王勝 龔毅 袁青青 劉曉龍 錢海兵

[摘要]目的研究苗藥小血藤對(duì)缺血性腦卒中大鼠的治療作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制。方法用改良線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（middlc cerebral artery occlusion，MCAO）模型。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性組、苗藥小血藤高、中、低劑量組（3.75、1.875、0.9375g/kg），給予相應(yīng)藥物1次/d灌胃給藥，連續(xù)7d。TTC染色觀察腦梗死面積;試劑盒檢測(cè)血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）含量;HE染色觀察腦組織病理改變。結(jié)果與模型組比較，小血藤水煎液各劑量組腦梗死面積明顯減少（P<0.05），大鼠腦組織勻漿中所含SOD活性顯著提高（P<0.05）;MDA含量顯著降低（P<0.05）;HE染色發(fā)現(xiàn)，小血藤水煎液各劑量組可一定程度上改善MCAO大鼠海馬區(qū)病理?yè)p傷。結(jié)論小血藤水煎液對(duì)MCAO導(dǎo)致的腦缺血大鼠可以減少梗死面積，促進(jìn)其神經(jīng)功能恢復(fù)，對(duì)缺血造成的損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與小血藤抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]小血藤;缺血性腦卒中;超氧化物歧化酶;丙二醛

[中圖分類號(hào)]R255.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.009

苗藥小血藤，為茜草科（Rubiaceae）茜草屬RubiaLinn，植物茜草Rubia cordifolia L的根，其主要功效為涼血止血，活血化瘀。小血藤在苗族地區(qū)被廣泛運(yùn)用于體虛血少患者，治月經(jīng)不調(diào)、鼻腔出血以及痔瘡等。前期藥理學(xué)研究表明，其具有保護(hù)神經(jīng)、抗炎免疫、解聚血小板聚集等作用，所含茜草多糖具有延緩腦細(xì)胞衰老的作用，可通過(guò)上調(diào)Bel-2蛋白的表達(dá)，保護(hù)線粒體避免cyt C的釋出，提高線粒體Ca²⁺緩沖含量，從而達(dá)到抑制腦細(xì)胞凋亡的作用。本研究擬觀察小血藤對(duì)缺血腦損傷大鼠的保護(hù)作用，并初步探討其可能的機(jī)制，以期為后續(xù)進(jìn)行小血藤抗腦缺血藥物的研究提供藥理學(xué)研究基礎(chǔ)。

1材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2014-0011。飼養(yǎng)室溫20-25℃，濕度50%-70%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前1周進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，體質(zhì)量（270±20）g。

1.2藥物

苗藥小血藤由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室提供（水煎濃縮液相當(dāng)于生藥材1s/mL，4℃保存?zhèn)溆茫?尼莫地平片，亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司（批號(hào)20181024）。

1.3 試劑

水合氯醛，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)20180627）;HE染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司（批號(hào)20180820）;TTC染劑，北京索萊寶科技有限公司（批號(hào)10110031）;MDA測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所（批號(hào)20181226）;SOD測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所（批號(hào)20181220）。

1.4 儀器

酶標(biāo)儀（北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司）：組織包埋機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）;組織切片機(jī)（萊卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易公司）;電子天平（北京艾科勒有限公司）;隔水式電熱恒溫箱（蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司）;醫(yī)用離心機(jī)（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）;移液器（德國(guó)Eppendorf公司）。

2方法

2.1 造模及造模成功判定

參照Longa改良線栓法制備大鼠右側(cè)永久性大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。造模?4h，采用盲法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分（參照Bederson和Longa等5級(jí)4分的評(píng)分篩選法）。1-3分的大鼠即造模成功。將得0分和4分者剔除。

0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損，提起鼠尾懸空時(shí)兩前肢向地面伸直：1分：輕微神經(jīng)功能缺損，提起鼠尾懸空時(shí)手術(shù)對(duì)側(cè)前肢屈曲，肩內(nèi)收，前臂伸直;2分：中度神經(jīng)功能缺損，向病灶對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈的現(xiàn)象：3分：重度神經(jīng)功能缺損，向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒，無(wú)法行走;4分：無(wú)自主活動(dòng)伴意識(shí)障礙。

2.2 分組及給藥方法

將造模成功的MCAO大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，陽(yáng)性組，苗藥小血藤高、中、低劑量組，每組10只：術(shù)后24h，每組大鼠開始給予相應(yīng)藥物干預(yù)，1次/d，灌胃給藥，連續(xù)7d：小血藤水煎液高、中、低劑量組按3.75、1.875、0.9375g（kg·d）灌胃（分別相當(dāng)于人臨床擬用量的15倍、7.5倍、3.75倍）：陽(yáng)性組給予尼莫地平片水溶液，15mg（kg·d）灌胃（相當(dāng)于人臨床擬用量的7.5倍）：假手術(shù)組與模型組同體積生理鹽水灌胃。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 血清SOD、MDA測(cè)定 取材前所有大鼠禁食不禁水12h，并于末次給藥2h后稱體質(zhì)量記錄，大鼠仰位固定，4%水合氯醛（0.75mL/100g）腹腔注射麻醉;腹主動(dòng)脈取血，靜置30min后，分離出血清（3000r/min，15min），按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清SOD活性與MDA含量。

2.3.2TTC染色測(cè)定腦梗死面積 腹主動(dòng)脈取血后，迅速斷頭，自大腦縱裂將腦剪開，放置于冰盤上取出大腦，立即放人-20℃低溫冰箱冷凍30min，剔除掉嗅球和小腦，于局灶缺血的中部做2mm冠狀切片，每只大鼠采集腦片5-6片，切好腦組織在TTC溶液中浸沒染色，37℃恒溫培養(yǎng)箱避光染色30min，每隔15min翻面1次，染色后，用4%多聚甲醛溶液將其固定。正常腦組織染色呈深紅色，梗死灶呈蒼白色。觀察并拍照記錄，用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)腦梗死面積比例。

2.3.3 腦組織病理形態(tài)觀察 將固定于4%多聚甲醛中的大鼠腦組織取出，通過(guò)常規(guī)脫水、石蠟包埋切片、HE染色、封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)變化。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料均以“x±s”表示，采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差（one-way ANOVA）分析，組間比較方差齊時(shí)用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Dunnetts T3檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1 小血藤對(duì)大鼠血清SOD、MDA含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組SOD含量明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，給藥各組大鼠血清的SOD活力明顯上升（P<0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組MDA含量明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠血清MDA含量明顯下降（P<0.05）。結(jié)果見表1。

3.2 小血藤對(duì)腦缺血后大鼠腦梗死面積的影響

非缺血損傷腦組織TFC染色呈紅色，缺血區(qū)域腦組織TTC染色呈白色。詳見圖1。缺血面積統(tǒng)計(jì)表明，模型組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯手術(shù)后梗死。與模型組相比較，各給藥組大鼠腦組織梗死面積顯著減少（P<0.05）。詳見表2。

3.3 小血藤對(duì)腦缺血后大鼠腦組織病理形態(tài)改變的影響

大鼠腦組織HE染色觀察，光鏡下觀察各組大鼠海馬錐體細(xì)胞的病理改變情況。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬腦組織皮質(zhì)較薄，細(xì)胞數(shù)量較少，結(jié)構(gòu)欠清晰，局灶性細(xì)胞水腫溶解，神經(jīng)元細(xì)胞染色深。與模型組比較，小血藤水煎液各劑量組和陽(yáng)性組大鼠海馬區(qū)損傷減輕，細(xì)胞數(shù)量較多，排列較為整齊。詳見圖2。

4討論

腦卒中又稱中風(fēng)，是一種突發(fā)的腦血管疾病，其中缺血性腦卒中約占全部腦卒中的80%左右，主要是由于大腦血栓的形成或栓塞引起急性局部大腦供血不足導(dǎo)致，同時(shí)大腦有限的代償能力不足以彌補(bǔ)血液減少或中止時(shí)大腦儲(chǔ)存的能量衰竭引起的腦組織缺血性損傷。病理?yè)p傷可分為缺血中心區(qū)和缺血半暗帶兩類，前者腦細(xì)胞往往在缺血后不可逆壞死，后者則大腦側(cè)支循環(huán)損傷較輕，其中由葡萄糖的代謝功能障礙產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)損傷是缺血半暗帶產(chǎn)生的主要因素。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是腦卒中早期重要的損傷機(jī)制，缺血時(shí)活性氧的增加通過(guò)耗竭內(nèi)源性的抗氧化物質(zhì)，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起細(xì)胞膜、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的損傷，H₂O₂，損傷細(xì)胞膜影響細(xì)胞離子通道的通透性，增加鈣離子內(nèi)流是增加氧化損傷的因素之一。SOD作為生物體內(nèi)非常重要的抗氧化酶一種蛋白酶，SOD活性的高低反映機(jī)體清除氧自由基的能力，可減少ROS對(duì)細(xì)胞膜的損傷，降低說(shuō)明體內(nèi)抗氧化能力不足，細(xì)胞將產(chǎn)生應(yīng)激性反應(yīng)從而引起氧化應(yīng)激損傷?？梢源呋趸镒杂苫缁?，清除自由基，發(fā)揮抗氧化作用，也是氧化損傷中生物體內(nèi)的主要防御機(jī)制。MDA是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其在體內(nèi)的含量在一定程度上表明過(guò)氧化應(yīng)激造成的損害程度。有研究表明尼莫地平可抑制H₂O₂誘導(dǎo)的鈣超載損傷、降低血管對(duì)鈣的敏感性、抑制H₂O₂對(duì)血管的直接收縮，防止H₂O₂對(duì)血管的氧化應(yīng)激性損傷;明顯降低腦血管組織勻漿中的MDA含量，增強(qiáng)SOD等活性，具有一定的抗氧化保護(hù)腦損傷作用。中藥黃芪、人參等可改善腦組織代謝、抗氧化應(yīng)激，減輕腦組織損傷。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，小血藤不同劑量組大腦組織的SOD活力明顯上升（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05），表明小血藤可以減輕因缺血而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

缺血后腦梗死面積直接反映了損傷程度，因此對(duì)腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ瓦M(jìn)行腦組織梗死面積的測(cè)定對(duì)于評(píng)價(jià)腦缺血損傷程度具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，小血藤對(duì)腦缺血導(dǎo)致的腦梗死面積具有明顯的減輕作用。HE染色，在光鏡下觀察各組大鼠海馬錐體細(xì)胞的病理改變情況。結(jié)果顯示，與模型組比較，小血藤水煎液各劑量組和陽(yáng)性組大鼠海馬病變程度總體較輕，提示小血藤水煎液能改善MCAO大鼠腦組織海馬損傷。

綜上表明，小血藤水煎液可明顯減少M(fèi)CAO大鼠腦缺血組織的范圍和界限，在一定程度上具有改善MCAO大鼠海馬損傷的功能，其機(jī)制可能與通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的相應(yīng)指標(biāo)，提高機(jī)體抗氧化水平，增強(qiáng)修復(fù)能力有關(guān)，其他方面的機(jī)制是否與鈣離子通道有關(guān)等，尚待深入研究。