劉丹 梁丹 王建賀 王從磊 崔燕嬌 時(shí)曉偉 馮剛 劉正理

關(guān)鍵詞：小麥;祖先種;油菜素內(nèi)酯;BESl/BZRl;序列分析

中圖分類號(hào)：$512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-4440（2019）01-0238-03

高溫、凍害、土壤鹽漬化等非生物脅迫已經(jīng)成為小麥穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要限制因素。解決這一問(wèn)題的根本途徑在于培育抗逆性強(qiáng)的小麥新品種，并在生產(chǎn)上進(jìn)行大面積應(yīng)用，而挖掘和利用與抗逆性密切相關(guān)的關(guān)鍵基因能夠?yàn)榕嘤鼓嫘詮?qiáng)的小麥品種提供重要的基因資源，因而與抗逆性相關(guān)的信號(hào)通路及信號(hào)通路上的關(guān)鍵基因的功能及序列特征的解析業(yè)已成為研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)。油菜素內(nèi)酯（BR）被稱為植物的第六大激素，其類似物在細(xì)胞伸長(zhǎng)與分裂、維管束分化、葉片形態(tài)發(fā)生、植物育性、衰老及抗逆性中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。外施油菜素內(nèi)酯可以提升植物對(duì)鹽脅迫的抵御能力。擬南芥中的研究結(jié)果表明，BESl/BZRl是油菜素內(nèi)酯（BR）信號(hào)通路上的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其活性高低決定著BR信號(hào)通路的開(kāi)放與關(guān)閉。在棉花中，BESl/BZRl的表達(dá)受到了干旱的誘導(dǎo)：水稻中過(guò)表達(dá)擬南芥BESl/BZRl基因的轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽能力明顯提升，表明BESl/BZRl與植物抵御非生物脅迫的生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)，并起到了正向調(diào)控的作用。在小麥中目前尚未見(jiàn)對(duì)該基因的克隆及序列分析等相關(guān)研究的報(bào)道。

小麥為異源六倍體作物，基因組信息龐大，基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在著多種基因形態(tài)，而基因形態(tài)在不同品種中的差異又為基因的標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供了可能。如通過(guò)單倍型及關(guān)聯(lián)分析的方式挖掘優(yōu)異等位基因，為基因在育種中的直接利用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究通過(guò)在六倍體小麥、小麥祖先種中分離TaBESl/BZRl基因，并對(duì)該基因進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析，研究該基因的序列特征，為以后該基因功能研究及育種利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1小麥材料

所用小麥材料為滄麥119（六倍體冬小麥）、遼春10號(hào)（六倍體春小麥）、3份烏拉爾圖小麥（Triticum urartu，AA，2n=2x=14），2份粗山羊草（Aegilops tauschii，DD，2n=2x=14），上述材料由天津市農(nóng)作物研究所提供。滄麥119和遼春10號(hào)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，冬、春性不同，地理來(lái)源不同，耐鹽、抗旱、抗凍能力存在較大差異。

生長(zhǎng)條件：在生長(zhǎng)箱中，采用12 h光照，12 h黑暗，28℃，4 500 k育苗，種子萌發(fā)至一葉一心時(shí)，部分植株用于DNA提取，另一部分植株4℃處理1 h，迅速取葉片及根系于2.0 m1的離心管中，-80℃貯存，待提取RNA用。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA第一鏈的合成

采用天根生化科技有限公司的植物DNA提取試劑盒（DP321）和多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）分別進(jìn)行DNA和RNA提取，采用rI’11errn0的ReveaAid Strand cD-NA Sythesis Kit進(jìn)行cDNA合成。DNA、RNA及cDNA提取后儲(chǔ)存20℃冰箱中，待使用。

1.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

以擬南芥、玉米中公布的BESl/BZRl序列為參照，利用項(xiàng)目組構(gòu)建的本地序列比對(duì)系統(tǒng)中對(duì)A、D基因組（A基因組：http：//gigadb.org/dataset/100050;D基因組：http：//gigadb.org/dataset/10～54）進(jìn)行序列比對(duì)，搜尋小麥中BESl/BZRl的序列：通過(guò)小麥祖先種的BESl/BZRl序列信息，采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)克隆引物，TaBESl/BZRl一F：5'-AGGAGCAGGGGAGCTAGCATG-3’：TaBESl/BZRl一R：5’一CATTYGTGAGTGCCAGTGCAAT-3’，用于分離基因組序列及編碼區(qū)序列。

采用15ul體系，L=53℃，以小麥材料的DNA為模板進(jìn)行基因組擴(kuò)增，所用高保真酶為TransStart FastPfu DNAPolymerase。

1.4測(cè)序

將上述PCR產(chǎn)物，采用1.2%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收，與Blunt載體連接，通過(guò)熱擊法轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，挑取12個(gè)單克隆，送至中科希林生物科技有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.5生物信息學(xué)分析

使用以下網(wǎng)站及本地軟件進(jìn)行系列生物信息學(xué)分析?；蚪Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/：氨基酸序列比對(duì)：DNAman;進(jìn)化分析：MAGE 7.0。

2結(jié)果與克隆

2.1 TaBESl/BZRl的克隆

在滄麥119的cDNA中分離得到長(zhǎng)為942 bp的編碼區(qū)序列，在滄麥119及遼春10號(hào)的基因組中分離得到長(zhǎng)度為1 087 bp的基因組序列。該基因存在2個(gè)外顯子及1個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子占該基因序列的13.34%，位于256-402 bp處。

2.2 TaBESl/BZRl結(jié)構(gòu)特性分析

通過(guò)對(duì)滄麥1 19中cDNA克隆序列進(jìn)行手動(dòng)六框翻譯，得到了1條長(zhǎng)度為313個(gè)氨基酸殘基的片段。通過(guò)NCBI上公布的部分BESl/BZRl序列信息及潛在的序列信息進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，并通過(guò)MEGA 7.0構(gòu)建N_1進(jìn)化樹。結(jié)果表明，小麥的氨基酸序列與大麥、二穗短柄草及水稻的BESl/BZRl的氨基酸序列聚成1類，因此命名此序列為TaBESl/BZRl。氨基酸結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，在該氨基酸的N端具有DUF822結(jié)構(gòu)域，為典型的BESl/BZRl轉(zhuǎn)錄因子所具有的保守結(jié)構(gòu)域，與大豆、高梁、谷子中的BESl/BZRl氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，DUF822結(jié)構(gòu)域的前端在大豆、高粱、谷子和小麥中高度一致。

2.3祖先種中TaBESl/BZRl序列分析

在小麥祖先種A、D基因組的供體3份烏拉爾圖小麥（Triticum urartu，AA），2份粗山羊草（Aegilops tauschii，DD）中進(jìn)行TaBESl/BZRl的克隆。測(cè)序結(jié)果表明，在上述5個(gè)祖先種中，每種材料僅得到1種序列，其中A基因組的3個(gè)供體中每個(gè)材料的序列都存在差異，但差異不大，而D基因組的2個(gè)供體的序列一致。

2.4 TaBESl/BZRl同源基因查找

通過(guò)將氨基酸的保守結(jié)構(gòu)進(jìn)行提取，并結(jié)合Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行查找發(fā)現(xiàn)，具有與DUF822結(jié)構(gòu)域相似性較高的序列一共有22條.其中有4條與TaBESl/BZRl相似度超過(guò)90%。表明該基因位于小麥第二同源群的2AS、2BS、2DS上。

2.5 TaBESl/BZRl在滄麥119和遼春10號(hào)中的序列分析

經(jīng)過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在六倍體冬小麥滄麥119中得到5種序列，而在春小麥遼春10號(hào)中得到4種序列。分析結(jié)果表明，滄麥119的01序列和遼春10號(hào)的01序列一致率為100%，且與祖先種AA供體聚類在一組，說(shuō)明該序列來(lái)源于A基因組。遼春10號(hào)03序列和滄麥119的03、05號(hào)序列相似度較高，且來(lái)源于D基因組。

3討論

植物通過(guò)多種信號(hào)通路參與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng).外施油菜素內(nèi)酯能夠提高小麥對(duì)鹽脅迫的抵御能力，說(shuō)明油菜素內(nèi)酯信號(hào)通路參與了小麥對(duì)非生物脅迫的反應(yīng)，而BESl/BZRl作為油菜素內(nèi)酯的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，控制著油菜素內(nèi)酯信號(hào)通路的開(kāi)放與關(guān)閉，暗示其在小麥抵御鹽脅迫中起著重要的作用。

祖先種中的序列分析結(jié)果表明，D基因組的2個(gè)供體材料中BESl/BZRl序列完全一致，而在3個(gè)A基因組的供體材料中序列都不相同，但差異不大。項(xiàng)目組研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是A基因組還是D基因組中序列信息顯示.A基因組供體的BESl/BZRl序列相似度在99.O%以上，而D基因組供體的BESl/BZRl序列相似度為97.2%。說(shuō)明該基因在A、D基因組上存在一定的差異.為設(shè)計(jì)基因組特異引物在六倍體中分離單一來(lái)源的BESl/BZRl基因組序列提供了可能。

從A、D祖先種的序列進(jìn)化分析結(jié)果可以看出，滄麥119和遼春10號(hào)的01序列一致，且來(lái)自于A基因組：滄麥119的03、05序列及遼春10號(hào)的03序列來(lái)源于D基因組.且在六倍體小麥中存在差異，這為該基因在D基因組上開(kāi)發(fā)標(biāo)記提供了可能。因此小麥BESI/BZRI在育種上的應(yīng)用具有較大價(jià)值，可通過(guò)進(jìn)行多種耐逆性狀的關(guān)聯(lián)分析深入研究該基因的功能，并將其開(kāi)發(fā)成可用的分子標(biāo)記，輔助育種選擇，加速育種進(jìn)程。