楊勇 首坤秀 李立郎 楊艷 楊小生 楊娟

摘 要：為了探究平菇多糖的提取工藝，本試驗(yàn)選用甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶作為提取平菇多糖的復(fù)合酶，通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶用量，采用響應(yīng)面優(yōu)化法考察液料比、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值四個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響。結(jié)果顯示，復(fù)合酶的最佳用量分別為甘露聚糖酶400 U/g，木瓜蛋白酶240 U/g，纖維素酶600 U/g，最佳提取工藝條件為液料比21∶1 （mL/g），酶解溫度 52.0℃，酶解時(shí)間3.1 h，pH值5.7驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖提取率為5.90%，純度60.91%;相比之下，熱水浸提法多糖提取率為5.72%，純度59.71%。因此，復(fù)合酶法提取可作為一種平菇多糖適宜的提取方法。

關(guān)鍵詞：多糖;復(fù)合酶;正交設(shè)計(jì);響應(yīng)面優(yōu)化法

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）01-0029-06 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.01.006

平菇為一種大型食用真菌，又名北風(fēng)菌、蠔菌等，我國(guó)平菇的栽培量位居世界第二[1]。常食平菇不僅能起到改善人體的新陳代謝，調(diào)節(jié)植物神經(jīng)元的作用，而且對(duì)降低血壓、減少人體血清膽固醇和防治高血壓、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、肝炎等有明顯的效果[2-3]。

來(lái)源于平菇中的平菇多糖，含量普遍高于天然植物，產(chǎn)量豐富、毒副作用小，受眾多研究者所青睞。在平菇營(yíng)養(yǎng)成分中，以干重為基礎(chǔ)，水分占9.03%～18.28%，粗蛋白占4.0%～35.97%，粗脂肪占1.9%～16.38%，總糖占16.76%～52.1%，粗纖維占3.7%～28.4%[4]。平菇多糖具有抗凝、抗細(xì)菌和抗病毒的作用，維護(hù)正常的肝功能以及提高肝臟解毒能力，提高動(dòng)物耐缺氧能力和對(duì)氧的利用率，降低血液粘稠度，改善心律，增加心肌收縮力，還具有降低血糖、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、止咳、化痰、平喘的功效[5]。在醫(yī)療領(lǐng)域，平菇多糖主要用來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移，提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，改善患者的身體狀況，其在治療肺癌、胃癌、結(jié)腸癌等方面具有良好療效[6]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)平菇蛋白多糖體對(duì)癌細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[7-8]。

由于平菇的活性成分主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，常規(guī)溶劑提取，需要克服來(lái)自細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的傳質(zhì)阻力，才能溶解活性成分達(dá)到提取的目的。酶解法作為一種高效的提取方法，具有能耗低，提取時(shí)間短，保護(hù)目標(biāo)產(chǎn)物免受破壞，優(yōu)化有效組分，簡(jiǎn)化工藝等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于活性成分的提取。以纖維素酶、半纖維素酶和蛋白酶等酶類作為高效催化劑，利用其專一性提取其活性成分，得到產(chǎn)物穩(wěn)定、純度高、活性好?；诖?，本試驗(yàn)運(yùn)用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化復(fù)合酶用量，同時(shí)通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件，以期為相關(guān)藥食同源的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平菇（以藥渣作為培養(yǎng)基質(zhì)栽培出菇，貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）;透析袋（分子截留量 14000，上海綠鳥(niǎo)科技發(fā)展有限公司）;纖維素酶（50000 U/g，上海源葉生物科技有限公司）、甘露聚糖酶（50000 U/g，上海源葉生物科技有限公司），木瓜蛋白酶（200000 U/g，天津利華酶制劑技術(shù)有限公司），磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、葡萄糖、正丁醇、氯仿、濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TCL-16B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），XP-200高速中藥粉碎機(jī)（吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠），GZX-9023電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），SY2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），SHB-B88真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），DK-98-11恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司），AG285梅特勒-托利電子分析天平（Mettler Toledo公司），UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津儀器（蘇州）有限公司），SH2-88水浴恒溫振蕩器（太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），Millipore-0026型超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合酶法提取平菇多糖工藝流程

平菇→洗凈→晾干、烘干→打粉→稱取適量的樣品烘干至恒重→按20∶1（mL/g）的液料比加入復(fù)合酶的磷酸鹽緩沖溶液→在一定溫度下水浴恒溫酶解一定時(shí)間→然后置于沸水浴中滅酶10 min→抽濾，離心，取上清液減壓濃縮至一定體積→加Sevage試劑脫蛋白[9]，混合，振蕩，離心→取上清液透析36 h→減壓濃縮至一定的體積，加入一定量的乙醇，使溶液中乙醇終濃度達(dá)到80%→4℃靜置過(guò)夜，抽濾，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀3次→把沉淀轉(zhuǎn)移至事先稱重的干燥瓶中→60℃真空干燥至恒重，稱重→計(jì)算平菇多糖提取率[10]。

1.3.2 復(fù)合酶用量的確定

1.3.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

平菇干粉17份，每份5 g，減壓干燥至恒重，以三種不同的酶分別作為三個(gè)單因素，分別將不同用量的甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶，用100 mL NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液溶解，攪拌，加入底物（平菇干粉）中，在一定溫度下，酶解2 h，進(jìn)行復(fù)合酶用量單因素考察。

1.3.2.2 復(fù)合酶用量正交試驗(yàn)優(yōu)化 在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以甘露聚糖酶用量（A）、木瓜蛋白酶用量（B）、纖維素酶用量（C）分別為三個(gè)因素，采用L9（33）正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以平菇多糖提取率為指標(biāo)，確定復(fù)合酶的最佳用量。

1.3.3 復(fù)合酶法提取條件的優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗(yàn) 在其他條件相同的前提下分別研究液料比、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值對(duì)平菇多糖提取得率的影響（因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1）。

1.3.3.2 響應(yīng)面分析

采用響應(yīng)面優(yōu)化法[11]設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察液料比、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH 值4個(gè)對(duì)多糖提取率影響顯著的因素，以平菇多糖提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，因素水平表見(jiàn)表1。

1.3.3.3 多糖含量測(cè)定 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量[12-13]。

1.3.3.4 多糖純度與提取率的計(jì)算公式

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶用量的確定

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

甘露聚糖酶用量（A）的最佳選擇梯度范圍為200～600 U/g;木瓜蛋白酶用量（B）的最佳選擇的梯度范圍為200～280 U/g;纖維素酶用量（C）的最佳選擇的梯度范圍為400～800 U/g。

2.1.2 復(fù)合酶用量正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 從正交試驗(yàn)結(jié)果（表2）得出，三種因素影響多糖提取率的大小分別為B> C > A，即木瓜蛋白酶>纖維素酶>甘露聚糖酶，復(fù)合酶最佳酶用量組合為：A2B2C2，即甘露聚糖酶400 U/g，木瓜蛋白酶240 U/g，纖維素酶600 U/g。以正交設(shè)計(jì)優(yōu)化的復(fù)合酶用量為參照，經(jīng)4組平行試驗(yàn)，驗(yàn)證得平菇多糖提取率為5.66%，大于復(fù)合酶用量單因素考察時(shí)，平菇多糖提取率最大值5.37%。

2.2 復(fù)合酶法提取最優(yōu)條件的確定

2.2.1 單因素試驗(yàn)的結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法篩選的液料比梯度范圍為15～25 mL/g;應(yīng)用響應(yīng)面法篩選的溫度梯度范圍為40～60℃;應(yīng)用響應(yīng)面篩選的酶解時(shí)間梯度范圍為2.0～4.0 h;應(yīng)用響應(yīng)面篩選的pH值梯度范圍為4.5～6.5。因素水平見(jiàn)表1。

2.2.2 響應(yīng)面分析的結(jié)果 采用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合后，得到回歸方程：

Y= -63.94323 + 0.59007A + 1.26718B + 5.28534C + 7.90087D + 2.04226×10-3AB + 2.91752×10-3AC + 2.1752×10-2AD - 1.5566×10-2BC + 1.08945×10-2BD - 0.12538CD - 1.9919×10-2A2 - 1.2185×10-2B2 -0.61698C2 - 0.70348D2，該方程R2=0.9868，表明方程的可信度較好，能夠分析和預(yù)測(cè)多糖的提取工藝[14-16]。

由表4回歸分析的結(jié)果表明，該模型的F值為80.35，表示其能達(dá)到極顯著差異（P<0.001），說(shuō)明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與純誤差正相關(guān)的失擬項(xiàng)的F值為2.82，不顯著（P>0.05），說(shuō)明本方法與實(shí)際試驗(yàn)差異較小，擬合程度較好，預(yù)測(cè)值能符合實(shí)際檢驗(yàn)結(jié)果?；貧w方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果還表明，酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）、pH值（D）一次項(xiàng)式能達(dá)到極顯著水平（P<0.001），而液料比（A）一次項(xiàng)式僅達(dá)到非常顯著水平（0.001<P<0.01），說(shuō)明B、C、D三個(gè)因素對(duì)多糖提取率有極顯著影響，而A對(duì)多糖提取率有高度顯著影響。根據(jù)F值判斷，四個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響程度為：B > D > C > A。此外，B與C交互項(xiàng)能達(dá)到顯著水平（P < 0.05），說(shuō)明酶解溫度與酶解時(shí)間之間交聯(lián)影響顯著。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件為液料比20.82∶1（mL/g）、酶解溫度52.01℃、酶解時(shí)間3.10 h、pH值5.70，綜合實(shí)驗(yàn)室設(shè)備精度情況，將優(yōu)化提取條件修正為液料比21∶1（mL/g），酶解溫度52.0℃，酶解時(shí)間3.1 h，pH值5.7。在該條件下平行測(cè)定5次，多糖提取率為5.90%，大于未優(yōu)化提取條件（液料比20∶1（mL/g）、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間2.0 h、pH值5.5）的測(cè)定結(jié)果5.66%。因此，證明本方法首先通過(guò)正交優(yōu)化復(fù)合酶的適宜用量，其次通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝條件，能提高平菇多糖的提取率。

2.2.4 復(fù)合酶法與熱水浸提法多糖提取率比較

與熱水浸提法提取平菇多糖[17]對(duì)比，同樣平行操作5次，計(jì)算多糖純度與提取率。與此同時(shí)，以不加酶且在優(yōu)化的最佳條件下，提取平菇多糖的對(duì)照組作為空白對(duì)照組。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（見(jiàn)表5），前兩種提取方法的多糖提取率均遠(yuǎn)大于空白對(duì)照組，前兩組多糖提取率接近。三組多糖純度接近，但在溫和的提取條件下得到多糖純度更高，盡管純度數(shù)值上相差不大，但熱水浸提得到的粗多糖與另外兩組在色澤上有明顯差異，顏色太深會(huì)干擾多糖定量分析的最終結(jié)果，造成較大實(shí)驗(yàn)誤差。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化離散型變量，即篩選復(fù)合酶的適宜用量，結(jié)果顯示，三種酶分別影響平菇多糖提取率的大小為：木瓜蛋白酶>纖維素酶>甘露聚糖酶，最佳復(fù)合酶用量為甘露聚糖酶400 U/g，木瓜蛋白酶240 U/g，纖維素酶600 U/g。其次通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化連續(xù)型變量，即提取條件工藝參數(shù)，并考察各個(gè)因素（提取條件）對(duì)多糖提取率的影響，探究平菇多糖的最佳提取工藝條件，運(yùn)用響應(yīng)面法構(gòu)建了各個(gè)條件對(duì)平菇多糖提取率影響程度的模型，發(fā)現(xiàn)液料比、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值均對(duì)平菇多糖的提取有顯著影響，影響高低程度依次為：酶解溫度>pH值>酶解時(shí)間>液料比，響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果經(jīng)修正，最佳提取工藝條件為液料比21 mL/g，酶解溫度52.0℃，酶解時(shí)間3.1 h，pH值5.7，經(jīng)驗(yàn)證，該條件下多糖提取率為5.90%，高于熱水浸提組和空白對(duì)照組。盡管這兩者多糖提取率值接近，但綜合考慮能耗和產(chǎn)物純度方面，復(fù)合酶提取方法相對(duì)較優(yōu)，可作為一種平菇多糖適宜的提取方法。

平菇中含有大量的多糖，比如纖維素、半纖維素、幾丁質(zhì)等，由于這些多糖難于降解，當(dāng)前對(duì)平菇多糖的利用率仍然處于較低水平。因此，本試驗(yàn)通過(guò)正交設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化的平菇多糖提取工藝，能提高平菇多糖的提取率與純度，以滿足高精度分析定量的要求，為更好地開(kāi)發(fā)平菇的藥用價(jià)值和評(píng)估平菇對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)中碳源的利用程度，提供一定的理論依據(jù)。

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