黃乾龍 管玉圣 歐陽杰 郭爽

摘要：【目的】明確重慶自育水稻骨干親本的稻瘟病抗性及其抗病基因分布情況，為高效選育抗稻瘟病水稻品種提供優(yōu)質(zhì)親本。【方法】采用病圃自然誘發(fā)和人工接種相結(jié)合的方法，對重慶地區(qū)自育的73份水稻骨干親本稻瘟病抗性進行鑒定，并利用Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh、Pib、Pita和Pi-km1 7個抗稻瘟病基因的分子標記對其基因型進行檢測以分析抗病基因分布和聚合方式?！窘Y(jié)果】73份水稻親本中，田間稻瘟病抗性鑒定為高抗和抗病的親本（42份）占57.5%，攜帶抗病基因的水稻親本（49份）占67.1%，其中僅攜帶1個抗病基因的親本有18份，表型高抗的有1份，表型抗病的有7份，抗病比率44.4%;聚合2個抗病基因的親本有18份，表型高抗的有4份，表型抗病的有6份，抗病比率55.6%，聚合3個抗病基因的親本有9份，均表型抗病，抗病比率100.0%;聚合4個抗病基因的親本有4份，表型高抗的有2份，表型抗病的有2份，抗病比率100.0%;不攜帶檢測基因的親本（24份）占32.9%，其中表型高抗的有3份，表型抗病的有8份，抗病比率45.8%;抗病基因Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita在攜帶抗病基因的水稻骨干親本中分布頻率不同，分別為13.7%、31.5%、31.5%、37.0%和19.2%;未檢測出含抗病基因Pi9和Pi-km1的親本，也未檢測到同時攜帶抗病基因Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita的親本。不同水稻親本攜帶抗病基因不同及聚合方式不同，抗病表現(xiàn)均存在差異?！窘Y(jié)論】基因聚合可有效提高親本的抗病性，但基因聚合后抗病比率并非簡單地疊加，應從中篩選田間抗病較強的親本作為抗稻瘟病育種的候選親本。

關鍵詞： 水稻;骨干親本;稻瘟病;表型;抗病基因;抗性

中圖分類號： S511.035.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）01-0008-08

0 引言

【研究意義】由灰梨孢（Pyricularia grisea Sacc.）引起的稻瘟病是影響水稻（Oryza sativa L.）生產(chǎn)的主要病害之一，具有發(fā)生范圍廣、傳播快、流行頻率高、病原菌易變異等特點（孫國昌等，1998;陳利鋒和徐敬友，2005），嚴重威脅水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)（Skamnioti and Gurr，2009;Moyri et al.，2012）。近年來，隨著優(yōu)質(zhì)雜交稻在重慶地區(qū)的大面積推廣，感病品種隨之增多，加之菌源充足、氣候適宜稻瘟病發(fā)生等原因，稻瘟病已成為重慶地區(qū)水稻最主要的病害。生產(chǎn)實踐證明，選育和種植抗稻瘟病水稻品種是防治水稻稻瘟病最經(jīng)濟、有效、環(huán)保的措施（Dean et al.，2012;王麗麗等，2017），因此，開展重慶地區(qū)自育水稻骨干親本稻瘟病抗性評價及基因檢測對高效選育抗稻瘟病水稻品種及其安全、穩(wěn)定生產(chǎn)具有重要意義。【前人研究進展】雜交水稻品種的稻瘟病抗性受其親本稻瘟病抗性影響（黃富等，2007）。傳統(tǒng)育種方法是通過主導優(yōu)良品種與抗性親本雜交，再將雜交后代在稻瘟病病圃經(jīng)多代壓力選擇篩選出抗性品系，以實現(xiàn)抗稻瘟病品種選育。由于缺乏對抗源資源所攜帶抗稻瘟病基因（Pi）的了解，故在抗性親本選擇上目的性不強，對雜交后代的選擇效率也較低。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，分子標記可快速確定水稻中的抗病基因類型，并利用與之緊密連鎖的分子標記進行輔助選擇育種，可有效提高選擇效率。目前，已報道85個主效抗病基因主要分布在69個抗稻瘟病位點（Deng et al.，2017），其中25個抗病基因已被克隆。此外，大量科研人員利用不同抗稻瘟病基因的分子標記和病圃對水稻資源的稻瘟病抗性進行研究。冷禎陸（2011）、李建修（2012）利用稻瘟病病圃對四川水稻制恢資源的稻瘟病抗性進行評價，結(jié)果表明，69.5%的制恢資源表現(xiàn)為高抗稻瘟病，14.1%的制恢資源表現(xiàn)為中抗或抗稻瘟病。李進斌等（2012）利用Pita和Pib抗稻瘟病基因連鎖的SSR分子標記對云南地方稻種的抗稻瘟病基因型進行檢測，結(jié)果表明，Pita基因主要分布于玉溪、保山、臨滄、思茅等地區(qū)的稻種中，而Pib基因主要分布于滇西部的怒江和昭通地區(qū)的稻種中。宋廣樹等（2016）研究Piz-t、Pi-kh等10個抗稻瘟病基因在吉林主栽品種和優(yōu)良品系中的分布，結(jié)果表明，Pi2、Pi36、Pi37、Pi-kh、Piz-t和Pita基因在吉林省主要推廣水稻品種中分布較廣泛，而Pi9、Pib、Pi21和Pi-d2基因分布較少。張銀霞等（2016）利用Pita、Pi-kh等7個抗稻瘟病基因的SSR分子標記分析寧夏水稻品種的抗稻瘟病基因類型及數(shù)量，結(jié)果表明，寧夏水稻品種主要含有Pib、Pi-km和Pi9基因，缺乏Pi2和Pita基因。管玉圣等（2017）利用Pi2、Pi5等4個抗稻瘟病基因的SSR分子標記對重慶地區(qū)部分水稻親本材料的抗稻瘟病基因進行檢測，明確了Pi2、Pi5等4個抗稻瘟病基因的SSR分子標記對重慶部分親本材料篩選的有效性?！颈狙芯壳腥朦c】不同地區(qū)稻瘟病病原菌致病類型不同，且易變異。目前，針對重慶地區(qū)特定的病原菌種群，本課題組前期研究已明確了Pi2、Pi5、Pi9和Pi-kh 4個抗稻瘟病基因的SSR分子標記對重慶地區(qū)親本篩選的有效性和抗病基因在親本中的分布情況（管玉圣等，2017），但水稻攜帶抗病基因不同，則抗病性不同，且即使攜帶抗病基因也并不代表表型抗病。因此，有必要對重慶地區(qū)水稻親本的稻瘟病進行田間表型鑒定，輔以分子標記手段，根據(jù)抗病性和基因型制定育種策略，以保障水稻的安全、穩(wěn)定生產(chǎn)?！緮M解決的關鍵問題】以重慶地區(qū)自育的水稻骨干親本為材料，采用自然誘發(fā)和人工接種相結(jié)合的方式對其稻瘟?。ㄋ腩i瘟）進行田間抗病性評價，并利用抗性譜較廣的Pi2、Pi5等7個抗稻瘟病基因SSR分子標記檢測水稻骨干親本材料中攜帶的抗病基因類型和數(shù)量，以明確親本的稻瘟病表型、基因型及其分布、抗病基因不同聚合方式的抗病比率等，為合理利用親本稻瘟病抗性、高效選育抗稻瘟病水稻品種提供理論基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試水稻材料為重慶地區(qū)自育的73份水稻骨干親本，其中，制保親本（品種編碼2018-B01～2018-B46）46份和制恢親本（品種編碼2018-R01～2018-R27）27份。病圃穗頸瘟鑒定對照水稻品種為麗江新團黑谷。以上水稻材料均由重慶市農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所提供。稻瘟病病原菌單孢菌株ZA11和ZB11為近3年重慶地區(qū)流行且致病力強的致病菌，由重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學院分離、純化、鑒定及保存。主要試劑：DNA提取液、三氯甲烷（分析純）、冰乙醇（分析純）、70%（v/v）乙醇溶液、1×TE緩沖液、10 g/L瓊脂糖溶液和0.5×TBE緩沖液均由重慶市農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所提供;引物和PCR反應試劑盒購自TaKaRa公司。主要設備儀器：PCR擴增儀（SensQuest Labcycle）、Gel DOCTM XR+凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）、電泳儀（PowerPacTM）、電泳槽、高通量組織研磨器（Scientz.50）和水平搖床（WD-9405B型）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 稻瘟病菌培養(yǎng)與孢子懸浮液配制 參照付崇允等（2006）的方法，分別采用PDA培養(yǎng)基（去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、1000 mL蒸餾水）和大麥培養(yǎng)基（大麥∶高粱=3∶1）進行稻瘟病菌孢子培養(yǎng)和孢子擴大培養(yǎng)，供產(chǎn)孢備用。收集稻瘟病菌孢子時，先用滅菌水洗脫大麥高粱培養(yǎng)基上生長的稻瘟病菌孢子，再用3層滅菌紗布過濾洗脫液，濾去雜質(zhì)，最終將孢子懸浮液中的孢子濃度調(diào)整至2×105個/mL備用。孢子懸浮液現(xiàn)配現(xiàn)用。接種前等體積混合兩種病原菌孢子懸浮液，供田間噴霧接種。

1. 2. 2 稻瘟病抗性評價 試驗于2015─2017年在重慶市農(nóng)業(yè)科學院水稻所南川區(qū)河圖鄉(xiāng)的稻瘟病抗性鑒定圃（東經(jīng)107°27′，北緯29°30′，海拔680 m）進行，該地區(qū)為重慶市稻瘟病常發(fā)區(qū)，采用自然發(fā)病和人工接種誘發(fā)稻瘟病相結(jié)合的方法開展抗病性鑒定。試驗以每份水稻骨干親本為一小區(qū)，種植株行距16 cm×26 cm，每份親本2行，每行10株，共20株，各骨干親本間比法排列，每10份骨干親本種植2行麗江新團黑谷作為感病對照。病圃四周種植感病水稻3～6行，作為誘發(fā)行。于水稻孕穗期至破口期前數(shù)天，以背負式噴霧器對目標小區(qū)進行ZA11和ZB11菌株孢子懸浮液接種2～3次，每48 h接種1次。水稻整個生育期保持適量的水深，適當增施氮肥，根據(jù)病圃害蟲、雜草種類和程度使用殺蟲劑和除草劑，不使用任何殺菌劑，其他田間管理措施參照常規(guī)辦法。當感病對照品種麗江新團黑穗頸瘟充分發(fā)病時，對目標小區(qū)水稻骨干親本的穗頸瘟進行表型調(diào)查。分級標準參照楊秀娟等（2008）的病情指數(shù)平均值評判法（表1）。最后，計算抗病比率（表型高抗和抗病親本的比例）。

1. 2. 3 抗稻瘟病基因檢測 取水稻骨干親本分蘗期的嫩綠葉片3～5片，采用改良的CTAB法提取基因組DNA。利用抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh、Pib、Pita和Pik-m1的連鎖SSR分子標記引物（表2）進行PCR擴增。PCR反應體系10.0 μL：DNA模板 1.0 μL、1.0 μL 10×PCR緩沖液（含MgCl2）、10 mmol/L引物1.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL、5 U/mL Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補足至10.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物加入2.0 μL上樣緩沖液充分混勻后，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，取出后放入含溴化乙錠的0.5×TBE緩沖液染色3～5 min，最后用凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄結(jié)果。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2013對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 水稻骨干親本的穗頸瘟抗性田間鑒定結(jié)果

穗頸瘟田間表型鑒定結(jié)果如表3所示。雖然供試水稻骨干親本穗頸瘟表型不同年度間存在一定差異，但整體表型基本一致，在感病～高抗水平間均有分布。其中，高抗和抗病親本有42份，占供試親本總數(shù)的57.5%;中抗和中感親本各12份，均占16.4%;感病親本有7份，占9.6%。

2. 2 水稻骨干親本的基因型檢測結(jié)果

從基因型檢測結(jié)果（表4）可看出，攜帶抗病基因的水稻親本有49份，占供試親本總數(shù)的67.1%;不攜帶檢測基因的水稻親本有24份，占32.9%;抗病基因Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita在攜帶抗病基因的水稻骨干親本中分布頻率各不相同（圖1），分別為13.7%、31.5%、31.5%、37.0%和19.2%;未檢測出攜帶抗病基因Pi9和Pi-km1的親本。

將供試親本的穗頸瘟田間表現(xiàn)鑒定結(jié)果（表3）和基因型檢測結(jié)果（表4）進行綜合分析，結(jié)果表明，供試親本攜帶抗病基因不同及其聚合方式不同，抗病表現(xiàn)均存在差異。具體表現(xiàn)：僅攜帶Pi2基因的親本有1份，表型為抗病;僅攜帶Pi5基因的親本有4份，其中表型高抗的有1份，表型抗病的有2份，表型中抗的有1份;僅攜帶Pib基因的親本有4份，表型抗病的有2份，表型中抗和中感的各有1份，僅攜帶Pi-kh基因的親本有5份，表型抗病的有2份;表型中感的有1份，表型感病的有2份;僅攜帶Pita的親本有4份，表型中抗的有1份，表型中感的有2份，表型感病的有1份;攜帶Pi2+Pi-kh、Pi2+Pib、Pi-kh+Pita、Pi5+Pi-kh基因的親本各1份，其中前三者表型為抗病，后者表型為中感;攜帶Pi5+Pib基因的親本有7份，其中表型高抗的有2份，表型抗病的有2份，表型中抗的有3份;攜帶Pi5+Pita基因的親本有3份，表型高抗、中抗和感病的親本各1份;攜帶Pi-kh+Pib基因的親本有2份，表型高抗和中感各1份;攜帶Pib+Pita基因的親本2份，表型抗病和中感各1份;攜帶Pi2+Pi-kh+Pib和Pi5+Pi-kh+Pib基因的親本均有3份，均表型抗病;攜帶Pi-kh+Pib+Pita、Pi5+Pi-kh+Pita、Pi2+Pi5+Pi-kh基因的親本各1份，均表型抗病;攜帶Pi2+Pi5+Pi-kh+Pib基因的有2份，均表型高抗;攜帶Pi2+Pi-kh+Pib+Pita基因的親本有1份，均表型抗病;攜帶Pi5+Pi-kh+Pib+Pita基因有1份，表型為抗病。

2. 3 抗稻瘟病基因數(shù)量及聚合親本的抗病性分析結(jié)果

由表5可看知，不攜帶抗病基因的水稻親本有24份，其中表型高抗的有3份，表型抗病的有8份，抗病比率為45.8%;僅攜帶1個抗病基因的水稻親本有18份，其中表型高抗的有1份，表型抗病的有7份，抗病比率為44.4%;聚合2個抗病基因的水稻親本有18份，其中表型高抗的有4份，表型抗病的有6份，抗病比率為55.6%，聚合3個抗病基因的水稻親本有9份，均表型抗病，抗病比率為100.0%;聚合4個抗病基因的水稻親本有4份，其中表型高抗的有2份，表型抗病的有2份，抗病比率為100.0%。

從抗病比率分析結(jié)果（圖2）來看，僅攜帶一個抗病基因的供試親本中，攜帶Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita基因的親本分別有1、4、4、5和4份，抗病比率分別為100.0%、75.0%、40.0%、50.0%和0%;聚合2個抗病基因的供試親本中，攜帶Pi5+Pib基因的親本最多（7份），抗病比率達57.1%;以攜帶Pi2+Pib、Pi2+Pi-kh和Pi-kh+Pita的親本均有1份，抗病比率均為100.0%;在聚合3個抗病基因的供試親本中，攜帶Pi2+Pi-kh+Pib和Pi5+Pi-kh+Pib基因的親本均有3份，抗病比率均為100.0%;聚合4個抗病基因的供試親本有4份，分別是攜帶Pi2+Pi5+Pi-kh+Pib基因（2份）和Pi2+Pi-kh+Pib+Pita基因（2份），抗病比率均為100.0%;未檢測到同時攜帶5個抗病基因的親本。

3 討論

3. 1 抗稻瘟病基因在水稻親本中分布情況

選育與推廣種植抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟、有效、環(huán)保的措施（Dean et al.，2012;王麗麗等，2017），篩選抗稻瘟病水稻親本是其重要基礎工作。本研究對7個抗稻瘟病基因的SSR分子標記進行檢測發(fā)現(xiàn)，抗病基因Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita在攜帶抗病基因的親本中分布頻率不同，其中Pib基因的分布頻率最高（37.0%），其次是Pi5（31.5%）基因和Pi-kh（31.5%），Pi2的分布頻率最低（13.7%），未檢測出攜帶抗病基因Pi9和Pi-km1的親本，說明Pib基因可能廣泛存在于各類水稻材料中，與李進斌等（2012）、王麗麗等（2017）的研究結(jié)果相似，但Pi9作為抗譜較廣的抗稻瘟病基因，且與Pi2、Pi-kh基因同時被確認是西南稻區(qū)四川地區(qū)有效的抗稻瘟病基因（張雪梅，2011），在本研究供試水稻材料中尚未檢測出，推測是種質(zhì)的地域局限性所致，應加強含該抗病基因親本的引、育、選種工作。

3. 2 不同抗稻瘟病基因的抗病效應分析

已有研究證實，聚合多個抗稻瘟病基因有利于拓寬品種的抗譜，進而提高抗病性，可作為培育稻瘟病持久抗性的有效方法（張銀霞等，2016）。本研究以從重慶地區(qū)分離得到的稻瘟病病原菌主要優(yōu)勢生理小種ZA11和ZB11為致病菌，利用7個抗稻瘟病基因分子標記檢測73份水稻骨干親本的抗病基因型，并鑒定其田間穗頸瘟抗性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚合抗病基因Pi2+Pib、Pi2+Pi-kh和Pi-kh+Pita的親本和聚合3個及以上抗病基因的親本抗病比率均為100.0%，表明基因聚合可有效提高親本的抗病性，與張銀霞等（2016）的研究結(jié)果相似。但王麗麗等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，遼寧地區(qū)水稻資源抗稻瘟病基因聚合與抗病性并非完全正相關。本研究發(fā)現(xiàn)在僅攜帶單個抗病基因的親本中，攜帶Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita抗病基因的親本抗病比率分別為100.0%、75.0%、40.0%、50.0%和0%，在聚合2個抗病基因的親本中，Pi5+Pib（57.1%）、Pi5+Pi-kh（0%）和Pi5+Pita（33.3%）的抗病比率小于或遠小于攜帶單個抗病基因Pi5親本的抗病比率（75.0%），說明抗病基因Pi5聚合后抗病性反而減弱，推測基因聚合后抗病比率不是簡單地疊加。這與王麗麗等（2017）的研究推論相似。

稻瘟病是水稻上毀滅性真菌病害，符合經(jīng)典的基因?qū)蚣僬f（Jia et.al，2000）。本研究發(fā)現(xiàn)，在24份不攜帶抗病基因的親本中，有9個親本表現(xiàn)抗病，推測這些親本中含有本研究7個抗稻瘟病基因以外的其他抗稻瘟病基因，且環(huán)境因素對親本抗病性存在影響，具體原因有待進一步探究。

4 結(jié)論

基因聚合可有效提高親本的抗病性，但基因聚合后抗病比率不是簡單地疊加，應從中篩選出田間抗病性較強的親本作為抗稻瘟病育種的候選親本。

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（責任編輯 陳 燕）