張珍 施開創(chuàng) 王孝德 黎宗強(qiáng) 尹彥文 屈素潔 陸文俊

摘要：【目的】明確雞源致病性沙門氏菌耐藥表型與致病性的相關(guān)性，為有效防控雞沙門氏菌病提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坎捎貌Ｆ囼?yàn)對(duì)55株雞源沙門氏菌廣西分離株進(jìn)行血清型鑒定，以紙片擴(kuò)散（K-B）法和PCR分別測(cè)定其耐藥表型及耐藥基因，通過(guò)小鼠攻毒試驗(yàn)檢測(cè)其致病性，并分析雞源沙門氏菌廣西分離株耐藥表型與致病性的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】55株沙門氏菌廣西分離株以鼠傷寒沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌為主，對(duì)青霉素G、阿莫西林、苯唑西林、頭孢噻吩、紅霉素和利福平的耐藥率均達(dá)100.00%，而對(duì)慶大霉素和大觀霉素較敏感（耐藥率在10.00%以下）。55株沙門氏菌廣西分離株中有1株（占1.82%）攜帶7種耐藥基因、6株（占10.91%）攜帶6種耐藥基因、20株（占36.36%）攜帶5種耐藥基因、12株（占21.82%）攜帶4種耐藥基因、13株（占23.64%）攜帶3種耐藥基因、3株（占5.45%）攜帶2種耐藥基因;16種耐藥基因中，blaTEM、tetX、sul3和aadA1基因檢出率較高，qepA、blaCMY和tetB基因檢出率較低，而qnrA、qnrB、Aph（3）-IIa、blaPSE和aadA2基因等未被檢出。55株沙門氏菌廣西分離株對(duì)昆明小白鼠均具有致病性，致死率為20%～100%;隨機(jī)選取10株分離株對(duì)昆明小白鼠的半數(shù)致死量（LD50）為4.00×107～3.18×108 CFU/mL。沙門氏菌分離株耐藥種類數(shù)量與LD50對(duì)數(shù)值的線性回歸方程為y=-0.086x+8.971（R2=0.9329），耐藥基因數(shù)量與LD50對(duì)數(shù)值的線性回歸方程為y=-0.148x+8.673（R2=0.5748），即沙門氏菌的耐藥性與其致病性呈正相關(guān)?！窘Y(jié)論】2015—2017年從廣西發(fā)病雞分離獲得的致病性沙門氏菌以鼠傷寒沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌為主，普遍存在耐藥性，且多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。雞源致病性沙門氏菌的耐藥表型與其致病性間呈正相關(guān)，因此，生產(chǎn)上要加強(qiáng)臨床用藥管理，加大細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)與防范。

關(guān)鍵詞： 雞;沙門氏菌;耐藥表型;耐藥基因;致病性;相關(guān)性

中圖分類號(hào)： S858.31? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）10-2350-09

Correlation between antimicrobial resistance and pathogenicity of Salmonella from chicken in Guangxi during 2015-2017

ZHANG Zhen1， SHI Kai-chuang2*， WANG Xiao-de3， LI Zong-qiang1，

YIN Yan-wen2， QU Su-jie2， LU Wen-jun2

（1College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning? 530004， China; 2Guangxi Animal Disease Prevention and Control Center， Nanning? 530001， China; 3Hezhou Animal Disease Prevention and Control Center，

Hezhou， Guangxi? 542800， China）

Abstract：【Objective】The correlation between antimicrobial resistance and pathogenicity of Salmonella isolates from chicken were analyzed for supporting scientific bases of effective prevention and control of poultry Salmonella disease. 【Method】The serotypes of 55 Salmonella Guangxi isolates from chicken were determined by tablet agglutination test. The paper diffusion K-B agar method was used to determine their resistant phenotype and PCR was used to detect the resistance genes. The pathogenic experiment in mice was used to determine their pathogenicity. The correlation between resistant phenotype of Salmonella Guangxi isolates from chicken and pathogenicity was also analyzed. 【Result】The 55 Salmonella Guangxi isolates mainly consisted of S. typhimurium and S. pullorum. All of them were 100.00% resistant to penicillin G， amoxicillin， oxacillin， cefalotin， erythromycin and rifampicin，but were sensitive to entamicin and spectinomycin（resistance rate less than 10.00%）. Of the 55 Salmonella Guangxi isolates，one strain（1.82%） contained seven resistant genes，six strains（10.91%） contained six resistant genes， twenty strains（36.36%） contained five resistant genes， twelve strains（21.82%） contained four resistant genes， thirteen strains（23.64%） contained three resistant genes and three strains （5.45%） contained two resistant genes. Of 16 kinds of resistant genes，blaTEM， tetX， sul3 and aadA1 had high positive rate，qepA， blaCMY and tetB had low positive rate，while qnrA， qnrB， Aph（3）-IIa， blaPSE and aadA2 were negative. All the 55 Salmonella Guangxi isolates were pathogenic to Kunming mice， and the mortality rate of them was 20%-100%. The median lethal dose（LD50） of 10 randomly selected isolates to Kunming mice was 4.00×107-3.18×108 CFU/mL. The linear regression equation between the numbers of drug resistant types and the logarithm values of LD50 was y=-0.086x+8.971（R2=0.9329）， and the linear regression equation between the numbers of resistant genes and the logarithm values of LD50 was y=-0.148x+8.673（R2=0.5748）， which indicated that there existed positive relationship between antimicrobial resistance and pathogenicity of salmonella isolates. 【Conclusion】The pathogenic Salmonella isolates from Guangxi diseased chicken during 2015-2017 mainly consist of S. Typhimurium and S. pullorum， and they commonly show resistance to antimicrobials and their multi-drug resistance is serious. There exists positive correlation between resistance phenotype and pathogenicity of the chicken Salmonella isolates， so it is necessary to strengthen clinical drug administration and increase bacterial drug resistance monitoring and prevention.

Key words： chicken; Salmonella; antimicrobial resistance phenotype; antimicrobial resistance gene; pathogenicity; correlation

0 引言

【研究意義】沙門氏菌（Salmonella）血清型有2600種以上，且部分血清型可造成人畜共患病，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全（李帆等，2018）。在養(yǎng)禽業(yè)中，不同血清型沙門氏菌可引起雞白痢、雞傷寒和禽副傷寒，且危害嚴(yán)重，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失（王嘉煒等，2017）?？咕幬镌诜乐紊抽T氏菌病方面發(fā)揮著重要作用，但由于長(zhǎng)期使用和濫用，沙門氏菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性呈逐年上升趨勢(shì)，尤其是多重耐藥現(xiàn)象始終困擾著養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。因此，研究雞源沙門氏菌耐藥性與致病性的相關(guān)性，明確其致病機(jī)理，對(duì)臨床科學(xué)用藥及促進(jìn)養(yǎng)禽業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著抗菌藥物在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的廣泛使用，病原菌在抗菌藥物的壓力下誘發(fā)產(chǎn)生多種耐藥機(jī)制，并通過(guò)染色體和質(zhì)粒等多種方式傳播，其中，來(lái)自染色體的耐藥性可穩(wěn)定傳給子代，來(lái)自質(zhì)粒的耐藥性可垂直傳播給子代和水平傳播給不同細(xì)菌，致使耐藥菌的數(shù)量及其范圍不斷擴(kuò)大（Lima et al.，2013;Ali et al.，2018）。此外，臨床上長(zhǎng)期超范圍亂用和濫用抗菌藥物，導(dǎo)致耐藥問(wèn)題日趨嚴(yán)重，極大危害畜牧業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生安全（Hur et al.，2012;Michael and Schwarz，2016）。Breui等（2000）曾報(bào)道，1994—1997年來(lái)自法國(guó)的25526株沙門氏菌分離株（人源5086株，動(dòng)物源20440株）對(duì)阿莫西林—克拉維酸的耐藥率由45%上升至66%，且人源分離株對(duì)氨芐西林的耐藥率由61%上升至73%、動(dòng)物源分離株對(duì)萘啶酸的耐藥率由3%上升至72%。由于各地用藥種類、頻率和習(xí)慣不同，故沙門氏菌耐藥性也存在一定的地域和時(shí)間差異（Foley and Lynne，2008;Lai et al.，2014）。Ren等（2016）研究報(bào)道，102株雞源沙門氏菌廣東分離株中38.2%對(duì)鏈霉素、36.3%對(duì)四環(huán)素、35.3%對(duì)磺胺異惡唑、34.3%對(duì)慶大霉素耐藥，且有31.4%分離株表現(xiàn)出多重耐藥。Zishiri等（2016）研究表明，南非雞源沙門氏菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率表現(xiàn)為四環(huán)素93.0%、甲氧氨芐嘧啶—磺胺甲惡唑84.0%、甲氧氨芐嘧啶78.4%、卡那霉素74.0%、慶大霉素48.0%、青霉素47.0%、阿莫西林和氯霉素31.0%、紅霉素18.0%、鏈霉素12.0%;而同期來(lái)自巴西的沙門氏菌分離株耐藥率表現(xiàn)為青霉素和阿莫西林100.0%、四環(huán)素83.0%、甲氧氨芐嘧啶66.7%、紅霉素62.5%、甲氧氨芐嘧啶—磺胺甲惡唑50.0%、卡那霉素16.7%、慶大霉素和鏈環(huán)素12.5%、氯霉素4.2%。關(guān)于細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性是否影響其致病性的問(wèn)題已引起廣泛關(guān)注。Huehn等（2010）通過(guò)檢測(cè)沙門氏菌攜帶毒力基因及其對(duì)抗菌藥物的耐藥情況，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌獲得耐藥性后毒力增強(qiáng)，即適應(yīng)環(huán)境的生存能力有所增強(qiáng)。Dione等（2011）在檢測(cè)沙門氏菌分離株的毒力基因和耐藥表型時(shí)發(fā)現(xiàn)，分離株毒力島及質(zhì)粒攜帶的毒力基因與其耐藥性存在顯著正相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】廣西是我國(guó)的養(yǎng)雞大省（區(qū)），年飼養(yǎng)量超過(guò)10億羽，尤其是黃羽雞作為廣西優(yōu)勢(shì)雞種，因飼養(yǎng)周期長(zhǎng)，加上當(dāng)前疫情復(fù)雜，生產(chǎn)中常使用大量抗菌藥物預(yù)防和治療各種疫病，致使沙門氏菌流行株產(chǎn)生耐藥和多重耐藥的概率增加（施開創(chuàng)等，2018），因而亟需掌握其耐藥現(xiàn)狀及其對(duì)雞群致病性的影響。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用玻片凝集試驗(yàn)對(duì)55株雞源沙門氏菌廣西分離株進(jìn)行血清型鑒定，以紙片擴(kuò)散（K-B）法和PCR分別測(cè)定其耐藥表型及耐藥基因，通過(guò)小鼠攻毒試驗(yàn)檢測(cè)其致病性，并分析雞源沙門氏菌廣西分離株耐藥表型與致病性的相關(guān)性，為有效防控雞沙門氏菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌等質(zhì)控菌株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)菌種保藏中心;4周齡左右的SPF級(jí)昆明小白鼠（20～25 g/只）購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。試驗(yàn)過(guò)程中昆明小白鼠飼養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房?jī)?nèi)，室溫控制在22～25 ℃、相對(duì)濕度控制在40%～60%，用廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的無(wú)抗生素全價(jià)專用飼料飼喂，自由飲用滅菌雙蒸水。亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、膽鹽硫乳（DHL）、木糖賴氨酸過(guò)氧膽鹽（XLD）、營(yíng)養(yǎng)（NA）和三糖鐵（TSI）瓊脂購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;Rapid ID 32E腸桿菌檢測(cè)試劑條購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃股份有限公司;沙門氏菌屬診斷血清購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司;18種藥敏紙片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 沙門氏菌分離鑒定

2015—2017年，采集來(lái)自廣西各地1544只病死雞的組織樣品（心臟、肝臟、脾臟和肺臟等），參照施開創(chuàng)等（2015）的方法分離鑒定沙門氏菌。具體操作：將組織懸液增菌后分別接種至XLD培養(yǎng)基、DHL培養(yǎng)基和顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選疑似沙門氏菌典型菌落純化培養(yǎng)，然后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、生化鑒定和血清型鑒定。同時(shí)，設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)（invA-F：5'-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3'和invA-R：5'-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3'）用于擴(kuò)增沙門氏菌屬特異性基因片段invA（285 bp），對(duì)生化鑒定和血清型鑒定呈陽(yáng)性的沙門氏菌分離株進(jìn)行PCR鑒定。

1. 3 藥敏性試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散（K-B）法對(duì)沙門氏菌分離株進(jìn)行18種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）制定的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定（CLSI，2014）。

1. 4 耐藥基因檢測(cè)

參照GenBank已發(fā)表的耐藥基因序列和相關(guān)文獻(xiàn)（Nde and Logue，2008;廖成水等，2011;Lu et al.，2011;劉芳萍等，2013），設(shè)計(jì)16對(duì)特異性引物（表1）用于擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類和氟喹諾酮類共16種代表性耐藥基因。挑取沙門氏菌分離株純化培養(yǎng)的單菌落，在LB培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)12 h，提取細(xì)菌總DNA。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：Premix TaqTM 10.0 μL，25 pmol/μL的上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌雙蒸水7.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，52～57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1. 5 致病性試驗(yàn)

對(duì)獲得的55株雞源沙門氏菌廣西分離株進(jìn)行致病性試驗(yàn)。將280只昆明小白鼠隨機(jī)分成56組（55個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，5只/組），試驗(yàn)組昆明小白鼠每只腹腔注射細(xì)菌液0.2 mL（4×108 CFU/mL），對(duì)照組每只腹腔注射0.2 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯。接種后各組昆明小白鼠分籠飼養(yǎng)，每隔6 h觀察一次，連續(xù)觀察168 h（7 d）。記錄昆明小白鼠的發(fā)病及死亡情況，對(duì)死亡的昆明小白鼠及時(shí)進(jìn)行剖檢及細(xì)菌分離鑒定。

1. 6 半數(shù)致死量（LD50）測(cè)定

隨機(jī)選取10株雞源沙門氏菌廣西分離株，測(cè)定其對(duì)昆明小白鼠的LD50。將205只昆明小白鼠隨機(jī)分成41組（40個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)陰性對(duì)照組，5只/組），每株沙門氏菌分離株設(shè)4個(gè)劑量組，分別為4×109、4×108、4×107和4×106 CFU/mL。經(jīng)腹腔注射攻毒后，每6 h觀察一次，連續(xù)觀察168 h（7 d）。記錄昆明小白鼠的死亡情況，并應(yīng)用改良的寇氏法計(jì)算LD50。

2 結(jié)果與分析

2. 1 沙門氏菌的分離及生化鑒定結(jié)果

無(wú)菌采集病死雞的組織樣品，經(jīng)SC增菌培養(yǎng)后平行接種于鑒別培養(yǎng)基上。菌落挑選標(biāo)準(zhǔn)：圓形、邊緣整齊、表面光滑，同時(shí)在DHL培養(yǎng)基上呈無(wú)色半透明、有或無(wú)黑色中心，在XLD培養(yǎng)基上呈粉紅或黃色、有或無(wú)黑色中心，在顯色培養(yǎng)基上呈紫紅色，在TSI培養(yǎng)基上呈紅色、底部有或無(wú)黑色中心;革蘭氏染色為陰性短桿菌。將初篩獲得的分離株接種至Rapid ID 32E腸桿菌試劑條上，采用ATB細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示所有分離株的氰化鉀、尿素、靛基質(zhì)和β-半乳糖苷酶試驗(yàn)均呈陰性，賴氨酸脫羧酶反應(yīng)呈陽(yáng)性或陰性，符合沙門氏菌的生化特性。通過(guò)上述分離鑒定，共獲得55株疑似沙門氏菌。

2. 2 沙門氏菌分離株的PCR鑒定結(jié)果

采用特異性引物對(duì)（invA-F/invA-R），以55株分離株的總DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增沙門氏菌屬特異性基因invA，結(jié)果均擴(kuò)增獲得與目的片段大?。?85 bp）一致的條帶，表明55株分離株均屬于沙門氏菌。部分疑似沙門氏菌分離株的PCR鑒定結(jié)果見圖1。

2. 3 沙門氏菌分離株的血清型鑒定結(jié)果

采用沙門氏菌“O”多價(jià)血清（A群～F群）進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，參照GB 4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)? 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)? 沙門氏菌檢驗(yàn)》，根據(jù)O抗原及H抗原第一相和第二相反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行血清分群和定型。同時(shí)，參照涂玉蓉等（2011）的方法，采用PCR進(jìn)行雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌鑒定。結(jié)果表明，55株分離株包含4個(gè)血清群（A群6株、B群23株、C2群1株和D群25株），其中，B群鼠傷寒沙門氏菌（41.82%）和D群雞白痢沙門氏菌（45.45%）是廣西當(dāng)前流行的優(yōu)勢(shì)菌株（表2）。

2. 4 沙門氏菌分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

采用K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果（表3）顯示，55株雞源沙門氏菌廣西分離株對(duì)青霉素G、阿莫西林、苯唑西林、頭孢噻吩、紅霉素和利福平的耐藥率均達(dá)100.00%，對(duì)多粘菌素E、林可霉素、復(fù)方新諾明和呋喃妥因的耐藥率在90.00%以上，對(duì)強(qiáng)力霉素、鏈霉素和諾氟沙星的耐藥率在50.00%～90.00%，而對(duì)大觀霉素和慶大霉素的耐藥率在10.00%以下，表明沙門氏菌廣西分離株普遍存在耐藥和多重耐藥現(xiàn)象。

2. 5 沙門氏菌分離株耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

采用設(shè)計(jì)的16對(duì)特異引物對(duì)55株雞源沙門氏菌廣西分離株進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，55株沙門氏菌分離株中有1株（占1.82%）攜帶7種耐藥基因、6株（占10.91%）攜帶6種耐藥基因、20株（占36.36%）攜帶5種耐藥基因、12株（占21.82%）攜帶4種耐藥基因、13株（占23.64%）攜帶3種耐藥基因、3株（占5.45%）攜帶2種耐藥基因。16種耐藥基因中，blaTEM基因（81.82%）、tetX基因（78.18%）、sul3基因（74.55%）和aadA1基因（65.45%）檢出率較高，qepA基因（5.45%）、blaCMY基因（3.64%）和tetB基因（1.82%）檢出率較低，而qnrA基因、qnrB基因、Aph（3）-IIa基因、blaPSE基因和aadA2基因等未被檢出（表3）。

2. 6 沙門氏菌分離株的致病性試驗(yàn)結(jié)果

以55株雞源沙門氏菌廣西分離株的菌液分別腹腔注射昆明小白鼠后，48 h內(nèi)均出現(xiàn)典型臨床癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡，皮毛松亂，時(shí)有顫抖，且糞便帶黏液;而對(duì)照組昆明小白鼠在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中均無(wú)異常表現(xiàn)。各試驗(yàn)組昆明小白鼠的累計(jì)死亡率為20%～100%，剖檢死亡昆明小白鼠發(fā)現(xiàn)其肝臟和脾臟腫大且呈青銅色，肝臟表面有針尖大小、灰白的壞死點(diǎn)，重新取樣進(jìn)行病原菌分離鑒定，結(jié)果證實(shí)均為沙門氏菌。隨機(jī)選取10株沙門氏菌分離株，每株分離株設(shè)4個(gè)劑量組（4×109、4×108、4×107和4×106 CFU/mL）分別腹腔注射昆明小白鼠（0.2 mL/只），每組5只。參照黃曉冬等（2012）的方法，應(yīng)用改良的寇氏法計(jì)算LD50，結(jié)果見表4。10株沙門氏菌分離株對(duì)昆明小白鼠的LD50介于4.00×107～3.18×108 CFU/mL，表明不同分離株間的致病性存在一定差異。

2. 7 沙門氏菌分離株耐藥表型與耐藥基因的相關(guān)性

藥敏試驗(yàn)和耐藥基因檢測(cè)結(jié)果（表3）顯示，55株雞源沙門氏菌廣西分離株的耐藥率分別為：β-內(nèi)酰胺類100.00%、氨基糖苷類74.55%、四環(huán)素類89.09%、磺胺類96.36%、氟喹諾酮類67.27%;耐藥基因攜帶率分別為：β-內(nèi)酰胺類81.82%、氨基糖苷類65.45%、四環(huán)素類78.18%、磺胺類74.55%、氟喹諾酮類25.45%。經(jīng)一元回歸分析擬合得到沙門氏菌分離株耐藥表型與耐藥基因攜帶率的線性回歸方程為y=-0.526x+51.220（R2=0.7367），即耐藥表型與耐藥基因呈正相關(guān)（圖2），沙門氏菌分離株攜帶耐藥基因越多，其耐藥性越嚴(yán)重。

2. 8 沙門氏菌分離株耐藥性與其致病性的相關(guān)性

綜合沙門氏菌分離株的藥敏試驗(yàn)和致病性試驗(yàn)結(jié)果可知，耐藥性越強(qiáng)的菌株其致病性越強(qiáng)。采用一元回歸分析擬合得到沙門氏菌分離株耐藥性與其致病性的相關(guān)性（圖3），其中，沙門氏菌分離株耐藥種類數(shù)量與LD50對(duì)數(shù)值的線性回歸方程為y=-0.086x+8.971（R2=0.9329），耐藥基因數(shù)量與LD50對(duì)數(shù)值的線性回歸方程為y=-0.148x+8.673（R2=0.5748）。說(shuō)明沙門氏菌分離株的耐藥種類數(shù)量及耐藥基因種類越多，其對(duì)昆明小白鼠的LD50對(duì)數(shù)值越小，分離株毒力越強(qiáng)，即沙門氏菌的耐藥性與其致病性呈正相關(guān)。

3 討論

細(xì)菌耐藥性危害日趨嚴(yán)重，已引起世界各國(guó)的高度重視，并普遍加強(qiáng)細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)和防控。Fardsanei等（2018）研究表明，44株人源沙門氏菌伊朗分離株對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為90.9%、對(duì)硝基二氧酸的耐藥率為77.3%、對(duì)頭孢洛辛的耐藥率為72.2%，對(duì)其他9種抗菌藥物的耐藥率為2.3%～40.9%，且68.2%的分離株表現(xiàn)出三重以上的耐藥性。Thung等（2018）研究報(bào)道，23株牛源沙門氏菌馬來(lái)西亞分離株對(duì)青霉素、紅霉素和萬(wàn)古霉素均已產(chǎn)生耐藥性，且所有分離株至少表現(xiàn)為三重耐藥，最嚴(yán)重者達(dá)九重耐藥。在國(guó)內(nèi)，沈?qū)W懷等（2017）研究表明，42株雞源沙門氏菌安徽分離株對(duì)阿米卡星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率均低于20.00%，但對(duì)氨芐西林、呋喃唑酮、鏈霉素、復(fù)方新諾明、大觀霉素和多西環(huán)素的耐藥率在50.00%以上，其中對(duì)氨芐西林的耐藥率高達(dá)97.62%，且97.62%的分離株存在多重耐藥，最多達(dá)十二重耐藥。孫璐等（2017）研究報(bào)道，233株雞源沙門氏菌山東分離株對(duì)慶大霉素的耐藥率最高（100.00%），對(duì)多西環(huán)素、氨芐西林、大觀霉素、四環(huán)素、氟苯尼考和磺胺甲惡唑耐藥率分別為84.94%、75.73%、67.78%、56.00%、52.00%和50.00%，且72.00%的分離株呈多重耐藥。王嘉煒等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，432株雞源沙門氏菌陜西分離株對(duì)磺胺異惡唑的耐藥率（89.81%）最普遍，對(duì)磺胺甲惡唑、萘啶酸、四環(huán)素、氨芐西林、氯霉素和阿莫西林—克拉維酸等抗菌藥物的耐藥率均在50.00%以上。在本研究中，55株雞源沙門氏菌對(duì)青霉素G、阿莫西林、苯唑西林、頭孢噻吩、紅霉素和利福平的耐藥率達(dá)100.00%，對(duì)多粘菌素E、復(fù)方新諾明、林可霉素和呋喃妥因的耐藥率在90.00%以上，對(duì)鏈霉素、強(qiáng)力霉素和諾氟沙星的耐藥率為50.00%～90.00%，且多重耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重?？梢?，沙門氏菌耐藥及多重耐藥現(xiàn)象在世界各國(guó)普遍存在，給畜牧業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生安全帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。究其原因主要是各雞場(chǎng)長(zhǎng)期超量、超范圍使用，甚至亂用和濫用抗菌藥物，且缺乏針對(duì)耐藥細(xì)菌的監(jiān)測(cè)和防范措施，導(dǎo)致耐藥細(xì)菌和耐藥種類越來(lái)越多。此外，由于各雞場(chǎng)的經(jīng)營(yíng)理念和飼養(yǎng)管理水平不同，用藥習(xí)慣、用藥種類、用藥劑量及用藥時(shí)長(zhǎng)的不同均可導(dǎo)致細(xì)菌耐藥情況存在差異。

細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制很多，其中耐藥基因的作用最重要（董杰，2015）。耐藥基因經(jīng)染色體及質(zhì)粒等不同載體介導(dǎo)，可垂直傳播給子代，以及在不同菌株間進(jìn)行水平傳播，促使菌株產(chǎn)生耐藥性，即細(xì)菌耐藥性與其攜帶的耐藥基因存在密切關(guān)系（劉芳萍等，2013;黎宗強(qiáng)等，2016;Unlu et al.，2018）。劉芳萍等（2013）研究表明，沙門氏菌耐藥性與相關(guān)耐藥基因的攜帶率一致，所檢測(cè)的29株雞源沙門氏菌耐藥率分別為：氨芐西林31.0%，頭孢唑啉10.3%，四環(huán)素44.8%，復(fù)合磺胺41.4%，環(huán)丙沙星37.9%，氧氟沙星37.9%，諾氟沙星37.9%，氯霉素3.4%;而耐藥基因檢出率分別為：blaTEM-1基因31.0%，tetA基因37.9%，tetB基因44.8%，sul1基因41.3%，sul2基因41.3%，aadA1基因3.4%，dfrA1基因10.3%，qnr基因37.9%。黎宗強(qiáng)等（2016）研究報(bào)道，29株雞源沙門氏菌對(duì)16種抗菌藥物的耐藥性最高可達(dá)十四重耐藥，以六重耐藥和七重耐藥為主（占51.73%）;耐藥基因以同時(shí)攜帶4～6種為主（占79.31%），耐藥表型與耐藥基因攜帶率呈正相關(guān)。Unlu等（2018）通過(guò)檢測(cè)50株人源沙門氏菌分離株對(duì)青霉素、阿莫西林、哌拉西林、頭孢他嗪、塞里阿松、甲氧氨芐嘧啶和左氧氟沙星的耐藥性，以及耐藥基因blaSHV-1、blaTEM-1、blaCTX-1、qnrA、qnrB、qnrS、sul1和sul2的攜帶情況，證實(shí)細(xì)菌耐藥表型與其攜帶耐藥基因呈密切正相關(guān)。本研究結(jié)果表明，采用設(shè)計(jì)的16對(duì)特異引物能從55株雞源沙門氏菌廣西分離株中檢測(cè)出11種耐藥基因，以blaTEM基因檢出率最高（81.82%）;其中，1株（占1.82%）攜帶7種耐藥基因、6株（占10.91%）攜帶6種耐藥基因、20株（占36.36%）攜帶5種耐藥基因、12株（占21.82%）攜帶4種耐藥基因、13株（占23.64%）攜帶3種耐藥基因、3株（占5.45%）攜帶2種耐藥基因;且通過(guò)擬合沙門氏菌分離株耐藥表型與耐藥基因攜帶率間的線性回歸方程得知，耐藥表型與耐藥基因呈正相關(guān)，即沙門氏菌分離株攜帶耐藥基因越多，其耐藥性越嚴(yán)重。

細(xì)菌毒力受其耐藥性及毒力基因攜帶情況的雙重影響（Huehn et al.，2010;Dione et al.，2011）。Huehn等（2010）對(duì)77株人源和動(dòng)物源沙門氏菌分離株進(jìn)行毒力基因（avrA、ssaQ、mgtC、siiD、sopB、gipA、sodC1、sopE1、spvC和bcfC）攜帶情況及耐藥性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌耐藥性可增加其毒力，從而增強(qiáng)細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的生存能力。Dione等（2011）通過(guò)檢測(cè)185株人源和動(dòng)物源沙門氏菌分離株的耐藥性和毒力基因，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌分離株對(duì)甲基氨芐嘧啶、阿莫西林、四環(huán)素、甲基氨芐嘧啶—磺胺甲惡唑、替卡西林、壯觀霉素、鏈霉素、磺酰胺和呋喃妥因的耐藥性與其毒力島及質(zhì)粒所攜帶的毒力基因（sopB、sitC、orfLC、pipD和pefA）存在顯著正相關(guān)。此外，抗菌藥物耐藥基因與菌株毒力質(zhì)粒密切相關(guān)，且具有多重耐藥的沙門氏菌較未具有多重耐藥的沙門氏菌毒力更強(qiáng)（Nayak et al.，2004;Ngoi and Thong，2013）。Nayak等（2004）研究表明，火雞源沙門氏菌對(duì)紅霉素、桿菌肽、新生霉素和利福平的多重耐藥率高達(dá)100%，且這種多重耐藥性是通過(guò)染色體變異及耐藥基因轉(zhuǎn)移而獲得，同時(shí)能增強(qiáng)相應(yīng)分離株的毒力。Ngoi等（2013）檢測(cè)了111株沙門氏菌分離株（人源45株，動(dòng)物源66株）的耐藥性，發(fā)現(xiàn)62%人源菌株和23%動(dòng)物源菌株具有多重耐藥，處于高風(fēng)險(xiǎn)階段的人源菌株（40%）是動(dòng)物源菌株（18%）的2倍多。本研究隨機(jī)選取10株雞源沙門氏菌廣西分離株，分析其耐藥性與致病性的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沙門氏菌分離株的耐藥種類數(shù)量越多，其毒力越強(qiáng)。生產(chǎn)上長(zhǎng)期使用抗菌藥物導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性加重和毒力增強(qiáng)（Foley and Lynne，2008），是由于細(xì)菌毒力與耐藥質(zhì)粒共同進(jìn)化，進(jìn)而導(dǎo)致耐藥性越多的細(xì)菌毒力越強(qiáng)，因此，生產(chǎn)上要加強(qiáng)臨床用藥管理，加大細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)與防范。

4 結(jié)論

2015—2017年從廣西發(fā)病雞分離獲得的致病性沙門氏菌以鼠傷寒沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌為主，普遍存在耐藥性，且多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。雞源致病性沙門氏菌的耐藥表型與其致病性間呈正相關(guān)，因此，生產(chǎn)上要加強(qiáng)臨床用藥管理，加大細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)與防范。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）