胡 廣 梁大成

摘要：【目的】搜索鑒定木薯還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）基因家族成員，分析其生物學(xué)信息及在不同組織和非生物脅迫下的表達(dá)模式，為深入研究該家族基因?qū)δ臼韷K根發(fā)育的調(diào)控機(jī)理及提高木薯抗逆性提供理論參考?！痉椒ā繌腏GI數(shù)據(jù)庫(kù)下載木薯的基因組序列，由pfam數(shù)據(jù)庫(kù)下載4個(gè)NOX蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)的HMM文件，通過(guò)HMMER程序篩選NOX基因家族成員，利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)該家族蛋白的理化性質(zhì)、氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析?；贕EO數(shù)據(jù)庫(kù)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）數(shù)據(jù)，對(duì)木薯NOX基因家族成員在不同組織和干旱脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】從木薯基因組中共鑒定到15個(gè)NOX基因家族成員，包括9個(gè)NOX基因和6個(gè)FRO基因（NOX祖先基因）。FRO基因的外顯子數(shù)（6～9個(gè)）明顯少于NOX基因的外顯子數(shù)（11～14個(gè)），且FRO基因的內(nèi)含子序列較NOX基因短，NOX基因的第一個(gè)外顯子相對(duì)保守。15個(gè)NOX基因家族成員分布在木薯的9條染色體和1個(gè)結(jié)構(gòu)支架上，且均被定位在染色體末端，除6號(hào)染色體有4個(gè)基因、8號(hào)和14號(hào)染色體有2個(gè)基因外，其他染色體均只有1個(gè)基因。木薯NOX蛋白的分子量和氨基酸數(shù)明顯高于FRO蛋白，而理論等電點(diǎn)（pI）差異不明顯。FRO蛋白含6～9個(gè)保守跨膜結(jié)構(gòu)域，而NOX蛋白均只含4個(gè)跨膜螺旋區(qū)，且均位于第350～750位氨基酸殘基。木薯NOX家族蛋白有10個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中Motif1和Motif8存在于所有的NOX和FRO蛋白中，Motif6為NOX蛋白所特有，Motif3只獨(dú)立存在于FRO蛋白中。NOX蛋白均具有典型的保守結(jié)構(gòu)域和相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其脫氫酶結(jié)構(gòu)域明顯折疊成催化域裂縫結(jié)構(gòu)，且C末端氨基酸極度保守。由RNA-Seq數(shù)據(jù)的基因表達(dá)譜可知，NOX基因家族成員在不同木薯葉片、中靜脈、葉柄、莖、側(cè)芽、莖尖分生組織、根尖分生組織、易碎胚性愈傷組織、胚性愈傷組織（OES）和貯藏根中均有表達(dá)，但呈不同的表達(dá)模式，其中，Manes.14G042600和Manes.S089900在儲(chǔ)藏根中高表達(dá)，Manes.06G128700和Manes.09G172500在須根和根尖分生組織中高表達(dá)。在木薯品種KU50和新選048的葉片中，Manes.14G042600基因在干旱脅迫下呈上調(diào)表達(dá)，推測(cè)NOX基因在特定組織及響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中扮演重要角色?！窘Y(jié)論】木薯NOX基因家族成員具有保守基因結(jié)構(gòu)，其編碼蛋白具有保守的功能域，尤其是C端氨基酸序列;NOX基因表達(dá)具有組織特異性，部分成員的表達(dá)受非生物脅迫的影響。FRO蛋白和NOX蛋白具有較明顯的共進(jìn)化關(guān)系。

關(guān)鍵詞： 木薯;還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）;基因家族成員;生物信息學(xué);干旱脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)： S533.035.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）10-2178-10

Bioinformatics of cassava NOX gene family and

its expression analysis

HU Guang1，2， LIANG Da-cheng1，2*

（1Engineering Research Center of Ecology and Agricultural Use of Wetland， Ministry of Education/Hubei? Key Laboratory of Waterlogging Disaster and Wetland Agriculture， Jingzhou， Hubei? 434025， China;

2Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry，Jingzhou， Hubei? 434025， China）

Abstract：【Objective】Gene family members of reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase（NOX） in cassava were identified through bioinformatic mining of publicly available data，and gene expression profiles in di-fferent tissues and under various abiotic stresses were also analyzed，which laid? theoretical references for further studies on the regulation mechanism of NOX genes on cassava tuberization and improvement of stress resistance of cassava. 【Method】Cassava genome sequences were downloaded from GJI database and four NOX domain-related HMM files were downloaded from the pfam protein database，then the HMMER program was performed to characterize the NOX family members. The physical and chemical properties，amino acid sequence and structural characteristics of the family protein were analyzed by bioinformatics software. Based on transcriptome sequencing（RNA-Seq） data at GEO database，the expression profiles of cassava NOX gene family members was further analyzed in various tissues and under drought stress. 【Result】A total of 15 members of the NOX gene family were identified from the cassava genome，including 9 NOX genes，6 FRO genes （or the ancestral NOX genes）. The exons of NOX（11-14） gene greatly outnumbered that of the FRO family（6-9）. The intron sequence of FRO gene was shorter than that of NOX gene and the first exon of NOX gene was relatively conserved. Fifteen members of the NOX gene family were distributed on 9 different chromosomes and 1 scaffold of cassava，all of them were anchored near the endpoints of chromosomes. Except for chromosome 6（4 genes） and chromosome 14（2 genes），there was only one NOX gene in each chromosome. The molecular weight and amino acid number of NOX protein in cassava were? lower than FRO protein， but the theoretical isoelectric point（pI） difference was not obvious. FRO proteins harbored 6 to 9 conserved transmembrane domains，whereas all the NOX proteins had only 4 transmembrane domains. There are 10 conserved domains of NOX family proteins in cassava， with Motif1 and Motif8 in all NOX and FRO proteins， Motif6 only in NOX proteins， and Motif3 only in FRO proteins. Three-dimension homologous modeling further revealed that all NOX proteins had typical conserved domains and similar protein structures. The dehydrogenase domain folded obviously into the catalytic domain fissure structure and the C-terminal sequence appeared as an extremely conserved motif. The expression profile of the NOX genes using RNA-Seq data displayed different expression patterns across different tissues，including leaves，mid vein，petiole，stem，lateral bud， shoot apical meristem（SAM）， root apical meristem（RAM）， friable embryogenic callus（FEC）， organized embryogenic structures（OES） and storage roots. Some of them were highly enriched in storage root，for example? Manes.14G042600 and Manes.S089900，however，Manes.06G128700 and Manes.09G172500 were highly expressed in fibrous root and RAM. Notably，in the leaves of varieties cv. KU50 and Xinxuan 048，Manes.14G042600 was upregulated under drought stress，implying a potential role of NOX gene in respon-ding to abiotic stress. 【Conclusion】Cassava NOX gene family members contain conserved gene structure and their encoded proteins also contain conserved functional domains，particularly in their C-terminal regions，suggesting the underlying co-evolutionary relationship between FRO protein and NOX protein. The NOX genes are tissue specific，and some of them are responsive to abiotic stress.

Key words： cassava; reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase（NOX）; gene family members;bioinformatics; drought stress

0 引言

【研究意義】木薯（Manihot esculenta Crantz）是一種重要的塊根糧食作物，主要種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，其塊莖中淀粉含量較高（70%～90%），約是水稻光合速率的2倍（Ihemere et al.，2006;Santa Brígida et al.，2014;Oyelakin et al.，2015）。研究發(fā)現(xiàn)，塊莖的發(fā)育和儲(chǔ)藏根采后生理退化與活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生密切相關(guān)，活性氧能誘導(dǎo)超氧化物離子引起非生物脅迫，在響應(yīng)多種與植物氧化還原反應(yīng)相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用（Xu et al.，2013;Liu et al.，2017）;而還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）是生成活性氧的主要催化酶（Bedard and Krause，2007;Lambeth and Neish，2014）。因此，利用生物信息學(xué)方法研究木薯NOX基因家族，揭示其成員數(shù)量、理化特性、染色體位置分布、基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、蛋白三維結(jié)構(gòu)和時(shí)空表達(dá)特征等，對(duì)研究木薯塊莖的發(fā)育生物學(xué)特性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】NOX普遍存在于植物、動(dòng)物和真菌中（Bedard and Krause，2007）。在動(dòng)物細(xì)胞中，NOX是一種面向細(xì)胞外空間的酶復(fù)合物，包含膜結(jié)合異質(zhì)二聚體即黃細(xì)胞色素b558（由gp91phox和p22phox組成）及吞噬細(xì)胞的4種胞質(zhì)成分即p47phox、p67phox、p40phox和小分子蛋白GTPase Rac（Vignais，2002;Quinn and Gauss，2004）。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，胞質(zhì)成分與黃酮細(xì)胞色素b558相互作用，激活NOX，催化發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，最終產(chǎn)生過(guò)氧化氫（H2O2）和羥基自由基（OH）等活性氧（Vignais，2002;Quinn and Gauss，2004;Mizrahi et al.，2006）。在植物細(xì)胞中，NOX被稱(chēng)為呼吸爆發(fā)氧化酶同源物（Rbohs），也是哺乳動(dòng)物吞噬細(xì)胞gp91phox的同源物，調(diào)控活性氧的生成（Sagi and Fluhr，2006）。活性氧在植物生長(zhǎng)調(diào)控和次生代謝反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，不僅破壞由氧化代謝產(chǎn)生有害因子的細(xì)胞并導(dǎo)致其程序性細(xì)胞死亡，還作為植物的信號(hào)分子響應(yīng)非生物脅迫（Mittler et al.，2011;Dietz et al.，2016）。近年來(lái)，已有大量研究表明，NOX基因參與植物的發(fā)育調(diào)控和逆境脅迫反應(yīng)。在水稻中，已有9個(gè)NOX基因家族成員被分離鑒定出來(lái)，其中，OsNOX1、OsNOX2和OsNOX3基因在干旱和鹽脅迫下過(guò)表達(dá)能明顯提高水稻的抗逆性和耐受性（Nagano et al.，2016）;OsNOX9基因高效表達(dá)能促進(jìn)根的形成（Yamauchi et al.，2017）。在擬南芥中，NOX基因家族成員AtRbohD在低氧脅迫下通過(guò)H2O2介導(dǎo)的乙烯信號(hào)釋放途徑而抑制根系伸長(zhǎng)（Kaya et al.，2014），在葉片中，AtRbohD基因通過(guò)響應(yīng)脫落酸激素的信號(hào)傳導(dǎo)而控制氣孔開(kāi)合（Chaouch et al.，2012）。在小麥中，NOX基因家族成員在不同組織中均有特異表達(dá)，其中，TaNOX3和TaNOX13基因在小麥葉片中高效表達(dá)，TaNOX11基因主要在莖中表達(dá)，TaNOX12基因則主要在幼穗中表達(dá)，TaNOX8基因在冷害和熱害脅迫下均呈下調(diào)表達(dá)（李日和陳坤明，2015;Hu et al.，2018），說(shuō)明這些基因在調(diào)控小麥的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。在番茄中，SlRboh1基因高表達(dá)促使活性氧積累，以適應(yīng)更高的二氧化碳濃度和油菜素類(lèi)固醇含量（Xia et al.，2014）。在草莓中，NOX基因過(guò)表達(dá)可明顯提高植株的冷害耐受性，抑制NOX基因表達(dá)會(huì)減少活性氧生成量導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，耐受性降低（Zhang et al.，2018）。【本研究切入點(diǎn)】迄今，有關(guān)NOX基因家族的研究主要集中于溫帶禾本科植物或模式植物等，而鮮見(jiàn)針對(duì)木薯NOX基因家族的生物學(xué)信息及時(shí)空表達(dá)特征的研究報(bào)道，對(duì)不同逆境條件下該基因家族的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從木薯基因組中鑒定出NOX基因家族成員，分析其基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系、染色體位置分布、編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和三維結(jié)構(gòu)及不同組織和非生物脅迫下的表達(dá)情況，為深入研究該家族基因?qū)δ臼韷K根發(fā)育的調(diào)控機(jī)理及提高木薯抗逆性提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 木薯NOX基因家族成員檢索及鑒定

從JGI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//genome.jgi.doe.gov/）下載木薯的基因組序列，包括編碼區(qū)（CDS）序列和基因組GFF3注釋文件。利用pfam數(shù)據(jù)庫(kù)下載NOX蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)的4個(gè)HMM文件，即NADPH_Ox、Ferric_reduct、NAD_Binding6和FAD_Binding8，并使用HMMER程序篩選NOX基因家族成員，E閾值設(shè)為10-E5，并在CDD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證（Eddy，2011;Marchler-Bauer et al.，2017）。

1. 2 木薯NOX基因家族成員基因結(jié)構(gòu)分析及染色體定位

將NOX基因cDNA序列與木薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.phyzome.net/cassava）中相應(yīng)的基因組DNA序列進(jìn)行比對(duì)，分析NOX基因中內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并利用GSDS對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化（Guo et al.，2007）。從木薯基因組數(shù)據(jù)中獲得NOX基因的染色體位置和每條染色體的總長(zhǎng)度，利用MapGene2Chrom（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）在線工具繪制NOX基因的染色體位置分布圖。

1. 3 蛋白理化性質(zhì)及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

利用ExPASy預(yù)測(cè)NOX基因家族成員編碼蛋白的理化性質(zhì)（Gasteiger et al.，2003）;使用HMMER在線預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域;利用MEME在線預(yù)測(cè)蛋白的保守基序，基序最大數(shù)目設(shè)置為10，基序長(zhǎng)度設(shè)為6～50個(gè)氨基酸（Bailey et al.，2009），并將預(yù)測(cè)的保守基序和蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行對(duì)應(yīng)分析。

1. 4 蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)木薯NOX蛋白的三維結(jié)構(gòu)。同源建模模板為NOX5蛋白（Protein Databank ID 5o0x.1.A），并利用PyMOL顯示NOX蛋白脫氫酶結(jié)構(gòu)域的保守末端。

1. 5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用ClusterW進(jìn)行多重序列比對(duì)，采用MEGA 7.0以最大似然法（Maximum-Likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，并利用自舉重采樣法，設(shè)置1000次自舉重復(fù)對(duì)分支的可靠性進(jìn)行評(píng)估（Kumar et al.，2009）。

1. 6 木薯轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）數(shù)據(jù)獲取及表達(dá)特性分析

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載11個(gè)木薯組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)（GSE82279）及干旱脅迫下葉片組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)（GSE98537）（Wislon et al.，2017）。利用R語(yǔ)言，基于FPKM值繪制基因表達(dá)譜，以Log2Fold Change（Log2FC）值繪制差異表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 木薯NOX基因家族成員鑒定及基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

從木薯基因組中共鑒定獲得15個(gè)NOX基因家族成員，包括9個(gè)NOX基因和6個(gè)FRO基因（NOX祖先基因），根據(jù)基因外顯子位置分布可將其明顯劃分為兩個(gè)類(lèi)群（NOX基因和FRO基因），如圖1所示。FRO基因的外顯子個(gè)數(shù)明顯少于NOX基因，其中Manes.06G16800基因最少，僅含有6個(gè)外顯子，其他FRO基因含7～9個(gè)，且相對(duì)于NOX基因，F(xiàn)RO基因的內(nèi)含子序列較短。NOX基因的外顯子數(shù)為11～14個(gè)，平均為13個(gè)，但Manes.02G016200、Manes.08G057200和Manes.S089900基因的內(nèi)含子區(qū)域較其他基因長(zhǎng)，且NOX基因的第一個(gè)外顯子相對(duì)保守，推測(cè)是其編碼蛋白重要的功能域。

2. 2 木薯NOX基因家族成員的染色體位置分布情況

利用MapGene2Chrom繪制木薯NOX基因家族成員在木薯染色體上的位置，結(jié)果如圖2所示。這些基因分布在木薯的9條染色體和1個(gè)結(jié)構(gòu)支架上，且均被定位在染色體末端，除6號(hào)染色體、8號(hào)染色體和14號(hào)染色體外，其他染色體均只有1個(gè)基因。其中，6號(hào)染色體上分布的NOX基因和FRO基因最多，且NOX基因Manes.06G128700與2個(gè)FRO基因Manes.06G109600和Manes.06G151600的距離較近;14號(hào)染色體上分布的NOX基因Manes.14G042600與FRO基因Manes. 14G023200相距也較近（圖2），說(shuō)明上述FRO基因和NOX基因可能存在連鎖關(guān)系。

2. 3 木薯NOX家族蛋白的理化性質(zhì)及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果

木薯NOX家族蛋白（NOX蛋白和FRO蛋白，下同）的理化性質(zhì)如表1所示。NOX蛋白的氨基酸殘基數(shù)757～950個(gè)，平均為897個(gè);相對(duì)分子量87.2～107.9 kD;平均為101.9 kD;理論等電點(diǎn)（pI）8.90～9.74，平均為9.49。FRO蛋白的氨基酸殘基數(shù)556～722個(gè)，平均為649;相對(duì)分子量63.3～81.6 kD，平均為73.1;pI 7.72～10.06，平均為9.07?？梢?jiàn)，木薯NOX蛋白的分子量和氨基酸數(shù)明顯高于FRO蛋白。FRO蛋白包含有6～9個(gè)保守跨膜結(jié)構(gòu)域，而NOX蛋白均只含4個(gè)跨膜螺旋區(qū)，且均位于第350～750位氨基酸殘基，說(shuō)明NOX蛋白氨基酸序列極度保守，以保證NOX蛋白的跨膜功能。

2. 4 木薯NOX家族蛋白的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

利用MEME共鑒定出木薯NOX家族蛋白的10個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（Motif1～Motif10），如圖3和圖4所示。其中，Motif6屬于EF_hand結(jié)構(gòu)域，是NOX蛋白特有的保守序列;Motif5、Motif9和Motif10屬于Ferric_reductase結(jié)構(gòu)域;Motif2屬于FAD_Binding8結(jié)構(gòu)域;Motif1、Motif4、Motif7和Motif8屬于NAD_Binding6結(jié)構(gòu)域。Motif1和Motif8存在于所有的NOX和FRO蛋白中，表明這些保守結(jié)構(gòu)域是連接FRO和NOX蛋白的橋梁，是進(jìn)化過(guò)程中保留下來(lái)的重要結(jié)構(gòu)。在FRO蛋白中，Manes.06G151600.3.p和Manes.06G151600.4.p缺失Motif2，可能是Manes. 06G151600基因選擇性剪接的結(jié)果，且只有Manes. 01G254300.1.p含有Motif9，而Motif9是NOX蛋白特有的保守序列，說(shuō)明FRO和NOX基因間存在進(jìn)化關(guān)系;Motif3只獨(dú)立存在于FRO蛋白中，說(shuō)明其是FRO蛋白獨(dú)立行使功能的必要位點(diǎn)。在NOX蛋白中，各結(jié)構(gòu)域相對(duì)穩(wěn)定，只有Manes.04G28100.1.p的N端重復(fù)1個(gè)Motif10。

2. 5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果

由圖5可知，不同物種的NOX家族蛋白可分為兩大分支（NOXs和FROs），其中，NOXs分支是含NOX蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白，F(xiàn)ROs分支則只含有FRO蛋白。NOXs分支包括5個(gè)苔蘚植物小立碗蘚（Physcomitrella patens）NOX蛋白、9個(gè)木薯NOX蛋白和10個(gè)擬南芥NOX蛋白，說(shuō)明隨著物種的進(jìn)化，NOX蛋白逐漸增加，其中，Manes.09G172500.1.P與擬南芥AT5G47910.1、Manes.08G118500.1.P與擬南芥AT1G09090.1、Manes.16G092100.1.P與擬南芥AT1G19230.1親緣關(guān)系較近，推測(cè)其具有相似的功能;5個(gè)苔蘚植物小立碗蘚NOX蛋白獨(dú)立聚為一個(gè)分支，僅存在于低等苔蘚植物中，可能是由于環(huán)境和生物的選擇壓力，植物在從水生到陸地進(jìn)化過(guò)程中NOX基因家族經(jīng)歷了較劇烈的演化過(guò)程。FROs分支又可被分為2個(gè)小分支（FROs1和FROs2），可能對(duì)應(yīng)2個(gè)不同的FRO蛋白亞型。

2. 6 木薯NOX蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

利用SWISS-MODEL構(gòu)建木薯NOX蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型（圖6）。木薯NOX蛋白三維模型與模板的相似度為0.32～0.37，且不同NOX蛋白的三維結(jié)構(gòu)也較相似，說(shuō)明NOX蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果較可靠。木薯NOX蛋白的脫氫酶結(jié)構(gòu)域明顯折疊成催化域裂縫結(jié)構(gòu)，且C端保守結(jié)構(gòu)可能參與其中，這種結(jié)構(gòu)多以FDFHKENF出現(xiàn)，推測(cè)其對(duì)FAD和NADPH的結(jié)合和反應(yīng)發(fā)揮重要作用（Magnani et al.，2017）。

2. 7 木薯NOX基因家族成員的表達(dá)譜分析結(jié)果

由圖7知，NOX基因家族成員在不同木薯組織中均有差異表達(dá)。其中，Manes.06G109600和Manes. 06G151600在葉和中脈中存在特異性表達(dá)，Manes. 06G128700和Manes.09G172500在須根和根尖分生組織中均呈高表達(dá)，Manes.08G118500和Manes.S089900在脆性胚性愈傷組織中也存在特異性表達(dá)。值得注意的是，Manes.14G042600、Manes.S089900、Manes.01G254300和Manes.06G168000在葉、中脈、葉柄和莖中均呈高表達(dá)，而在木薯的重要器官儲(chǔ)藏根中，僅Manes.14G042600和Manes.S089900高表達(dá)，推測(cè)二者是活性氧信號(hào)通路中的負(fù)向調(diào)控基因，其高表達(dá)有利于延緩木薯儲(chǔ)藏根的劣化（Zidenga et al.，2012;Xu et al.，2013）。

2. 8 干旱脅迫條件下木薯葉中NOX基因家族成員差異表達(dá)分析結(jié)果

由于木薯NOX和FRO基因在葉中有明顯表達(dá)，選取兩個(gè)代表性的木薯品種KU50和新選048，探究木薯葉中NOX基因在干旱脅迫下的差異表達(dá)，結(jié)果如圖8所示。在KU50的9個(gè)NOX基因中有3個(gè)在干旱脅迫后存在明顯的差異表達(dá)（基于log2FC>1折疊變化），即Manes.06G128700下調(diào)表達(dá)，Manes. 08G057200和Manes.14G042600則明顯上調(diào)表達(dá)。在新選048的9個(gè)NOX基因，僅Manes.02G016200、Manes.09G172500、Manes.14G023200、Manes.14G0-42600和Manes.16G092100在葉中上調(diào)表達(dá)，表明其在響應(yīng)干旱脅迫下發(fā)揮作用。另外，Manes.14G 042600在KU50和新選048中均呈明顯上調(diào)表達(dá)。

3 討論

至今，已報(bào)道了若干個(gè)不同類(lèi)型的NOX家族蛋白，包括早期的NOX蛋白雛形鐵還原酶（FREs）或鐵還原氧化酶（FROs）、NOX1～NOX5、DUOX1和DUOX2，其中，NOX5為植物所特有（Bedard et al.，2007）。在植物中，NOX被稱(chēng)為Rbohs，主要結(jié)構(gòu)包括6個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域，即C端的FAD和NADPH結(jié)合結(jié)構(gòu)域、2個(gè)血紅素輔基基團(tuán)和2個(gè)N端Ca2+結(jié)合的EF手性基序，根據(jù)這些結(jié)構(gòu)基序可知Ca2+的調(diào)控方式（Geiszt，2006;Sagi and Fluhr，2006）。本研究發(fā)現(xiàn)，木薯NOX蛋白C端具有保守的氨基酸殘基，與上述前人結(jié)果一致，但其氨基酸殘基基序FDFHKENF不同于其他物種，推測(cè)其為木薯所特有。

前人研究表明，早期藻類(lèi)植物基因組中只含極少數(shù)的FRO基因，不含NOX基因，如團(tuán)藻和衣藻中分別含有1個(gè)和3個(gè)FRO基因（Chang et al.，2016）;苔蘚植物小立碗蘚基因組含有5個(gè)NOX基因和6個(gè)FRO基因，卷柏中含有9個(gè)NOX基因和8個(gè)FRO基因（Chang et al.，2016）;擬南芥基因組中含有10個(gè)NOX基因和8個(gè)FRO基因;水稻基因組含有9個(gè)NOX基因和2個(gè)FRO基因，玉米基因組含有14個(gè)NOX基因和2個(gè)FRO基因，小麥基因組中含有36個(gè)NOX基因和10個(gè)FRO基因（Hu et al.，2018）。本研究發(fā)現(xiàn)木薯基因組含有15個(gè)NOX基因家族成員，包括9個(gè)NOX基因和6個(gè)FRO基因。可見(jiàn)，從數(shù)量上來(lái)看，隨著生物的進(jìn)化，NOX蛋白從無(wú)到有，數(shù)量逐漸增多，所占比例也逐漸增大。本研究還發(fā)現(xiàn)，木薯NOX蛋白的平均相對(duì)分子量和氨基酸數(shù)明顯高于FRO蛋白，與Hu等（2018）對(duì)小麥NOX基因家族成員的研究結(jié)果一致，推測(cè)在進(jìn)化過(guò)程中FRO基因發(fā)生基因擴(kuò)張和重排，逐漸進(jìn)化為NOX基因。在基因結(jié)構(gòu)方面，擬南芥、水稻和大麥的多數(shù)NOX基因含有10～14個(gè)外顯子，僅有少數(shù)NOX基因如擬南芥的AtRbohD含有8個(gè)外顯子（Kaya et al.，2014）。本研究中，木薯NOX基因的外顯子數(shù)為11～14個(gè)，平均為13個(gè)，與水稻、擬南芥和大麥基本一致，表明NOX基因結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過(guò)程中保持相對(duì)穩(wěn)定，其原因可能是木薯與擬南芥、水稻和大麥等物種處在同一進(jìn)化梯度。NOX家族蛋白均屬于跨膜蛋白，大多數(shù)物種如水稻和草莓等含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（Sagi and Fluhr，2006;Zhang et al.，2018）。但本研究發(fā)現(xiàn)木薯NOX蛋白均只含4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，而FRO蛋白含6～9個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，少于水稻和草莓。另外，F(xiàn)RO作為NOX的祖先蛋白，還保留其自有的結(jié)構(gòu)功能域，如Motif3是木薯FRO蛋白所特有，不存在于NOX蛋白中，由此推測(cè)木薯FRO蛋白除進(jìn)化為NOX蛋白外還具有其他功能，有待進(jìn)一步挖掘。

在水稻中過(guò)表達(dá)OsNOX9基因能介導(dǎo)根的形成（Yamauchi et al.，2017），在玉米中ZmNOX13和ZmNOX7基因參與調(diào)控根發(fā)育（Rajhi et al.，2011）。因此，推測(cè)木薯儲(chǔ)藏根中高表達(dá)的基因Manes.14G04- 2600和Manes.S089900具有類(lèi)似的功能，參與調(diào)控木薯儲(chǔ)藏根的發(fā)育。在擬南芥葉片中，AtRbohD基因通過(guò)響應(yīng)脫落酸激素的信號(hào)傳導(dǎo)而控制氣孔開(kāi)合（Chaouch et al.，2012），推測(cè)木薯葉片中差異表達(dá)的NOX基因Manes.02G016200、Manes.06G128700、Manes.08G057200、Manes.09G172500、Manes.14G0-42600和Manes.16G092100與AtRbohD基因具有類(lèi)似功能，參與到活性氧的信號(hào)通路中。由于植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中面臨各種環(huán)境脅迫，包括生物性脅迫和非生物脅迫（Mittler et al.，2011;Dietz et al.，2016），而活性氧作為重要的信號(hào)分子參與組織間及細(xì)胞間的信息運(yùn)輸，是響應(yīng)脅迫激發(fā)生理變化的重要物質(zhì)（Liang et al.，2018）。至今尚未清楚木薯NOX基因家族成員的功能及調(diào)控機(jī)制，為此，本研究采用生物信息學(xué)方法分析木薯NOX基因家族成員的特征，發(fā)現(xiàn)木薯NOX基因家族成員均具有其特定的表達(dá)模式，有利于今后深入研究該家族成員對(duì)木薯塊根發(fā)育的調(diào)控功能及提高植株抗非生物脅迫的能力。此外，在后續(xù)研究中，將對(duì)NOX基因家族成員進(jìn)行轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，分析其對(duì)木薯塊根發(fā)育的具體表型效應(yīng)影響。

4 結(jié)論

木薯NOX基因家族成員具有保守基因結(jié)構(gòu)，其編碼蛋白具有保守的功能域，尤其是C末端氨基酸序列;NOX基因的表達(dá)具有組織特異性，且部分成員的表達(dá)受非生物脅迫影響。FRO蛋白和NOX蛋白具有較明顯的共進(jìn)化關(guān)系。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）