草生產(chǎn)上最主要的鉀肥，施入土壤中使得煙葉和土壤中的鉀含量均提高的同時(shí)，硫含量也相應(yīng)地提高[11]，但土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化特征未深入研究。本研究以16S rRNA基因V3-V4區(qū)為分子標(biāo)靶，采用高通量測序技術(shù)，分析不同硫酸鉀用量下植煙土壤細(xì)菌群落組成及多樣性變化，以了解細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨硫酸鉀施用量的變化情況。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)地概況

田間定位試驗(yàn)始于2010年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院青島煙草資源與環(huán)境野外科學(xué)觀測試驗(yàn)站進(jìn)行，北緯36°26'54″，東經(jīng)120°34'38″，海拔 75 m。土壤類型為棕壤，2010年土壤測試結(jié)果為：pH 5.56，有機(jī)質(zhì)11.66 g/kg，堿解氮52.69 mg/kg，有效磷10.60 mg/kg，速效鉀105.25 mg/kg。

1.2 ?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理：NV（休閑地）;CK（不施肥，連年栽煙）;T1處理施用硫酸鉀型復(fù)合肥（N、P2O5、K2O和S的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15%、15%、15%和12%）550.5 kg/hm2;T2處理在處理T1基礎(chǔ)上增施硫酸鉀（含K2O和S分別為50%和18%）165 kg/hm2;T3處理在T1基礎(chǔ)上增施硫酸鉀330 kg/hm2。各試驗(yàn)處理的養(yǎng)分施用量見表1。

每個(gè)處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。小區(qū)長5 m，寬4.4 m，行距1.1 m，株距0.5 m，栽煙40株。供試烤煙品種為NC89，每年6月上旬移栽，肥料于起壟時(shí)一次性條施。2017年8月29日烤煙成熟期，采用五點(diǎn)取樣法，在每個(gè)小區(qū)采集0～20 cm土壤，混勻后進(jìn)行土壤細(xì)菌群落的測定與分析，測定土壤蔗糖酶、土壤脲酶和土壤酸性磷酸酶活性，同時(shí)將土壤樣品風(fēng)干研磨過2 mm篩及0.15 mm篩后測定pH及鉀和硫含量。

1.3 ?方法

1.3.1 ?土壤pH、土壤酶活性以及鉀和硫含量的測定 ?土壤pH采用電位法[m水∶m土=2.5∶1];蔗糖酶活性用3，5-二硝基水楊酸比色法，土壤脲酶活性用靛酚藍(lán)比色法，土壤酸性磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法;有效硫采用磷酸鹽浸提-硫酸鋇比濁法;全硫采用酸消化-硫酸鋇比濁法測定;速效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度法;全鉀采用氫氧化鈉熔融-火焰光度法。

1.3.2 ?土壤微生物基因組DNA的提取 ?使用E.Z.N.A.TM（Omega Bio-Tek，USA）試劑盒提取土壤微生物基因組DNA（gDNA）。然后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

1.3.3 ?土壤細(xì)菌16S rRNA PCR擴(kuò)增 ?PCR采用

TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，每個(gè)樣品3次重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫;2%瓊脂糖電泳檢測。引物序列：338F（ACTCCTACGGGAGG CAGCAG）;806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。PCR反應(yīng)體系見表2。

參照電泳初步定量結(jié)果，PCR產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測定量，之后按照每個(gè)樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。檢測合格的文庫采用Illumina miseq對(duì)16S rRNA基因序列的V3-V4區(qū)進(jìn)行高通量測序。

1.4 ?數(shù)據(jù)處理

利用軟件QIIME在97%相似度下聚類OTU和分析Alpha多樣性指數(shù)（Chao1、Shannon、goods_coverage、observed_species），并進(jìn)一步分析稀釋曲線，利用R語言工具制作曲線圖;同時(shí)基于每個(gè)樣品OTU的組成，利用R語言進(jìn)行PCA、Venn統(tǒng)計(jì)分析和作圖;采用RDP Classifier算法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行比對(duì)分析，所選擇的數(shù)據(jù)庫為Silva、RDP及Greengene，數(shù)據(jù)庫主要包含16S細(xì)菌核糖體數(shù)據(jù)庫;使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法及R語言作柱狀圖分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu);基于Unweighted Unifrac距離矩陣，UPGMA方法聚類建樹，并將聚類結(jié)果與各樣品在門、綱、目、科、屬水平上的物種相對(duì)豐度整合展示。

其余試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel及SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，處理間差異采用Duncan多重比較方法，差異顯著性水平為0.05。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?不同處理土壤細(xì)菌α多樣性分析

各處理植煙土壤樣品測得16S rRNA V3～V4區(qū)原始序列數(shù)、質(zhì)控序列數(shù)、有效序列數(shù)、α多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)見表3。覆蓋率指數(shù)為0.97～0.98，說明制備的MiSeq文庫覆蓋了土壤樣品中97%～98%的細(xì)菌類群，庫容足夠大，能夠反映土壤樣品中細(xì)菌的真實(shí)組成。OTUs豐度稀釋性曲線（圖1）表明隨著讀數(shù)量的增加，曲線逐漸趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，通過PCR擴(kuò)增出的序列數(shù)可以反映各處理土壤中的細(xì)菌群落組成。

α多樣性可以反映微生物群落的豐度和多樣性，α多樣性越高，細(xì)菌種類越豐富，群落越穩(wěn)定。

Shannon指數(shù)評(píng)價(jià)物種群落組成的均勻度，observed_species和Chao1指數(shù)反映群落物種豐富度。各處理shannon指數(shù)為8.32～8.82，大小依次為CK<NV<T1<T2<T3;observed_species指數(shù)為 ??????1 604.06～1 789.74，大小依次為T1<T2<CK<NV <T3;Chao1指數(shù)為2 102.14～2 305.43，大小依次為T2<T1<NV<CK<T3。與NV、CK處理相比，處理T1、T2、T3的shannon指數(shù)均有一定程度提高，表明長期施肥能在一定程度上提高土壤細(xì)菌群落的多樣性;observed_species及chao1指數(shù)均有所下降，而處理T3上升，說明處理T1、T2土壤細(xì)菌數(shù)量降低，處理T3的土壤細(xì)菌數(shù)增多?？傮w來說，土壤中K2O的投入量為247.57 kg/hm2，S的投入量為125.46 kg/hm2時(shí)，土壤細(xì)菌的數(shù)量及多樣性均有所提高。

2.2 ?細(xì)菌OTUs分布

Venn圖能夠直觀的反映出不同土壤樣品中共有OTU以及差異OTU，進(jìn)而通過OTU信息來探索不同處理下細(xì)菌的響應(yīng)狀況。從圖2中可以看出，各處理土壤樣品一共有3626個(gè)細(xì)菌OTU，共有的OTU為1860個(gè)，每個(gè)處理的土壤樣品中均有數(shù)量不等的其他樣品沒有出現(xiàn)的OTU。NV特有菌種為67個(gè)，CK特有菌種為45個(gè)，T1特有菌種為6個(gè)，T2特有菌種有20個(gè)，T3特有菌種為60個(gè)，說明長期施肥改變了原有細(xì)菌群落，對(duì)煙田土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定程度的影響。施肥的處理中，隨著硫酸鉀施用量的增多，特有菌種數(shù)逐漸提高，即不同硫酸鉀用量對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響不一致。

2.3 ?細(xì)菌群落種類組成及豐度

對(duì)不同樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門的分析表明（圖3），不同硫酸鉀施用量植煙土壤相對(duì)豐度排名前十的

細(xì)菌門分別是變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、浮霉菌門（Planctomycetes）。這些細(xì)菌門類的相對(duì)比例占各樣品總序列數(shù)的94.94%～96.48%。不同硫酸鉀用量處理細(xì)菌群落組成整體變化不大，但不同門的細(xì)菌數(shù)量均有變化，比如，T3處理變形菌門、放線菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門所占比例明顯升高，而酸桿菌門、綠彎菌門所占比例減少。

2.4 ?細(xì)菌群落相似性分析

PCA分析結(jié)果表明（圖4），第一主成分可以解釋23.21%的微生物組成成分，第二主成分可以解釋18.87%的微生物組成成分?？傮w來說，NV在PC1的負(fù)半軸，而其他處理在PC1的正半軸，說明CK、T1、T2和T3處理中微生物群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生了一定程度的改變;而CK、T1均分布在PC2的負(fù)半軸，T2橫跨PC2的正負(fù)半軸，T3分布在PC2的正半軸，說明在施用鉀肥的3個(gè)處理中，T3處理發(fā)生顯著變化，表明此處理鉀肥用量在一定程度上改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。UPGMA聚類分析表明（圖5），除個(gè)別樣品外，主要分為兩大類，即施肥處理（T1、T2、T3）與不施肥處理（NV、CK），說明施用化肥后各菌群豐度發(fā)生了明顯變化;T1、T2處理被聚為1個(gè)分支，T3處理單獨(dú)一個(gè)分支，說明T1與T2處理菌群豐度相似性較T3處理更高。說明不同

硫酸鉀用量對(duì)植煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同影響。與PCA聚類分析結(jié)果相一致，當(dāng)K2O的投入量為247.57 kg/hm2，S的投入量為125.46 kg/hm2時(shí)，對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響最大。

2.5 ?土壤pH、土壤酶活性、鉀和硫含量與優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度的相關(guān)關(guān)系

對(duì)不同處理土壤pH、土壤酶活性、鉀和硫的含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明（表4），與休閑地相比，不施肥、連年栽煙及施用化肥均能顯著降低土壤pH，且施用化肥的處理中，隨著硫酸鉀施用量增多，pH下降幅度增大。由表4可知，肥料的施入均在不同程度上提高了土壤蔗糖酶、脲酶以及酸性磷酸酶的活性、土壤有效硫、全硫、速效鉀及全鉀的含量，且不同硫酸鉀用量作用不一致，T3處理即K2O的投入量為247.57 kg/hm2，S的投入量為125.46 kg/hm2時(shí)，提高作用更為顯著。

將土壤pH、土壤酶活性、鉀和硫含量與前十優(yōu)勢(shì)菌門進(jìn)行了相關(guān)分析（表5），結(jié)果表明排名前三的優(yōu)勢(shì)菌門即變形菌門、酸桿菌門以及放線菌門與pH、土壤蔗糖酶活性、脲酶活性、鉀和硫的含量均存在顯著或者極顯著正（負(fù)）相關(guān)關(guān)系，初步推測硫酸鉀的施入引起土壤群落結(jié)構(gòu)的改變，可能是通過影響主要門類，改變了細(xì)菌群落之間的競爭關(guān)系，從而引起土壤微生物的改變。土壤pH還與芽單胞菌門、厚壁菌門及擬桿菌門存在極顯著或顯著顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與疣微菌門存在顯著正相關(guān)關(guān)系。蔗糖酶活性還與芽單胞菌門、厚壁菌門及擬桿菌門存在極顯著或顯著正相關(guān)關(guān)系。脲酶活性還與疣微菌門呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。有效硫還與芽單胞菌門及厚壁菌門存在顯著正相關(guān)關(guān)系，與疣微菌門存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。全硫還與疣微菌門存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與厚壁菌門存在正相關(guān)關(guān)系。速效鉀還與綠彎菌門存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與芽單胞菌門、厚壁菌門及擬桿菌門存在極顯著或顯著正相關(guān)關(guān)系。全鉀還與芽單胞菌門、厚壁菌門及擬桿菌門存在極顯著或顯著正相關(guān)關(guān)系。此外，土壤磷酸酶活性與任何優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門均無顯著相關(guān)性。

綜合分析，該研究中土壤細(xì)菌群落組成與土壤pH、土壤蔗糖酶脲酶活性、土壤中鉀和硫含量密切相關(guān)，而且硫酸鉀的施用可能通過影響主要優(yōu)勢(shì)菌門進(jìn)而影響土壤細(xì)菌群落組成。

3 ?討 ?論

研究結(jié)果表明，與休閑地相比，不施肥連年栽煙處理α多樣性指數(shù)、特有菌種數(shù)均有少許下降，即細(xì)菌群落的數(shù)量及多樣性均有所降低，這可能是因?yàn)閱我蛔魑锒嗄赀B續(xù)種植導(dǎo)致植物根系分泌物及植株殘?bào)w隨種植年限逐年累積，造成土壤微生物區(qū)系紊亂，這與郭麗麗等[12]，納小凡等[13]，李倩等[14]研究結(jié)果一致。而施肥的處理中，T1、T2處理土壤細(xì)菌數(shù)量降低，但多樣性有所增加，這可能是因?yàn)榱蛩徕浄实妮斎胂鄬?duì)較少，影響了對(duì)這些養(yǎng)分需求量較大的細(xì)菌的代謝活動(dòng)，從而抑制其生長;T3處理的α多樣性指數(shù)均有所增加，即K2O的投入量為247.57 kg/hm2，S的投入量為125.46 kg/hm2時(shí)，土壤中養(yǎng)分的輸入達(dá)到相對(duì)均衡狀態(tài)，能為各類細(xì)菌的生長和代謝提供能量，使得細(xì)菌的均勻度與多樣性指數(shù)均提高。

研究表明，酸桿菌門在自然界中的各種環(huán)境中都廣泛存在，有豐富的遺傳多樣性和代謝多樣性[15]，具有降解植物殘?bào)w多聚物、參與單碳化合物代謝等功能[16]，對(duì)生態(tài)的穩(wěn)定性有很大的貢獻(xiàn)。大多數(shù)的硫氧化菌屬于變形菌門[17]。放線菌門大部分是腐生菌，在土壤中主要分解動(dòng)物及植物有機(jī)殘?bào)w[18]。對(duì)不同處理中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門的分析表明，不同硫酸鉀用量植煙土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)組成變化較小，且隨著硫酸鉀施用量的增多，酸桿菌門呈下降趨勢(shì)，變形菌門、放線菌門呈增加趨勢(shì)。

土壤的全硫和全鉀含量可以反映出土壤的供硫和供鉀潛力，有效硫與速效鉀是植物可以直接吸收利用的硫和鉀形態(tài)，反映出土壤的供硫和供鉀水平。硫酸鉀肥的施入增加了土壤供鉀供硫的潛力及水平，且硫酸鉀施用量越多，增加作用越明顯。這與張繼光等[11]研究結(jié)果相一致。已有研究表明，土壤類型、土壤理化特征、環(huán)境因子以及植物類型均能在不同程度上影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[19-20]。其中，土壤pH被認(rèn)為是預(yù)測土壤微生物群落演替規(guī)律的最佳因子之一，并顯著影響土壤細(xì)菌群落多樣性[14，20-21]。酸桿菌門是嗜酸菌，酸性活動(dòng)有利于其代謝活動(dòng)，其主要功能是降解植物殘?bào)w[12，15]。在本研究中，隨著硫酸鉀施用量的增多，土壤pH呈下降趨勢(shì)，而酸桿菌門與土壤pH呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，即隨著土壤pH的降低，酸桿菌門的相對(duì)豐度呈降低趨勢(shì)，這與丁新景等[4]研究結(jié)果不一致，而與趙牧秋等[22]研究結(jié)果一致，說明酸桿菌門的分布除受pH影響外，還受到其他土壤因子的影響。相對(duì)豐度分析可知，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門在各處理中的相對(duì)豐度分別為22.91%～40.76%、14.91%～39.78%、10.14～20.44%，是相對(duì)豐度排名前三的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門。土壤酶是具有加速土壤生化反應(yīng)速率功能的蛋白質(zhì)，酶的活性可以反映土壤養(yǎng)分（氮、磷、碳等）轉(zhuǎn)化能力和土壤微生物活性[8，21]。土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶為土壤中與碳、氮、磷養(yǎng)分循環(huán)相關(guān)的主要酶類。相關(guān)性分析表明，蔗糖酶、脲酶活性對(duì)各處理細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)種群相對(duì)豐度起著重要作用。

4 ?結(jié) ?論

研究表明，K2O的投入量為247.57 kg/hm2，S的投入量為125.46 kg/hm2時(shí)，細(xì)菌群落豐度、多樣性和均勻度明顯增加。對(duì)各處理進(jìn)行細(xì)菌群落相似性分析，發(fā)現(xiàn)長期施用硫酸鉀肥能明顯改變土壤群落結(jié)構(gòu)，而且硫酸鉀用量與土壤細(xì)菌群落密切相關(guān)。

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