朱惠綿 陳燕敏 陳麗香

摘 要：采用QuEChERS凈化模式，通過氣相色譜質(zhì)譜儀（GCMS）建立了液態(tài)乳中氟蟲腈及其代謝物殘留量檢測方法，并對兩種不同凈化材料的凈化效果進行比較。樣品由乙腈提取，QuEChERS凈化，濃縮復(fù)溶后，通過GCMS進行檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：氟蟲腈及其代謝物殘留量在2.00～200ng/mL內(nèi)呈良好線性，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，檢出限為 0.400～1.00μg/kg;氟蟲腈及其代謝物殘留量在4 個添加水平（2.50、5.00、20.0、80.0μg/kg）下的加標(biāo)回收率為 74.4%～120.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）為1.0%～4.9%，小于10%。該方法準(zhǔn)確、簡單、快速，可適用于液態(tài)乳中氟蟲腈及其代謝物殘留量的同時測定。

關(guān)鍵詞：氟蟲腈;液態(tài)乳;QuEChERS;氣相色譜-質(zhì)譜法（GCMS）

我國GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定，牛奶中氟蟲腈最大殘留限量為0.02mg/kg[1]，但未規(guī)定檢測方法，只制定了蛋類中氟蟲腈檢測用GB 23200.115—2018《雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》[2]。歐盟相關(guān)法規(guī)要求，食品中氟蟲腈殘留量不能超過0.005mg/kg。目前對于氟蟲腈及其代謝物殘留量的檢測方法有很多種，但大部分是蔬菜[3]、茶葉[4-5]、肉類[6-7]和蛋類[8]中的氟蟲腈及其代謝物殘留量進行檢測，對于液態(tài)乳中氟蟲腈及其代謝物殘留量的檢測方法比較少。目前，關(guān)于液態(tài)乳中氟蟲腈及其代謝物殘留量的檢測方法有張小剛等[9]采用了固相萃取-UPLC-MS/MS法測定牛奶中氟蟲腈及其代謝物殘留量，馮程程[10]利用QuEChERS技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測5種動物源食品中（雞肉、雞蛋、豬肝、牛奶、豬肉）氟硅唑、氟蟲腈及它的3個代謝物和氟硅唑的殘留等。這些方法均采用的是高效液相質(zhì)譜法，目前并未有氣相色譜-質(zhì)譜法（GCMS）檢測液態(tài)乳中氟蟲腈及其代謝物殘留量。

相比于固相萃取柱活化-上樣-洗脫的過程，本研究中該實驗方法只需將樣品提取液加入凈化材料后渦旋離心，操作簡便，同時大大地減少了試劑用量和實驗耗時，并且所需樣品量少，對環(huán)境友好。其中，常用的凈化材料有C18、PSA等，PSA主要去除糖類、有機酸等極性化合物，C18主要去除脂肪酸、甾醇類和其他非極性雜質(zhì)[11]。而EMR-Lipid dSPE是一種新的材料，含有長碳鏈結(jié)構(gòu)，可以有效去除基質(zhì)中脂質(zhì)。液態(tài)乳營養(yǎng)豐富，作為檢測目標(biāo)物，其脂質(zhì)含量多，種類豐富[12]，兩種不同的凈化管均可適用于油脂含量多的樣品，但其凈化效果有待對比。

另外，相比GC/MS/MS，GC/MS靈敏度不比GC/-MS/MS高，但價格上比GC/MS/MS低，導(dǎo)致GC/MS的普及率比GC/MS/MS高。因此，本研究建立起QuEChERS-GCMS測定液態(tài)乳中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定方法，同時對不同凈化材料的QuEChERS測定液態(tài)乳中氟蟲腈及其代謝物殘留量的效果進行比較。為更多實驗室檢測液態(tài)乳中氟蟲腈及其代謝物殘留量提供一個簡便易行的方法和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 7890B-5977B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司;渦旋振蕩器，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司;高速離心機，SIGMA離心機揚州有限公司;電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.1.2 試劑與耗材 乙腈、正己烷、丙酮，均為色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司;0.22μm濾膜，博納艾杰爾科技有限公司;QuEChERS凈化管主要含PSA、C18和無水硫酸鈉，QuEChERS-EMR凈化管主要含氯化鈉、無水硫酸鎂和d-SPE EMR，安捷倫科技有限公司。

1.1.3 氟蟲腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品 氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)品，98.5%（999.7μg/mL）±3%，供應(yīng)商為Bepure;氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品，99.8% （1 007.0μg/mL）±5%，供應(yīng)商為First standard;氟甲腈標(biāo)準(zhǔn)品，98.23%，供應(yīng)商為Dr.Ehrenstorfer;氟蟲腈砜標(biāo)準(zhǔn)品，96.5%（100.0mg/L），供應(yīng)商為Dr.Ehrenstorfer。

1.2 樣品前處理

1.2.1 QuEChERS凈化管 稱取樣品5g，加入10mL乙腈，用振蕩器渦旋振蕩3min提取，加入3g氯化鈉，渦旋振蕩3min，用高速離心機8 500r/min離心5min。離心后，取所有上清液至QuEChERS凈化管中，渦旋振蕩1min，8 500r/min離心5min。離心后，取凈化后上清液4mL到10mL比色管中，40℃水浴氮吹濃縮至近干。用1mL正己烷溶解，再加入1.00μg/mL的環(huán)氧七氯100μL，充分混勻后，經(jīng)0.22 μm 有機濾膜過濾至進樣瓶中，供氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀上機檢測。

1.2.2 QuEChERS-EMR凈化管 稱取樣品5g，加入10mL乙腈，用振蕩器渦旋振蕩3min提取，加入3g氯化鈉，渦振振蕩3min，用高速離心機8 500r/min離心5min。離心后，取所有上清液備用。往 EMR-Lipid dSPE 增強型脂質(zhì)去除凈化管加入5mL水，渦旋3s活化?；罨?，加入上清液，渦旋振蕩1min，8 500r/min離心5min。離心后，取上清液到EMR-Lipid Polish 反萃取管，渦旋振蕩1min，8 500r/min離心5min。取凈化后上清液4mL到10mL比色管中，40℃水浴氮吹濃縮至近干。用1mL正己烷溶解，再加入1.0μg/mL的環(huán)氧七氯100μL，充分混勻后，經(jīng)0.22 μm 有機濾膜過濾至進樣瓶中，供氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀上機檢測。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 氣相色譜 色譜條件：DB-1701色譜柱（30m*0.25mm*0.25μm）;進樣口溫度：290℃;進樣方式：不分流進樣;升溫程序：初始溫度70℃，保持1min，以30℃/min升溫至200℃，再以5℃升溫至250℃，再以10℃升溫至290℃，保持4min;進樣量：1.0μL;載氣流速：1.2mL/min，恒流模式;隔墊吹掃流量3mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：EI源;離子源溫度：230℃;四級桿：150℃;電離能量：70eV;掃描方式：特征離子掃描（表1）。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別取標(biāo)準(zhǔn)品適量，用丙酮溶解，配制成10.0μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃冰箱避光保存，有效期為3個月;取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用丙酮稀釋，配制成200ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液，有效期為當(dāng)天使用。用正己烷對標(biāo)準(zhǔn)溶液再進行稀釋，配制成濃度為2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、80.0、100ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化材料對比

從表2可以看出，兩種凈化材料均能滿足標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[13]的試驗要求。但相對而言，QuEChERS加標(biāo)回收和穩(wěn)定性均比QuEChERS-EMR 效果好一些，可能是液態(tài)乳的營養(yǎng)成分多，主要包括蛋白質(zhì)、脂肪、和維生素等，其中蛋白質(zhì)可以通過乙腈提取沉淀去除，但液態(tài)乳中的脂肪涵蓋了短鏈和長鏈[14]，而EMR-Lipid dSPE去除的只是脂質(zhì)中C5以上的碳鏈，對于短鏈的脂肪和其他雜質(zhì)吸附能力較小，故其凈化效果可能不如C18和PSA。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

質(zhì)譜分析中基質(zhì)干擾物會影響目標(biāo)化合物的離子化，造成目標(biāo)化合物儀器響應(yīng)信號的增強或抑制[15]。在相同加標(biāo)水平下，基質(zhì)效應(yīng)公式為式（1）：

基質(zhì)效應(yīng)=空白基質(zhì)加標(biāo)液的響應(yīng)值（峰面積）/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值（峰面積）×100%（1）

采用式（1）上述方法衡量液態(tài)乳基質(zhì)對氟蟲腈及其代謝物殘留量儀器測定值的影響，空白基質(zhì)提取液采用“1.2”的處理方法制備，比較2.00、20.0 μg/kg兩個濃度水平下基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測物的儀器檢測峰面積。從表3可以看出，液態(tài)乳中氟蟲腈及其代謝物殘留量在2種不同添加濃度（2.00、20.0μg/kg）下的基質(zhì)效應(yīng)在 90.0%～116.8%內(nèi)，滿足一般情況下，基質(zhì)效應(yīng)在80%～120%范圍。因此，本研究采用內(nèi)標(biāo)法提高氟蟲腈及其代謝物殘留量定量的準(zhǔn)確性。

2.3 色譜分析

對空白加標(biāo)液態(tài)乳樣品（2.50μg/kg）進行QuEChERS凈化，上機分析。從圖1～4可以看出，氟蟲腈及其代謝物的響應(yīng)強度較高，并且 4 種化合物分離效果良好。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

對2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、80.0、100ng/mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行分析，以氟蟲腈及其代謝物峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、對應(yīng)的質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，氟蟲腈及其代謝物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于 0.999（表4）。以信噪比 （S/N）>3 時計算的含量為檢出限。可以看出，該方法能滿足國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)的限量要求。

2.5 加標(biāo)回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差

對空白液態(tài)乳樣品，考察了4 個加標(biāo)水平（2.50、5.00、20.0、80.0μg/kg），每個水平平行3次，按照Qu-EChERS和QuEChERS-EMR進行樣品處理及色譜測定，計算測得樣品的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表5～6。

3 結(jié)論

本研究采用QuEChERS前處理方法，結(jié)合GCMS，建立了QuEChERS-GCMS和QuEChERS-EMR-GCMS測定液態(tài)乳中氟蟲腈及其代謝物殘留量的檢測方法，并對兩種凈化材料進行比較。結(jié)果表明，QuEChERS-GCMS和QuEChERS-EMR均能滿足GB/T 27404—2008的要求，滿足GB 2763—2019關(guān)于氟蟲腈液態(tài)乳最大殘留限量（0.02mg/kg）和歐盟法規(guī)EC No149—2008規(guī)定的最大殘留限量（0.005mg/kg）等檢測需求。但相對而言，以C18和PSA為主的QuEChERS試驗效果比以EMR-Lipid dSPE 為主的QuEChERS-EMR的效果好。該方法簡單、快速、凈化效果好、重復(fù)性好，易于操作，適用于液態(tài)乳中氟蟲腈及其代謝物殘留量檢測。

參考文獻

[1]GB 2763.1—2018 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中百草枯等43種農(nóng)藥最大殘留限量[S].

[2]GB 23200.115—2018 雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[S].

[3]曹天亞，馮正偉，金鑫.氣相色譜法對蔬菜水果中氟蟲腈和噠螨靈殘留檢測的探究[J].江西農(nóng)業(yè)，2018（16）：31-33.

[4]倪韻晨，徐小民，黃百芬，等.QuEChERS凈化-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-同位素內(nèi)標(biāo)法快速測定茶葉中氟蟲腈及其代謝物殘留量[J].食品科學(xué).

[5]胡文.液相色譜——串聯(lián)質(zhì)譜檢測茶葉中氟蟲腈的殘留量[J].廣東茶業(yè)，2019（1）：7-11.

[6]郝杰，邵瑞婷，姜潔，等.QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋、雞肉中氟蟲腈及其代謝物殘留[J].食品科學(xué)，2019（2）：318-323.

[7]黎小鵬，梁雪琪，陳楠.超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀檢測動物源性食品中氟蟲腈及其代謝物[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019（14）：204-206.

[8]丁洪流，代菲，金萍.蛋類產(chǎn)品中氟蟲腈的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法[J].中國檢驗檢測，2019（1）：9-12.

[9]張小剛，王霞，馬穎清.固相萃取-UPLC-MS/MS法測定牛奶中氟蟲腈及其代謝物殘留量[J].食品工業(yè)科技，2019，8（40）：221-224.

[10]馮程程.五種動物源食品中氟硅唑、氟蟲腈及其代謝物殘留分析研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2018.

[11]黃亞娟.食品安全分析中常用的樣品前處理技術(shù)[J].輕工科技，2019，35（8）：31-33.

[12]周曉麗.基于 UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass技術(shù)的山羊奶、大豆奶、牛奶的脂質(zhì)組分析研究[J].中國飼料，2017（10）：33-38.

[13]GB/T 27404—2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測[S].

[14]顧浩峰，張富新，梁蕾，等.山羊奶與牛奶和人奶營養(yǎng)成分的比較[J].食品工業(yè)科技，2012（8）：369-373.

[15]郭菁，丁立平，吳文凡，等.高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中硝基咪唑類化合物及其代謝物殘留[J].分析測試學(xué)報，2015，34（1）：28-34.

Abstract：A QuEChERS method was established for the simultaneous determination of fipronil and its metabolites in liquid milk by gas chromatography-tandem mass spectrometry coupled（GCMS）.The purification effects of two different purification materials was compared.The sample was extracted from acetonitrile，purified by QuEChERS，concentrated and reconstituted，and then detected by gas chromatography mass spectrometry.The results showed that fipronil and its metabolites showed good linearity in the range of 2.00～200 ng/mL，and the linear correlation coefficient （R2）was more than 0.999.The detection limit was 0.400～1.00 μg/kg.Fipronil and its the spiked recoveries of metabolites at 4 levels （2.50μg/kg，5.00μg/kg，20.0μg/kg，80.0μg/kg）ranged from 74.4% to 120.2%，relative standard deviation （RSD，n=3）was 1.0%～4.9%，less than 10%.This method is accurate，simple，quick，and suitable for simultaneous determination of fipronil and its metabolite residues in liquid milk.

Keywords：fipronil;liquid milk;QuEChERS;gas chromatography-mass spectrometry（GCMS）

（責(zé)任編輯 唐建敏）