陳雨晴 呂峰 王金銘

摘要：[目的]優(yōu)化鋅螯合法提純石莼多酚工藝，評價提純前后樣品的抗氧化活性。[方法]以石莼多酚鋅螯合率為指標，單因素試驗初步探討鋅鹽種類、氯化鋅質量濃度、石莼乙醇粗提物質量濃度、乙醇體積分數(shù)、反應時間、pH等6個因素對石莼多酚螯合鋅的影響，并通過響應面法優(yōu)化其關鍵工藝參數(shù);以石莼多酚鋅螯合物解離率為指標，確定解離劑EDTA質量濃度;比較分析提純前后樣品對ABTS·、DPPH·、·OH的清除能力。[結果]以83%乙醇溶液為溶劑，配制質量濃度為6.8mg·mL的石莼乙醇粗提物樣液，控制氯化鋅質量濃度15.0mg·mL，pH8.0為優(yōu)化提純條件;此外，控制螯合反應時間30min，解離劑EDTA質量濃度20mg·mL，提純后樣品中的石莼多酚含量由粗提物的6.95%增至25.18%，純度提高了2.62倍。石莼乙醇粗提物與提純物均具有良好的體外抗氧化活性，對3種自由基的清除能力順序為·OH>DPPH·>ABTS·。相比粗提物，提純物對ABTS·、DPPH·、·OH的清除能力分別提高了5.12、8.35、11.70倍，且當質量濃度分別達到16、12、8mg·mL后，對應的清除能力與Vc無顯著性差異。[結論]經(jīng)過工藝優(yōu)化的鋅螯合法可以顯著提高石莼乙醇粗提物中的多酚含量及其體外抗氧化活性，為石莼多酚的深層次開發(fā)應用提供參考依據(jù)。

關鍵詞：鋅螯合法;石莼多酚;響應面法;抗氧化活性

中圖分類號：TS254.9文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）12-1447-10

0 引言

[研究意義]石莼Ulva lactuca隸屬于綠藻門，多生長于水質肥沃的海灣，全年均有生長;主要分布于西太平洋沿海地區(qū)如日本、中國、朝鮮等，是我國黃海、渤海產(chǎn)量最多的大型經(jīng)濟綠藻，資源極為豐富。相關研究表明，石莼中含有多酚類物質，其因獨特的化學結構具有抗氧化、抑菌等生物活性，在食品及醫(yī)藥行業(yè)極具開發(fā)前景，因而尋找高效、便捷的多酚提取純化方法也成為藻類功能成分研究的熱點之一。[前人研究進展]目前，常用多酚純化方法包括大孔樹脂吸附法、膜分離法、高效液相色譜法等，這些方法普遍存在成本高、生產(chǎn)周期長、難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化等缺點。金屬螯合法是利用多酚分子中的多個鄰位酚羥基結構作為配體與金屬離子發(fā)生配位反應，降低多酚的水溶性而形成螯合物沉淀，實現(xiàn)多酚與非酚類物質的分離;再通過解離劑溶解沉淀物，使多酚游離出來而實現(xiàn)純化。該方法具有周期短、成本低、易操作等優(yōu)勢，雖然所得產(chǎn)品的純度有一定局限性，但容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，仍具有潛在的應用價值。[本研究切入點]關于鋅螯合法提純石莼多酚工藝優(yōu)化及其抗氧化活性評價目前尚未見報道。[擬解決的關鍵問題]本研究以石莼乙醇粗提物為試材與參照物，采用鋅螯合法提純其中的石莼多酚，通過響應面法優(yōu)化石莼多酚提純工藝;并對提純前后樣品的體外抗氧化活性進行評價，以期為海藻多酚的深層次開發(fā)利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料與設備

石莼粉：80目，購于福建海興保健食品有限公司;

乙醇溶液、碳酸鈉、檸檬酸、氯化鋅、乙酸鋅、硫酸鋅、乙二胺四乙酸（EDTA）：均為食品級;沒食子酸、福林酚試劑：均為分析純;

SK8210LHC超聲波清洗器：上海滬粵明科學儀器有限公司;RE52-99旋轉蒸發(fā)器：河北云端化工儀器設備有限公司;DL-5-B型低速大容量多管離心機：上海安亭科學儀器廠;SepectraMax i3X酶標儀：美谷分子儀器有限公司;FreeZone 6L落地式凍干機：美國LABCONCO公司;79-1型磁力攪拌器：金壇市國旺實驗儀器廠;PT-20便捷式pH計：河南中良科學儀器有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1石莼乙醇粗提物制備 準確稱取一定量石莼粉末，60%乙醇溶液為溶劑，以料液比1：20，超聲波功率400w，提取時間100mm，提取溫度45℃為條件，制備石莼乙醇浸提液，并將其濃縮至原體積5%左右，按1：5比例加無水乙醇靜置過夜，除去蛋白質與多糖，將上清液真空濃縮后冷凍干燥即為石莼乙醇粗提物（多酚含量為6.95%）。

1.2.2鋅螯合法提純石莼多酚制備工藝優(yōu)化準確稱取一定量石莼乙醇粗提物，用一定濃度的乙醇溶液配制成一定質量濃度的石莼乙醇粗提物樣液，在攪拌條件下以1：1比例緩慢加入一定濃度的鋅鹽溶液，用碳酸鈉溶液調節(jié)反應體系pH，待螯合反應完全后，收集沉淀物，將其分散于乙醇溶液中，加入一定濃度的EDTA進行解離，收集解離液真空濃縮后冷凍干燥，所得物為石莼乙醇提純物。

在單因素試驗中，分別設鋅鹽質量濃度20.0mg·mL，乙醇體積分數(shù)60%，反應時間20min，pH7.0，石莼乙醇粗提物質量濃度10.0mg·mL，EDTA質量濃度10mg·mL，待獲得某因素理想水平后，則以其為條件繼續(xù)后續(xù)其他因素試驗，考察各因素對石莼多酚純化效果的影響;選取對石莼多酚鋅螯合率具有極顯著影響的因素，進一步采用響應面法優(yōu)化石莼乙醇粗提物中多酚螯合鋅的反應條件，各因素與水平見表1。

1.2.3指標與檢測方法

（1）多酚含量測定參照Pereira等的方法稍作修改，采用Folin-Ciocalteu法對溶液中的多酚含量進行測定。

（2）石莼多酚鋅螯合率測定

式中：C-螯合反應后上清液的石莼多酚濃度（mg·mL）;V-螯合反應后上清液的體積（mL）;C-螯合反應前樣液的石莼多酚濃度（mg·mL）;V-螯合反應前樣液的體積（mL）。

（3）石莼多酚鋅螯合物解離率測定

式中：C-螯合反應前樣液的石莼多酚濃度（mg·mL）;C-螯合反應后上清液的石莼多酚濃度（mg·mL）;C-解離反應后濾液的石莼多酚濃度（mg·mL）。

（4）體外抗氧化活性測定

配置質量濃度為2、4、8、12、16、24、32、40mg·mL的石莼乙醇粗提物與提純物的水溶液，以相同質量濃度的Vc為對照組，分別進行體外抗氧化活性評價。對DPPH·、ABTS+·、·OH等3種自由基清除能力的測定參照文獻。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin Lab 2017軟件對試驗數(shù)據(jù)進行作圖分析;采用DPS v7.05軟件以Duncan新復極差法對各單因素的均值進行差異顯著性檢驗，顯著性界值以P<0.01為極顯著，P<0.05為顯著，P>0.05為不顯著;采用Design Expert 8.0.5軟件設計響應面試驗，并進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 鋅螯合法提純石莼多酚的單因素試驗結果

2.1.1 不同鋅鹽對石莼多酚鋅螯合率的影響不同鋅鹽的陰陽離子之間的作用力有所不同，與多酚的配位能力也有所差異，從而影響其與多酚的螯合能力。圖l結果顯示，在同樣的條件下，3種鋅鹽均能與石莼乙醇粗提物中的多酚進行螯合反應，其中氯化鋅與石莼多酚的螯合能力為47.45%，極顯著（P<0.01）強于乙酸鋅（42.14%）和硫酸鋅（37.33%），故確定氯化鋅作為后續(xù)提純石莼多酚試驗的鋅鹽。

2.1.2氯化鋅溶液濃度對石莼多酚鋅螯合率的影響如圖2所示，氯化鋅質量濃度為10～20mg·mL，石莼多酚鋅螯合率上升至最大值（49.87%）;繼續(xù)提高氯化鋅質量濃度，石莼多酚鋅螯合率呈下降趨勢后趨于穩(wěn)定。當鋅離子含量過少時，石莼乙醇粗提物中的多酚與鋅離子反應不充分，造成螯合率偏低;隨著氯化鋅質量濃度的增加，鋅離子與石莼多酚濃度逐漸達到理想摩爾比，有助于螯合反應的進行;但繼續(xù)加大氯化鋅質量濃度，過多的氯化鋅可能導致溶液pH變小，破壞石莼多酚鋅螯合物的穩(wěn)定性，致使螯合率有所下降。因此，確定與石莼乙醇粗提物中多酚進行螯合反應的氯化鋅質量濃度為20mg·mL左右較為合適。

2.1.3 乙醇體積分數(shù)對石莼多酚鋅螯合率的影響圖3顯示，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，石莼乙醇粗提物中多酚鋅螯合率呈極顯著（P<0.01）上升趨勢，當乙醇體積分數(shù)為80%時，石莼多酚鋅螯合率達到最高值（51.10%）;若繼續(xù)提高乙醇體積分數(shù)，石莼多酚鋅螯合率反而減小。作為反應媒介，乙醇溶液的極性直接影響溶質成分的溶解程度。隨乙醇體積分數(shù)的增加，乙醇溶液與石莼多酚的極性逐漸接近，有助于酚類物質的溶出，從而促進石莼多酚與鋅離子的螯合反應;若乙醇溶液濃度過高，則可能促進粗提物中極性較大物質的溶出，反而干擾了石莼多酚與鋅離子的螯合反應。故確定80%乙醇溶液為本研究石莼多酚螯合鋅反應的適宜溶劑。

2.1.4反應時間對石莼多酚鋅螯合率的影響圖4結合統(tǒng)計分析可知，在反應時間為10～30min，樣液中石莼多酚鋅螯合率隨時間的增大而提高至最高值（47.81%）;反應時間超過30min后，石莼多酚鋅螯合率無顯著（P>0.05）提高。當反應時間不充足時，樣液中的石莼多酚與鋅離子反應不完全而影響螯合效果;隨著時間的延長，螯合反應逐漸完成并達到最高螯合率;若再繼續(xù)延長時間則影響不大。故從節(jié)約時間、成本的角度考慮，控制反應時間為30min左右較為經(jīng)濟適宜。

2.1.5反應體系pH對石莼多酚鋅螯合率的影響圖5可知，反應體系pH為5.0～8.0，石莼多酚鋅螯合率隨pH的增大而極顯著（P<0.01）提高至最大值（50.15%）;在8.0～10.0，繼續(xù)增加pH，石莼多酚鋅螯合率呈極顯著（P<0.01）下降趨勢。相關文獻表明，反應體系pH是影響多酚類物質與金屬離子螯合反應的關鍵因素。pH的增大會促進酚羥基中H的解離，可有效提高多酚與金屬的螯合率;反之，pH過高，多酚易被氧化成醌類物質，鋅離子的水解反應占據(jù)主體減弱其配位能力，亦影響螯合效果。故本研究確定石莼乙醇粗提物中多酚螯合鋅反應體系的理想pH為8.0左右。

2.1.6石莼乙醇粗提物質量濃度對石莼多酚鋅螯合率的影響

圖6顯示，當石莼乙醇粗提物質量濃度為6mg·mL時，鋅螯合分離粗提物中多酚的效果最好（57.16%）;繼續(xù)增大或降低其濃度，石莼多酚鋅螯合率均呈極顯著（P<0.01）下降趨勢。在石莼乙醇粗提物中，除了酚類物質外，還有其他成分，如多糖、蛋白質等也能與鋅離子反應生成螯合物，但螯合能力各不相同。低濃度時，粗提物中石莼多酚含量較少，與鋅離子的螯合反應不完全;反之，當粗提物質量濃度過高時，雖石莼多酚含量有所提高，但其他成分濃度也隨之增加，甚至可能增加的絕對量超過多酚類物質，同石莼多酚競爭與鋅離子發(fā)生螯合反應的趨勢愈加明顯，造成石莼多酚鋅螯合反應減弱。鑒于此，本研究確定石莼乙醇粗提物質量濃度為6mg.mL-1是石莼多酚螯合鋅反應的適宜濃度。

2.2 響應面法優(yōu)化工藝參數(shù)

2.2.1 回歸方程的建立與方差分析采用Desi2nExpCd 8.0.5統(tǒng)計分析軟件對表2數(shù)據(jù)進行處理，建立乙醇體積分數(shù)（X）、反應體系pH（X）、氯化鋅質量濃度（X）和石莼乙醇粗提物質量濃度（X）4個因素與響應值石莼多酚鋅螯合率Y的回歸方程為：

由表3數(shù)據(jù)顯示，石莼多酚鋅螯合率r方程回歸模型極顯著（P<0.0001），失擬項不顯著（P=0.4632>0.05），決定系數(shù)R=0.9908，調整決定系數(shù)R=0.9816，變異系數(shù)CV=1.19%，提示石莼多酚鋅螯合率的預測值與試驗所得實際值擬合度良好，可用來分析預測石莼多酚鋅螯合率。

2.2.2 因素間的交互作用 結合表3分析結果可知，XIX2（乙醇體積分數(shù)和反應體系pH）、XX（乙醇體積分數(shù)和氯化鋅質量濃度）、XX（氯化鋅質量濃度和石莼乙醇粗提物質量濃度）的交互作用對石莼多酚鋅螯合率r有極顯著（P<0.01）影響。

圖7（a）顯示，當石莼乙醇粗提物質量濃度X<6.53mg·mL與氯化鋅質量濃度X<17.65mg·mL時，石莼多酚鋅螯合率隨二者水平的增加呈極顯著（P<0.01）上升趨勢;當二者的濃度分別超過此范圍后，石莼多酚鋅螯合率Y呈下降趨勢。由圖7（b）可知，乙醇體積分數(shù)X<79.45%，氯化鋅質量濃度X<20.95mg·mL時，二者的交互作用對石莼多酚鋅螯合率Y的影響呈極顯著（p<0.01）正相關關系;繼續(xù)提高二者的濃度，則對石莼多酚鋅螯合率Y呈負相關關系。圖7（c）顯示，與反應體系pHX相比，乙醇體積分數(shù)X曲線較為平緩，對石莼多酚鋅螯合率Y的影響不明顯;在試驗范圍內，石莼多酚鋅螯合率Y隨反應體系pH呈極顯著（P<0.01）先上升后下降的趨勢;當乙醇體積分數(shù)為80.10%，反應體系pH為7.97時，石莼多酚鋅螯合率r達到最大值。

2.3 工藝條件優(yōu)化與驗證試驗

使用Design Expert 8.0.5對回歸方程進行求解，得出鋅螯合法提純石莼多酚的最佳工藝條件組合為：乙醇體積分數(shù)82.58%，反應體系pH 7.96，氯化鋅質量濃度15.05mg·mL，石莼乙醇粗提物質量濃度6.77mg·mL，同時控制反應時間30min，所得石莼多酚鋅螯合率的預測值為62.24%;為提高實際操作的便利性，將上述優(yōu)化組合條件修正為：乙醇體積分數(shù)83%，反應體系pH 8.0，氯化鋅質量濃度15.0mg·mL，石莼乙醇粗提物質量濃度6.8mg·mL，并以此為條件，進行擴大性驗證試驗，平行重復三次，所得樣品的石莼多酚鋅螯合率平均值為61.52%，與理論預測值（62.24%）相對誤差為0.72%，無顯著性差異（P>0.05），說明預測值與實際值擬合性較好，響應面得到的工藝參數(shù)準確可靠，在實際生產(chǎn)中可行。

2.4 EDTA用量對石莼多酚鋅螯合物解離效果的影響

EDTA螯合金屬的能力強于酚類物質，故可用EDTA解離多酚金屬螯合物以提純多酚類物質。圖8顯示，在5～20mg·mL濃度范圍內，石莼多酚鋅螯合物的解離率與EDTA質量濃度呈極顯著（P<0.01）正相關關系，解離率由33.98%增加至最大值85.82%;繼續(xù)提高EDTA質量濃度，解離率則有所下降。當EDTA質量濃度過高時，亦可解離反應體系中非酚物質與鋅的螯合物而影響最終樣品純度，且過量的EDTA會帶來一定的安全隱患。故從解離效果與安全角度考慮，本研究確定EDTA質量濃度為20mg·mL左右較為適宜。

綜上，采用優(yōu)化的鋅螯合工藝條件制備石莼多酚鋅螯合物，再經(jīng)EDTA解離后，樣品的石莼多酚含量從粗提物中的6.95%增至25.18%，純度提高了2.62倍，說明鋅螯合法提純石莼多酚的效果良好。

2.5體外抗氧化活性的測定

圖9顯示，在試驗濃度范圍內，石莼乙醇粗提物樣液對AB子S·、DPPH·、·OH的清除能力呈極顯著（P<0.01）的劑量效應，當其質量濃度為40mg·mL時，對3種自由基的清除率均達到最大值（依次為74.94%、79.12%、81.93%）;隨著質量濃度的增加，石莼乙醇提純物樣液在16、12、8mg·mL時，對ABTS·、DPPH·、·OH的清除率分別極顯著（P<0.01）上升至94.89%、92.33%、94.86%，繼續(xù)提高質量濃度，清除率均趨于穩(wěn)定，且與對照組Vc無顯著（P>0.05）差異。石莼乙醇粗提物與提純物對ABTS.清除能力的IC分別為3.83、19.64mg·mL，對DPPH·清除能力的IC分別為2.22、18.54mg·mL，對·OH清除能力的IC分別為1.35、15.80mg·mL，即相同條件下提純物對ABTS·、DPPH·、·OH清除能力分別是粗提物的5.12、8.35、11.70倍。

海藻多酚的抗氧化活性得益于其分子上的酚羥基團，能捕獲并清除活性能力極高且瞬間即逝的自由基;能釋放H，終止氧化鏈式反應;能與金屬離子螯合，減少金屬離子對氧化反應的催化作用。上述研究結果表明，一定質量濃度的石莼乙醇提純物具有與同質量濃度Vc相當?shù)淖杂苫宄芰?石莼乙醇提純物的體外抗氧化活性極顯著（P<0.01）高于粗提物，揭示樣品的體外抗氧化活性與其多酚含量呈正相關關系;通過比較ABTS·、DPPH·、·OH清除能力的IC可知，石莼乙醇粗提物與提純物對三種自由基的清除能力為·OH>DPPH·>ABTS·。

3討論與結論

本研究采用響應面法優(yōu)化獲得鋅螯合法提純石莼多酚的關鍵工藝參數(shù)組合為：乙醇溶液濃度83%，石莼乙醇粗提物樣液質量濃度6.8mg·mL，氯化鋅溶液濃度15.0mg·mL-1，pH 8.0。在該條件下，結合反應時間30min，所得樣品的石莼多酚鋅螯合率平均值為61.52%，與理論預測值（62.24%）無顯著性差異（P>0.05）;在此基礎上，添加質量濃度為2.0%的EDTA進行解離，所得石莼乙醇提純物中的多酚含量為25.18%，相比其粗提物（多酚含量6.95%）多酚純度提高了2.62倍。體外抗氧化活性評價表明，在本試驗濃度范圍內，石莼乙醇粗提物與提純物對3種自由基的清除能力均為：·OH>DPPH·>ABST·;提純物對ABTS、DPPH·、·OH的清除能力分別是粗提物的5.12、8.35、11.70倍，當質量濃度分別達到16、12、8mg·mL時，提純物的ABTS·、DPPH·、·OH清除率與V無顯著性差異。

金屬螯合法是利用石莼多酚分子中的酚羥基團與鋅離子發(fā)生配位反應，形成多酚-鋅螯合物實現(xiàn)多酚與非酚類物質的分離;再通過EDTA解離該螯合物，使多酚游離出來而實現(xiàn)純化，具有成本低，生產(chǎn)周期短，可實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)勢。相關研究表明抗氧化活性是多酚最為突出而普遍的生物活性，其得益于多酚分子上的酚羥基能釋放氫離子，終止氧化鏈式反應;能捕獲并清除活性極高且瞬間即逝的自由基;能螯合金屬離子，減少其對氧化反應的促進作用，且抗氧化活性與多酚含量成量-效關系。本試驗顯示鋅螯合法提純石莼多酚效果良好，其乙醇提純物相比粗提物具有更強的抗氧化活性。這與前人報道一致，采用金屬絡合法純化后的大果沙棘黃酮含量明顯提高，黃酮含量由9.1%提高至52.1%;銀杏黃酮以乙酸鋅為螯合劑，EDTA為解離劑，其在最佳條件下使黃酮純度提高了2.3倍，抗氧化活性亦顯著增強。近幾年，金屬螯合法多應用于茶、果蔬等陸生植物酚類物質的分離純化領域，但對海洋藻類的應用尚未見報道。本研究嘗試采用鋅螯合法分離純化石莼多酚，但提純程度不夠理想，這可能是海藻中酚類物質含量相較于陸生植物更低，因而不易聚集形成金屬離子螯合物基團。今后仍需逐步完善此工藝，以期提高多酚純度。此外，提純前后的樣品中酚類物質的主要成分是否發(fā)生變化目前亦不清楚，因此可在后續(xù)試驗中通過HCLP來加以檢測分析，進一步為海藻多酚深層次開發(fā)利用提供理論基礎。