彭靖茹 李朝昌 檀業(yè)維 溫立香 張芬 葉靖平

摘要：【目的】對(duì)廣西德?？h和隆林縣野生古茶樹及其他省份名優(yōu)栽培種茶樹進(jìn)行聚類分析，為野生古茶樹種質(zhì)資源保護(hù)、良種選育及創(chuàng)新利用提供理論參考?！痉椒ā坷煤Y選出的15對(duì)SSR引物對(duì)9份廣西德?？h和隆林縣的野生古茶樹種質(zhì)和15份名優(yōu)栽培種茶樹種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，并計(jì)算遺傳相似系數(shù)。【結(jié)果】篩選出的15對(duì)引物從德保04和德保05未擴(kuò)增出任何條帶，但從其余22份茶樹樣品中共擴(kuò)增出183條譜帶，其中CS1引物擴(kuò)增出多態(tài)性譜帶最多，為19條，最少為CS13引物，僅7條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出多態(tài)譜帶12.26條，多態(tài)率為96.17%。22份茶樹種質(zhì)資源可聚為兩大類群，其中德?？h和隆林縣的野生古茶樹聚在Ⅰ類群，栽培種茶樹聚在Ⅱ類群。根據(jù)遺傳相似系數(shù)，也可獲得上述相同的分類結(jié)果。茶樹品種間的遺傳相似系數(shù)為0.48～0.84，平均遺傳相似系數(shù)為0.67，其中，野生古茶樹種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)為0.68～0.84;栽培種茶樹間的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.84;野生古茶樹與栽培種茶樹的遺傳相似系數(shù)為0.48～0.77。僅德保06與其他野生古茶樹（隆林42和德保01）遺傳相似系數(shù)小于0.70;栽培種茶樹與野生古茶樹相比，僅黃觀音與野生古茶樹（德保01和德保G02）遺傳相似系數(shù)大于0.70?！窘Y(jié)論】廣西德?？h和隆林縣的野生古茶樹種質(zhì)起源相近，與我國其他各省份的名優(yōu)栽培種茶樹親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，存在相遠(yuǎn)近親和相近遠(yuǎn)親共存現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)廣西德?？h野生古茶樹為五柱茶系的厚軸茶，推測(cè)桂西北山區(qū)廣泛分布山茶屬原始種系。

關(guān)鍵詞： 野生古茶樹;SSR分子標(biāo)記;聚類分析;遺傳相似系數(shù);廣西

中圖分類號(hào)： S571.102.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）01-0001-07

0 引言

【研究意義】野生古茶樹蘊(yùn)藏各種優(yōu)良性狀的遺傳基因，對(duì)茶樹的分類、演化、變異、育種及生產(chǎn)等均具有較高的研究利用價(jià)值。廣西適宜茶樹生長(zhǎng)，野生古茶樹種質(zhì)資源非常豐富，尤其以百色地區(qū)、十萬大山和六萬大山最豐富（陳亮和虞富蓮，1996;諸葛天秋等，2016）。因此，收集廣西野生古茶樹種質(zhì)資源并分析其遺傳多樣性，對(duì)其資源保護(hù)、新品種育種及開發(fā)利用均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已有較多有關(guān)廣西野生古茶樹種質(zhì)資源的研究報(bào)道。左志明等（1994）對(duì)桂西山區(qū)的野生古茶樹進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，百色、隆林、那坡、德保等縣（市）的野生古茶樹多為喬木或小喬木樹形，且果大皮厚，中軸粗大，種隔明顯，為山茶屬茶組植物早期分化的原始種系，具有較高的學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值。賴兆榮等（2015）從廣西崇左扶綏縣姑遼收集野生古茶樹種質(zhì)資源，并利用其成功選育了多酚含量達(dá)特異資源指標(biāo)且制茶品質(zhì)較好的優(yōu)異單株。劉彤等（2015）利用10條ISSR引物對(duì)柳州九萬山的野生古茶樹種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究，結(jié)果表明，其遺傳多樣性較豐富，但大部分單株親緣關(guān)系較近。陳瑩玉等（2016）采用RAPD分子標(biāo)記分析廣西金秀縣4個(gè)地方的8個(gè)野生古茶樹資源與其他省份茶樹栽培品種的親緣關(guān)系，結(jié)果表明，廣西金秀縣的野生古茶樹資源具有原始特性，且遺傳多樣性較豐富。藍(lán)燕等（2017）、韋柳花等（2017）對(duì)廣西野生古茶樹葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察、適制性、化學(xué)成分、形態(tài)特征等進(jìn)行研究，挖掘出一些優(yōu)質(zhì)或特異的野生古茶樹種質(zhì)資源。李朝昌和蔣漓生（2018a）對(duì)廣西16個(gè)市（縣）33個(gè)點(diǎn)的野生古茶樹進(jìn)行系統(tǒng)、全面地調(diào)查，共收集了150份野生古茶樹資源，其內(nèi)含物差異較明顯，部分種質(zhì)達(dá)到茶樹優(yōu)異種質(zhì)資源標(biāo)準(zhǔn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】廣西隆林縣和德?？h的野生古茶樹資源主要分布于云貴高原的邊緣地帶，野生古茶樹種質(zhì)資源非常豐富，但該地地理位置偏僻，其野生古茶樹資源未能充分開發(fā)利用。雖然藍(lán)燕等（2017）、李朝昌和蔣漓生（2018a）對(duì)廣西百色德?？h和隆林縣的野生古茶樹資源進(jìn)行收集、性狀觀察、生化分析等，但未見從DNA水平上開展其遺傳多態(tài)性及親緣關(guān)系研究的報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用SSR分子標(biāo)記對(duì)廣西德?？h和隆林縣的野生古茶樹種質(zhì)資源和其他省份名優(yōu)栽培種茶樹進(jìn)行聚類分析，并從DNA水平進(jìn)行種質(zhì)鑒別，為廣西野生古茶樹種質(zhì)資源保護(hù)、良種選育及創(chuàng)新利用提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試茶樹種質(zhì)資源為廣西百色市德?？h東凌鄉(xiāng)新屯村和隆林縣德峨鄉(xiāng)東南村的野生古茶樹及廣西亞熱帶作物研究所茶葉種質(zhì)資源圃的名優(yōu)栽培種茶樹，具體信息見表1。主要試劑：HYQspinTM CT Plant DNA Kit試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;2×Taq? PCR Master Mix和DNA Marker購自TaKaRa公司;30%丙烯酰胺（29∶1）購自北京索萊寶科技有限公司;硝酸銀和其他試劑購自國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司。主要儀器設(shè)備：PCR擴(kuò)增儀（ABI 9600，美國）、核酸蛋白質(zhì)含量測(cè)定儀（BIO-RAD，美國）、DYY-6C電泳儀（北京六一儀器廠）和DYCZ-30C雙板夾芯式垂直電泳槽（北京六一儀器廠）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 樣品采集 分別采集茶樹的新鮮葉片樣品置于帶干冰的保溫箱進(jìn)行保存及運(yùn)輸，在實(shí)驗(yàn)室加液氮研磨處理，并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 DNA提取 采用HYQspinTM CT Plant DNA Kit試劑盒提取茶樹新鮮葉片DNA，并以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量、核酸蛋白質(zhì)含量測(cè)定儀測(cè)定其純度。

1. 2. 3 引物篩選及合成 參照姚明哲（2009）報(bào)道的40對(duì)SSR引物，從中篩選出15對(duì)在栽培種茶樹多態(tài)性擴(kuò)增效果較好的引物（表2），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1. 2. 4 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×PCR Mix 10.0 μL，30 μg/μL DNA模板1.0 μL，10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。PCR擴(kuò)增在ABI9600基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 45 s，各引物退火溫度（表2）退火45 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取2.0 μL PCR產(chǎn)物在8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行檢測(cè)（恒電壓200 V，電泳時(shí)間60 min）。電泳結(jié)束后，非變性聚丙烯酰胺凝膠用硝酸銀進(jìn)行染色顯影，具體方法：非變性聚丙烯酰胺凝膠先用ddH2O沖洗3次，每次洗1 min，然后置于0.5%～1.5%硝酸銀中染色10～15 min，再用ddH2O沖洗3次，每次洗1 min，最后，在顯影液中輕搖至顯帶清晰后放入ddH2O終止顯影。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

每對(duì)SSR引物檢測(cè)到的各多態(tài)性條帶均為一個(gè)等位基因。觀察并統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增出的等位基因條帶，將相同位置上有清晰條帶賦值為“1”，無帶時(shí)賦值為“0”，缺失時(shí)賦值為“9”，從而建立矩陣。利用NTSYSpc 2.10進(jìn)行UPGMA聚類分析，并構(gòu)建Neighbor-joining（NJ）系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，計(jì)算Jaccard遺傳相似系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 DNA提取及電泳檢測(cè)結(jié)果

用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)24份茶樹新鮮葉片DNA，上樣量為2.0 μL，結(jié)果（圖1）顯示其DNA主帶清晰，整齊無彌散，且點(diǎn)樣孔無其他雜質(zhì)。提取的茶樹新鮮葉片DNA OD260/OD280為1.8～2.0。

2. 2 茶樹種質(zhì)資源SSR多態(tài)性分析結(jié)果

采用篩選出的15對(duì)SSR引物對(duì)24份茶樹樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從野生古茶樹種質(zhì)德保04和德保05中未擴(kuò)增出任何條帶，其余22份茶樹樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為20～500 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。引物CS7和CS15擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖2和圖3所示。

由表3可知，15對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出183條譜帶，其中CS1引物擴(kuò)增出多態(tài)性譜帶最多，為19條，最少為CS13引物，僅7條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出多態(tài)譜帶12.26條，多態(tài)率為96.17%?？梢姡琒SR分子標(biāo)記在茶樹種質(zhì)資源中具有較高的多態(tài)性，適用于茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。

2. 3 聚類分析結(jié)果

由于篩選出的15對(duì)SSR引物從德保04和德保05未擴(kuò)增出任何條帶，因此，只能對(duì)其余22份茶樹種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳相似系數(shù)計(jì)算和聚類分析，結(jié)果如圖4和表4所示。22份茶樹種質(zhì)資源可聚為兩大類群，其中德?？h和隆林縣的野生古茶樹聚在Ⅰ類群，栽培種茶樹聚在Ⅱ類群。根據(jù)遺傳相似系數(shù)，也可獲得上述相同的分類結(jié)果。22份茶樹種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)為0.48～0.84，平均遺傳相似系數(shù)為0.67，其中，野生古茶樹種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)為0.68～0.84，以隆林01與隆林42的遺傳相似系數(shù)最高，為0.84，說明二者的親緣關(guān)系最近;其次是德保01與德保G02，為0.83;以德保06與德保01的遺傳相似系數(shù)最低，為0.68，說明二者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn);僅德保06種質(zhì)與其他野生古茶樹（隆林42和德保01）遺傳相似系數(shù)小于0.70。栽培種茶樹的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.84，其中黃觀音與白葉一號(hào)的遺傳相似系數(shù)最高，為0.84，表明二者的親緣關(guān)系最近;其次是黃觀音與黃金芽，為0.82，紫鵑與云大2的遺傳相似系數(shù)最低，僅為0.62，表明二者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。野生古茶樹與栽培種茶樹的遺傳相似系數(shù)為0.48～0.77，其中以德保G02與黃觀音的遺傳相似系數(shù)最高，為0.77，表明二者的親緣關(guān)系最近;隆林06與福鼎大毫的遺傳相似系數(shù)最低，為0.48，說明二者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。栽培種茶樹與野生古茶樹相比，僅黃觀音、德保01和德保G02的遺傳相似系數(shù)大于0.70，其余栽培種茶樹與野生古茶樹的遺傳相似系數(shù)均小于0.7，表明野生古茶樹與我國其他省份名優(yōu)栽培種的遺傳距離較遠(yuǎn)，可用于茶樹遠(yuǎn)源雜交選育優(yōu)良品種。

3 討論

本研究的聚類分析結(jié)果顯示，22份茶樹種質(zhì)資源可聚為兩大類群，其中廣西德?？h和隆林縣的野生古茶樹聚在Ⅰ類群，栽培種茶樹聚在Ⅱ類群，根據(jù)遺傳相似系數(shù)，也可獲得相同的分類結(jié)果，表明廣西德?？h和隆林縣的野生古茶樹種質(zhì)進(jìn)化起源相近。此外，在9份野生古茶樹樣品中，篩選出的15對(duì)引物從德保04和德保05未擴(kuò)增出任何條帶，致使這2份樣品無法進(jìn)行聚類分析及遺傳相似性分析，說明這15對(duì)引物不適用于全部野生古茶樹的遺傳相關(guān)性分析，但非常適用于栽培種茶樹的遺傳相關(guān)性分析，間接證明野生古茶樹與栽培種茶樹間的遺傳信息差異明顯。綜上所述，廣西德保縣和隆林縣的野生古茶樹種質(zhì)起源相近，與栽培種茶樹親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

本研究供試野生古茶樹來源于德保縣東凌鎮(zhèn)、隆林縣德峨鄉(xiāng)，兩地相距較遠(yuǎn)（約300 km），但聚類分析結(jié)果顯示，隆林縣的隆林049先與德?？h的德保01和德保G02聚為一小類，而不是與隆林縣的其他野生古茶樹先聚類，表明隆林049與其地理距離遠(yuǎn)的隆林縣野生古茶樹種質(zhì)遺傳距離最小;遺傳相似系數(shù)分析結(jié)果顯示，德保的德保06與德保01遺傳相似系數(shù)最小為0.68，表明德保06與其地理距離近的德保縣野生古茶樹遺傳距離較遠(yuǎn)。綜上所述，野生古茶樹遺傳距離與地理距離不是單純的“遠(yuǎn)對(duì)遠(yuǎn)”、“近對(duì)近”對(duì)應(yīng)關(guān)系，既存在地理距離近且遺傳距離近（稱“相近且近親”）的同種聚集現(xiàn)象，也存在地理距離遠(yuǎn)且遺傳距離近（稱“相遠(yuǎn)且近親”）的同種分散現(xiàn)象、地理距離近且遺傳距離遠(yuǎn)（稱“相近且遠(yuǎn)親”）的異種共存現(xiàn)象等情況。因此，將德?？h和隆林縣野生古茶樹同時(shí)存在的2種非對(duì)應(yīng)情況簡(jiǎn)稱為相遠(yuǎn)近親和相近遠(yuǎn)親共存現(xiàn)象。

厚軸茶是茶組植物較原始的種之一。廣西德?？h的野生古茶樹子房3～5室，經(jīng)鑒定是五柱茶系的厚軸茶（張宏達(dá)，1984年），其咖啡堿含量非常低，為0.34%（藍(lán)燕等，2017），根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2031—2011《農(nóng)作物優(yōu)異種質(zhì)資源評(píng)價(jià)規(guī)范 茶樹》描述屬于茶樹特異種質(zhì)資源，是選育低咖啡堿茶樹的良好親本材料。廣西隆林縣的野生古茶樹為特大葉的喬木型茶樹，子房5室，咖啡堿含量2.7%～3.0%，不屬于低咖啡堿特異種質(zhì)資源（李朝昌和蔣漓生，2018b），但是否屬于厚軸茶種質(zhì)資源，還需進(jìn)一步對(duì)其果實(shí)、花、葉等方面進(jìn)行觀測(cè)研究。厚軸茶主要分布于云南的文山、紅河及貴州等地區(qū)（張文駒等，2018），基本是按采集地進(jìn)行區(qū)分，但各地厚軸茶種質(zhì)資源間的差異鮮見報(bào)道，尤其是DNA水平間的遺傳差異未見報(bào)道。由于桂西北山區(qū)與云南、貴州等厚軸茶分布地區(qū)相鄰，地理距離相近、環(huán)境氣候相似，且前人（張宏達(dá)，1984）已將廣西德?？h的野生古茶樹鑒定為五柱茶系的厚軸茶，本研究也從DNA水平證實(shí)廣西德?？h和隆林縣野生古茶樹存在“相遠(yuǎn)近親和相近遠(yuǎn)親共存現(xiàn)象”。因此，推測(cè)桂西北山區(qū)廣泛分布山茶屬原始種系。

茶樹種質(zhì)資源的傳統(tǒng)鑒別方法主要是根據(jù)新梢、定型葉、營養(yǎng)芽物候期、花、果實(shí)等性狀進(jìn)行判定。本研究采集的茶樹栽培種主要引種于湖南、福建、云南、浙江等地選育的優(yōu)良品種，在當(dāng)?shù)貜V泛種植。由于廣西亞熱帶作物研究所茶葉種質(zhì)資源圃位于南寧市，其氣溫相對(duì)較高，部分品種茶樹的特殊性狀發(fā)生明顯變化，如白葉一號(hào)是浙江省選育出的優(yōu)良品種，是制作安吉白茶的主要茶樹品種，在當(dāng)?shù)卦绱河捎谀廴~葉綠素缺失而呈玉白色，最白為一芽二葉時(shí)期（賴建紅等，2016），但該品種引種至廣西南寧市后，長(zhǎng)達(dá)4年的種植期間均未發(fā)現(xiàn)白葉現(xiàn)象。可見，部分茶樹品種在環(huán)境氣候等相差較大的不同地區(qū)生長(zhǎng)，其葉形、葉色等重要性狀表現(xiàn)會(huì)發(fā)生改變。因此，采用傳統(tǒng)鑒別方法，即根據(jù)茶樹嫩芽、葉白化的重要性狀表現(xiàn)作為依據(jù)，將無法正確做出判斷。但通過分子標(biāo)記技術(shù)可較準(zhǔn)確鑒別是否同一品種及品種間的遺傳差異，為茶樹良種推廣和提高茶樹選育種效率提供技術(shù)保障。張羽等（2017）利用SCoT、EST-SSR和SRAP分子標(biāo)記對(duì)湘波綠、金牡丹、金觀音等50多種茶樹種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系研究，其中SCoT聚類分析結(jié)果顯示，湘波綠與金牡丹親緣關(guān)系較近，與本研究聚類分析結(jié)果相近。 由于不同的分子標(biāo)記所揭示的基因組位點(diǎn)信息不同，因此，聚類分析結(jié)果也存在一定的差異。在品種鑒別時(shí)，應(yīng)采用多種分子標(biāo)記方法，結(jié)果更準(zhǔn)確。本研究只使用了15對(duì)SSR引物開展研究，有2份樣品尚未能有效完成其遺傳多態(tài)性分析，因此，后續(xù)工作將繼續(xù)篩選更多數(shù)量、合適的引物進(jìn)行茶樹分子標(biāo)記研究。

4 結(jié)論

廣西德?？h和隆林縣的野生古茶樹種質(zhì)起源相近，與我國其他各省的名優(yōu)栽培種茶樹親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，存在相遠(yuǎn)近親和相近遠(yuǎn)親共存現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)廣西德保縣野生古茶樹為五柱茶系的厚軸茶，推測(cè)桂西北山區(qū)可能有分布較廣的山茶屬原始種系。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）