鄭珂暉 黎哲鎮(zhèn) 葉景山 周富杰 溫永仙

摘要：[目的]探索基于自然群體隨機交配的單個印跡QTL的定位方法，分析影響定位準確性的關鍵因素。[方法]若印跡QTL決定的某一性狀為數(shù)量性狀，假設該性狀與標記之間的關系存在線性關系，可以采用最小二乘法進行印跡QTL定位和遺傳參數(shù)的估計。利用計算機模擬單點模擬標記、水稻真實自然群體標記進行印跡QTL定位，比較在不同最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）、不同遺傳率、不同隨機交配輪數(shù)下的統(tǒng)計功效與參數(shù)估計精度，印跡QTL的顯著性采用F檢驗和t檢驗。[結果]通過模擬研究，證明該試驗設計對于檢測單個印跡QTL是有效的，在MAF大于5%時，印跡遺傳率大于10%時，定位與遺傳參數(shù)估計趨于無偏。[結論]采用自然群體隨機交配產(chǎn)生作圖群體，可以用來進行單個印跡QTL的定位，定位的結果較好，是一種有效的試驗設計，為下一步進行多個印跡QTL奠定了基礎。

關鍵詞：自然群體;關聯(lián)分析;F檢驗;印跡QTL;隨機交配

中圖分類號：Q348文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）12136407

0 引言

[研究意義]自然群體往往不是嚴格的遺傳群體，如：種質(zhì)資源、野生種等，它一般不用通過先構建親本再進行交配產(chǎn)生F2代以后再用自交、回交等方法來產(chǎn)生。相對于結構群體，它的遺傳背景一般并不清晰，往往采用關聯(lián)分析來進行QTL定位。全基因組關聯(lián)分析”’主要基于基因的連鎖不平衡，用以判斷表型性狀與遺傳標記之間的關聯(lián)性。在全基因組上對逐點掃描遺傳標記，依次判斷每個標記與相關表型性狀的關聯(lián)水平。關聯(lián)分析方法出現(xiàn)以后，有力地推動了數(shù)量遺傳學的發(fā)展，對于水稻、玉米等作物以及豬、牛等家畜的育種改良起了重要的推動作用。印跡效應是一種表觀遺傳效應，指的是由于親本產(chǎn)生的配子根據(jù)其來源父本或母本，使得配子中某些基因呈現(xiàn)特異的表達或沉默，造成子代體細胞中某些等位基因表達活性不同的現(xiàn)象。印跡在某些植物的胚乳形成、哺乳動物的胚胎發(fā)育、人類的一些罕見疾病的形成中起著重要的作用。[前人研究進展]由于全基因組數(shù)據(jù)往往十分龐大，關聯(lián)分析對計算的要求較高。為了簡化計算，早期研究人員進行關聯(lián)分析時往往將只考慮加性效應，而忽略顯性與印跡等效應。近些年來，有部分研究人員將印跡效應引入到全基因組關聯(lián)分析中。Marcos等采用SNP作為遺傳標記，采用回歸方法來定位與豬背膘、日增重等性狀相關聯(lián)的SNP，并估計加性、顯性和印跡3種遺傳效應值。Hu等采用GWAS技術分析了印跡基因組對小鼠BMI指數(shù)的影響，研究表明印跡可以世代傳播，對小鼠的BMI指數(shù)具有一定的影響。Steven等通過研究發(fā)現(xiàn)：基因組印跡對在小鼠對于錐蟲的抗性具有重要的作用，并在小鼠染色體上定位到了與錐蟲抗性相關的3個印跡QTL。Wen等利用永久F2群體來進行印跡QTL定位，可以無偏估計印跡QTL位置和加性、顯性和印跡3種遺傳效應。[本研究切入點]自然群體的構建需要花費大量的人力與物力，若將自然群體隨機交配產(chǎn)生后代，則相對可以用較低廉的價格獲得遺傳信息豐富的群體。目前，基于自然群體隨機交配的方法來定位印跡QTL目前尚未見到報道。由于基因組印跡具有親本特異的特點，所以，在進行印跡QTL定位時，需要知道某個株系的父本或母本。直接采用自然群體不能夠直接進行印跡QTL的定位，但可以將自然群體作為初始群體，進行隨機交配，產(chǎn)生F2群體，可以用較小的初始群體來獲得一個大的F2群體，該群體包含的遺傳重組事件較為豐富，可以用作印跡QTL定位。[擬解決的關鍵問題]建立性狀與加性、顯性、印跡關系的遺傳模型、給出單個印跡QTL定位與印跡QTL顯著性檢驗的方法。

1試驗設計

假設有1個已知標記基因型的自然群體，將自然群體植株間進行隨機交配產(chǎn)生隨機交配群體，采用隨機區(qū)組設計，調(diào)查二倍體植株性狀表型值，生成隨機交配群體如圖1所示。

2 遺傳模型與定位方法

假設基因組上某個位置上存在與表型性狀關聯(lián)的位點，這個位點控制某個性狀，那么我們可以定義下列遺傳模型：

我們可以推導出，它的理論均值為：

等位基因替代效應的平均效應（the average effectof allele substitution）可以通過式4計算得到：

3 單標記印跡QTL定位方法

假設有一個自然群體進行隨機交配后，產(chǎn)生了個體數(shù)目為n的群體，為此我們建立了以下線性模型

為了簡單起見，本研究采取單標記關聯(lián)分析，采用最小二乘法回歸分析，對基因組上的標記進行逐點掃描，對于式9，我們提出假設H：a=d=h=0，其備擇假設H：a，d和h不全為零。若僅檢驗印跡效應，我們提出假設Ho：h=0，其備擇假設H：h≠0，我們采用F檢驗來檢測標記的顯著性，因為是單個標記的檢驗，直接用0.05或0.01下的F臨界值進行判斷。由于這里有3種遺傳效應，那么顯然的，如果：

對于給點的顯著性水平，可以構建統(tǒng)計量，該統(tǒng)計量服從F（P，n-p-1）的F分布，則有式10。

式中，RSS代表隨機殘差平方和，ESS為回歸平方和，n為樣本數(shù)，p為變量個數(shù)，此處取值為3。如果方程總體通過了顯著性檢驗以后，再逐個對x、z、t做t檢驗，檢驗各變量是否顯著。F統(tǒng)計量與t統(tǒng)計量計算簡單，使用計算機運算速度較快，可以逐點計算全基因組上每個位點的F值，并對每個位點的3種效應估計值進行t檢驗，將F最大（超過臨界值，且通過t檢驗）的點作為可能的印跡QTL位點。

4 模擬研究

為了驗證該方法的可行性，我們采用計算機來模擬驗證，由于本文僅是基于自然群體隨機交配的進行印跡QTL定位方法的初步研究，目的在探討其可行性，所以進行2個模擬：第一是采用單點模擬，假設已知QTL位置，僅考察其參數(shù)估計的準確度和精度，及其是否達到顯著性;第二是采用實際的水稻的基因型數(shù)據(jù)進行模擬，驗證其可行性。

4.1單點模擬研究

由于自然群體有別于結構群體，自然群體的遺傳結構是不清晰的，在群體中有大量的進化事件摻雜其中，群體結構較為復雜。在群體中，等位基因A，a的基因頻率往往不是1：1，甚至有可能是很極端的，如可能在0.05以下，就是罕見變異。那么自然群體中在不同基因頻率下，基于自然群體隨機交配產(chǎn)生的群體，我們所建立的遺傳模型和提出相應地印跡QTL檢測方法與效應估計方法是否還能有效，我們通過模擬來進行檢驗。在這里，僅考察所建立的遺傳模型在不同的MAF下相應地參數(shù)估計和顯著檢驗方法是否可行。

我們假定僅有單點標記，在遺傳模型中

y=u+ax+dz+ht+ε i=1，2，…，n （11）

進行參數(shù)估計，在此基礎上，首先我們對方程進行F檢驗，看其是否存在QTL（a，d和h不全為零），在此基礎上進一步對印跡效應做顯著性檢驗（h≠0）。

根據(jù)式9可以計算出印跡效應的大小如式12所示。

再計算環(huán)境方差，最終產(chǎn)生表型值，這樣就可以考慮遺傳率的不同，隨機交配次數(shù)不同的功效，參數(shù)估計等。

文獻[18]根據(jù)印跡與加性、顯性的關系將它們分成5種印跡類型，如表2所示。

對這5種類型的iQTL進行模擬定位并對模擬結果進行討論，由于在GWAS研究中，研究人員關心的往往是MAF大于0.05的這部分標記，所以，將MAF，即p設置0.05、0.1兩種情況，設q=1-p，常數(shù)C取4、10兩種情況，iQTL的遺傳率設置為5%、10%、15%三個水平，印跡效應根據(jù)式12進行推算。根據(jù)表2中的5種印跡類型得出a、d的值。假設自然群體作為初始群體，包含100個株系，利用該自然群體進行隨機交配6、20輪產(chǎn)生F2群體。每種情況重復100次，100次參數(shù)估計的標準誤偏差提供了參數(shù)估計誤差標準，顯著性水平取為0.05，限于篇幅，此處僅列出C=10，交配20輪的結果，結果見表3。

結果表明：在MAF較小，為0.05時，即使iQTL的遺傳率達到15%，其檢測功效和參數(shù)估計的標準誤都較高，當MAF達到0.1以上時，其檢測功效就較高了;隨著MAF的增大，遺傳率的增加，其估計的標準誤逐漸減小。在和遺傳率相同的條件下，隨著C值的增加，其參數(shù)估計的標準誤也增加，其原因還有待于進一步的研究。即使在MAF高于0.05時，當遺傳率為5%時，效應值估計有一定的誤差，檢測功效也較低，當遺傳率在10%以上的時候，效應估計就較為精準。所以可以看出基因頻率和遺傳率是影響iQTL定位效果的因素。此外，隨著交配次數(shù)的增加，iQTL的檢測功效隨之增加，參數(shù)估計的標準誤隨之減少，從5種iQTL來看，PEP、PEM、DIPOD、DIPUD在MAF、遺傳率、C值相同的情況下，其iQTL檢測效果相似，然而DIB的iQTL檢測效果略差些，這說明加性效應和顯性效應影響了iQTL定位。

綜上所述，如果某個性狀的表型值由一個iQTL確定，那么不論它是上述五種類型中的哪種類型，只要在MAF大于0.1且遺傳率大于10%時，其檢測功效均較好，說明我們的提出的方法在自然群體隨機交配產(chǎn)生的F2群體上定位單個iQTL是有效的。

4.2 基于水稻基因型數(shù)據(jù)單個位點的模擬研究

為了驗證該方法在實際中的實施情況，我們采用韓斌院士課題組發(fā)布的水稻自然群體的數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集收集了960多種水稻種質(zhì)資源。為了簡化研究的問題，對原始數(shù)據(jù)進行了預處理，把其中粳稻的254個株系取出，并將MAF小于0.05的SNP位點去掉，并去除了所有的缺失位點，最終得到了一個包含16382個SNP，在本模擬中，假定這些SNP是等間距分布在一條染色體上，每個SNP間的距離為1kb，254個株系的數(shù)據(jù)集作為原始群體。原始群體采用隨機交配的方式生成隨機交配群體，在進行模擬前，統(tǒng)計各個位點的SNP頻率。從圖2可知，在自然群體中，每個位置上的SNP的MAF并不是均衡的。

假定一個位于470kb位置的這個SNP與某個表型性狀關聯(lián)，群體均值為u=10。模擬前，先計算該位點的SNP頻率p和g，印跡效應根據(jù)公式12進行推算（C值取2，4，6三種組合）。根據(jù)表2中的5種印跡類型得出a，d的值，根據(jù)前面的模擬結果，iQTL的遺傳力水平設置為10%和15%，利用自然群體進行3、5、7次隨機交配，產(chǎn)生隨機交配群體。每種模擬情況重復100次，100次參數(shù)估計的標準誤偏差提供了參數(shù)估計誤差標準，閾值可用Bonferroni校正，顯著性水平為0.05。此處，限于篇幅，僅列出C值取2、6，交配輪數(shù)為7次的結果，見表4，交配以后得到的隨機交配群體中470kb處的SNP的頻率p為0.54，則q為0.46，接近于1：1。由于在模擬時選擇的iQTL位置上的MAF接近于0.5，從真實數(shù)據(jù)的模擬結果來看：當遺傳率為10%、15%時，5種類型的iQTL定位都具有較好的結果，iQTL所在位置的估計較為準確，各參數(shù)估計的準確度和精度達到較好的效果，而且檢測功效也較高，在15%時所有類型的iQTL檢測功效均為100%。結果表明，隨著交配次數(shù)的增加，參數(shù)估計的精度也得到提高，這符合我們的構想，當樣本量增加時，其估計的準確度和精度得到提高;對于常數(shù)C值，從表可以看出，隨著C值的增加，其參數(shù)估計的精度逐漸下降，其原因還有待于進一步研究;從5種類型的印跡QTL來看，在相同的條件下，DIB的檢測功效較差，而其余4種DIPOD，DIPUD，PEM，PEP檢測的功效相近，由此可見：加性效應和顯性效應對iQTL的檢測具有一定的影響。

5 討論

我們提出了基于自然群體隨機交配產(chǎn)生的F2群體進行iQTL定位的思想，構建其初步的定位方法，通過單點模擬，全基因組的單點模擬說明基于自然群體隨機交配產(chǎn)生的群體進行iQTL定位是可行的，當然這里沒有考慮其他因素（如群體結構等）的干擾。模擬表明，在不考慮其他因素的影響下，該iQTL定位方法的檢測功效，以及參數(shù)估計的準確度和精度都較好。

雖然自然群體的群體遺傳結構不清晰，但在GWAS時代，測序成本不斷降低，甚至可以直接對個體進行測序。所以，基因型頻率可以看成已知的，基于自然群體隨機交配產(chǎn)生的群體，只要交配次數(shù)足夠，就可以產(chǎn)生較大的樣本;從初步研究模擬也可以看出，隨著交配次數(shù)的增加，其檢測功效，參數(shù)估計的精度也增加。

在全基因組關聯(lián)分析（GWAS）中，是以長期重組后保留下來的基因或位點間連鎖不平衡為基礎，在獲得群體表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)后，采用統(tǒng)計方法檢測標記與性狀之間關聯(lián)的分析方法，一般以自然群體或種質(zhì)資源為研究材料，遺傳結構較為復雜。在進行GWAS時，要求遺傳背景一致或者相似的群體，但在未知群體結構的關聯(lián)分析研究中，由不同亞群引起的MAF的差異會造成假關聯(lián)。通常采用基因組控制、基于家系的關聯(lián)分析檢驗和主成分分析等方法控制。一般而言：基于自然群體隨機交配產(chǎn)生的群體會產(chǎn)生結構分層，所以在這種情況下，必須要控制因為結構分層造成的假關聯(lián)，在后續(xù)的工作中，可以利用混合線性模型，傳遞不平衡分析等其他方法來進行印跡QTL定位方法的研究。