單冰冰 陳寬 李婷 田富月 張建永

摘 要 目的：優(yōu)化雙斛膠囊總多糖的水提取工藝。方法：對(duì)雙斛膠囊組方藥材金釵石斛和鐵皮石斛混合物在以醇提取總生物堿之后進(jìn)行水提取總多糖。以葡萄糖為對(duì)照品，采用硫酸-苯酚法顯色處理并在488 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，測(cè)定總多糖含量。以干膏得率和總多糖含量計(jì)算的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)考察料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響;根據(jù)單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，采用L9（34）正交表進(jìn)行設(shè)計(jì)和試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)等條件，并對(duì)所得優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：葡萄糖質(zhì)量濃度在0.041 4～0.207 0 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好（r=0.999 9）;日內(nèi)、日間RSD為3.61%～8.24%（n=3、n=5），重復(fù)性試驗(yàn)RSD為1.49%（n=6）;平均加樣回收率為98.65%（RSD=1.45%，n=6）。優(yōu)化后的水提取工藝為料液比1 ∶ 25（g/mL）、提取溫度100 ℃、提取時(shí)間90 min、提取1次;3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)化工藝所得水提物的平均總多糖含量為379.292 8 mg/g（RSD=1.93%，n=3）、平均干膏得率為22.75%（RSD=2.41%，n=3）。結(jié)論：所建立的硫酸-苯酚法簡(jiǎn)便，精密度、準(zhǔn)確度均良好;優(yōu)化所得的水提取工藝穩(wěn)定、可行，可用于雙斛膠囊總多糖的提取。

關(guān)鍵詞 雙斛膠囊;金釵石斛;鐵皮石斛;總多糖;硫酸-苯酚法;含量測(cè)定;干膏得率;正交試驗(yàn);工藝優(yōu)化

ABSTRACT? OBJECTIVE： To optimize the water extraction technology of total polysaccharide of Shuanghu capsules. METHODS： The total alkaloid was firstly extracted from Dendrobium nobile and Dendrobium officinale mixture of Shuanghu capsules with ethanol， and then total polysaccharide was extracted with water. Using glucose as control， total polysaccharide was treated with phenol-sulfuric acid method and its content was determined at 488 nm. Using comprehensive score calculated with the yield of the extract and the content of total polysaccharide as index， the effects of material-liquid ratio， extraction temperature， extraction time and times on the extraction were investigated by single factor test. Then L9（34） orthogonal test was used to optimize solid-liquid ratio，extraction temperature，extraction time and extraction times according to the results of single factor test. The optimized technology was validated. RESULTS： The linear range of glucose were 0.041 4-0.207 0 mg/mL（r=0.999 9）. RSDs of intra-day and inter-day ranged 3.61%-8.24% （n=3，n=5）， and RSD of repeatability test was 1.49% （n=6）. Average recovery rate was 98.65%（RSD=1.45%，n=6）. The optimal water extraction technology included solid-liquid ratio of 1 ∶ 25（g/mL），extraction temperature of 100 ℃，extracting for 90 min， extracting once. Results of validation tests showed that average content of total polysaccharide was 379.292 8 mg/g （RSD=1.93%，n=3） and average yield of the extract was 22.75%（RSD=2.41%，n=3）. CONCLUSIONS： Established phenol-sulphuric acid method is simple， precise and accurate. The optimal water extraction technology is stable and feasible， which can be used for the extraction of total polysaccharides from Shuanghu capsules.

KEYWORDS? ?Shuanghu capsules; Dendrobium nobile; Dendrobium officinale; Total polysaccharide; Phenol-sulphuric acid method; Content determination; Yield of extract; Orthogonal test; Technology optimization

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)飲酒人群比例和酒精性肝病發(fā)病率均呈上升趨勢(shì)，酒精性肝病已成為我國(guó)最主要的慢性肝病之一，其可導(dǎo)致機(jī)體多系統(tǒng)、多器官損傷，危害不容小覷[1]。酒精性肝病最基本的病理狀態(tài)是酒精性肝損傷（Alcoholic liver disease，ALD），ALD貫穿于酒精性肝病發(fā)生的始終[2]。但目前ALD的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，西醫(yī)治療以戒酒、營(yíng)養(yǎng)支持及對(duì)癥治療為主，尚缺乏特效藥物[3]。中醫(yī)辨證論治是中醫(yī)理論的精華，其認(rèn)為ALD是由酒毒濕熱之邪熏蒸肝膽，致痰濁凝聚、肝失調(diào)達(dá)、氣血郁滯、脾胃損傷。雖然中醫(yī)學(xué)者和醫(yī)家尚未對(duì)ALD的辨證進(jìn)行統(tǒng)一，但治法多以清熱化濕、理氣化瘀、補(bǔ)益肝腎為主[4-6]。因此，如能在辨證論治的指導(dǎo)原則下，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究成果，可更有針對(duì)性地選擇藥物，使患者獲得更好的療效。

目前，藥用石斛屬植物共有40多種，其中金釵石斛和鐵皮石斛備受關(guān)注[7]。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）收錄了金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）和鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo），兩者均具有益胃生津、滋陰清熱之功效[8]。石斛性甘、微寒，歸肺、胃、腎經(jīng)，為常用貴重藥材，藥用歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，可用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足和陰虛火旺等多種病癥的治療[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石斛具有護(hù)肝、抗胃潰瘍、降血糖、提高免疫力等作用[10-11]。上述藥用歷史和藥理學(xué)成果均佐證了石斛可對(duì)ALD發(fā)揮治療作用。金釵石斛和鐵皮石斛的主要活性指標(biāo)成分為生物堿和多糖[12]，石斛生物堿可緩解高脂血癥大鼠肝臟脂肪變性等癥狀[13-14]，而石斛多糖則在調(diào)節(jié)受酒精影響的肝功能和脂質(zhì)代謝等方面發(fā)揮著重要作用[15-16]，這兩類(lèi)成分均對(duì)肝臟有一定的保護(hù)和調(diào)節(jié)作用，其藥理作用既存在差異又相互關(guān)聯(lián)，從現(xiàn)代藥理學(xué)角度推測(cè)兩者配伍可能會(huì)發(fā)揮協(xié)同功效。

基于中醫(yī)辨證論治的整體觀，不局限于某一客觀指標(biāo)的改變，本課題組以金釵石斛和鐵皮石斛的優(yōu)勢(shì)成分總生物堿和總多糖作為活性成分，通過(guò)現(xiàn)代提取和制劑手段，制成一種對(duì)亞急性ALD具有改善作用的雙斛膠囊。該制劑根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中成人日服用量[8]，將金釵石斛和鐵皮石斛的用量均以4 g（兩種藥材質(zhì)量比為1 ∶ 1）進(jìn)行配伍后提取制得。其提取工藝主要分為兩個(gè)步驟：首先對(duì)金釵石斛和鐵皮石斛的混合物進(jìn)行醇提取獲得總生物堿成分，再將藥渣進(jìn)行水提取獲得總多糖成分。本課題組前期已完成雙斛膠囊總生物堿的醇提取工藝的優(yōu)化（另文刊出），現(xiàn)以總多糖含量和干膏得率為指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化雙斛膠囊總多糖的水提取工藝，為該制劑的深入開(kāi)發(fā)提供依據(jù)和參考。

1 材料

1.1 儀器

BT125D型十萬(wàn)分之一電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司];FA2004N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）;TU-1900型紫外-分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）;AXTGL16M型高速冷凍離心機(jī)（鹽城市安信試驗(yàn)儀器有限公司）;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海上登實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;FW135型中藥材粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）;XH-B型旋渦混合器（姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司）;BCD-579WE型冰箱（青島海爾股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：0833-9501，純度：100.0%）;無(wú)水乙醇（成都金山化學(xué)試劑有限公司）;濃硫酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;苯酚（上海阿拉丁生化股份有限公司）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

金釵石斛、鐵皮石斛飲片由重慶市渝和堂藥業(yè)有限公司提供，均產(chǎn)自云南，批號(hào)均為20170801。兩者經(jīng)質(zhì)檢全部符合2015年版《中國(guó)藥典》（一部、四部）“中藥材與飲片”項(xiàng)下石斛和鐵皮石斛的性狀、鑒別及含量測(cè)定有關(guān)規(guī)定，以及“中藥其他方法”項(xiàng)下浸出物測(cè)定、雜質(zhì)檢查、灰分測(cè)定、二氧化硫殘留量測(cè)定等有關(guān)規(guī)定。

2 雙斛膠囊的總多糖含量測(cè)定

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 取葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加水制成質(zhì)量濃度為0.207 0 mg/mL的對(duì)照品母液;取該母液，以水逐級(jí)稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液 稱(chēng)取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物（按質(zhì)量比1 ∶ 1混勻，過(guò)30目篩，以下同）8 g，置于圓底燒瓶中，按前期研究篩選的最佳醇提工藝提取總生物堿（以下同）。取醇提后的藥渣，加水回流提?。ň唧w參數(shù)見(jiàn)本文后續(xù)正交試驗(yàn)優(yōu)選水提取工藝），放冷，用少量水分次洗滌容器并用紗布過(guò)濾水提液和洗液;合并濾液，置于2 000 mL量瓶中，加水定容，搖勻;以3 500 r/min離心15 min，移取上清液1 mL，加入5倍體積的80%乙醇，于4 ℃冷藏1 h后，再于4 ℃下以3 500 r/min離心15 min;取沉淀，用4倍體積的80%乙醇繼續(xù)洗滌，以3 500 r/min離心15 min，棄去上清液，重復(fù)操作2次;取沉淀，加少量熱水溶解，放冷，再加水定容至10 mL，搖勻，即得。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取“2.1”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液（0.124 2 mg/mL）和供試品溶液，采用硫酸-苯酚法[8，17]進(jìn)行顯色反應(yīng)：向?qū)φ掌啡芤夯蚬┰嚻啡芤褐屑尤?%苯酚溶液0.5 mL（臨用時(shí)配制），搖勻，再精密加入濃硫酸2.5 mL，搖勻;室溫放置5 min后，置沸水浴中加熱20 min進(jìn)行顯色反應(yīng)，取出，置于冰水浴中降溫5 min終止反應(yīng)。以水為空白溶劑對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)在400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果，兩種溶液均在488 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故選擇488 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，詳見(jiàn)圖1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 顯色穩(wěn)定性考察 稱(chēng)取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，平行3份，提取總生物堿后取藥渣，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下硫酸-苯酚法“加入5%苯酚溶液0.5 mL……置于冰水浴中降溫5 min終止反應(yīng)”步驟處理，分別于處理完畢后第0、30、60、120、240 min時(shí)，在488 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，不同時(shí)間點(diǎn)樣品吸光度的RSD為0.49%（n=5），表明供試品溶液在顯色后的240 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品母液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于刻度試管中，以水稀釋至0.5 mL，制成葡萄糖質(zhì)量濃度分別為0.041 4、0.082 8、0.124 2、0.165 6、0.207 0 mg/mL的系列對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下硫酸-苯酚法進(jìn)行顯色反應(yīng)。以水為空白溶劑對(duì)照，在488 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=3.929 4X+0.001（r=0.999 9）。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在0.041 4～0.207 0 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 稱(chēng)取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，提取總生物堿后取藥渣，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于4? ℃保存。分別于3個(gè)不同工作日和每個(gè)工作日第0、4、8、12、24 h時(shí)，取該供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下硫酸-苯酚法處理后測(cè)定，并以外標(biāo)法計(jì)算總多糖含量，分別考察日間與日內(nèi)精密度。結(jié)果，總多糖含量日間RSD為8.24%（n=3），日內(nèi)RSD分別為3.61%、7.50%、5.05%（n=5），表明供試品溶液在日間（1～3 d）和日內(nèi)（0～24 h）均較不穩(wěn)定，故該供試品溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，平行6份，提取總生物堿后取藥渣，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下硫酸-苯酚法處理后測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算總多糖含量。結(jié)果，總多糖含量的RSD為1.49%（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物4 g，平行6份，提取總生物堿后取藥渣，分別加入16.639 2 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品濃溶液（按“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品母液配制方法新配）100 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下硫酸-苯酚法處理后測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算總多糖含量及加樣回收率。結(jié)果，樣品中總多糖的平均加樣回收率為98.65%，RSD為1.45%（n=6），表明該方法準(zhǔn)確度良好，詳見(jiàn)表1。

3 雙斛膠囊的總多糖提取工藝優(yōu)化

3.1 提取工藝的單因素考察

參照文獻(xiàn)方法[18-19]并結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，本研究以綜合評(píng)分法（以總多糖含量和干膏得率計(jì)算）進(jìn)行單因素試驗(yàn)?？偠嗵呛繙y(cè)定按“2”項(xiàng)下方法進(jìn)行。取按“2.1.2”項(xiàng)下方法提取獲得的總多糖水提液樣品200 mL，置于105 ℃恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，90 ℃水浴蒸干，然后在105 ℃烘箱中干燥3 h，再轉(zhuǎn)移至干燥器中冷卻30 min，稱(chēng)定質(zhì)量并計(jì)算干膏得率。設(shè)定總多糖含量權(quán)重為7分、干膏得率權(quán)重為3分（合計(jì)10分）依據(jù)，按公式計(jì)算綜合評(píng)分：綜合評(píng)分=（總多糖含量/總多糖含量最大值）×7+（干膏得率/干膏得率最大值）×3。

3.1.1 料液比的考察 稱(chēng)取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，提取總生物堿后取藥渣，固定提取溫度為90 ℃、提取時(shí)間為60 min、提取次數(shù)為1次，按藥材的原質(zhì)量分別以料液比1 ∶ 25、1 ∶ 30、1 ∶ 35、1 ∶ 40、1 ∶ 45（g/mL，下同）加水，進(jìn)行加熱回流提取，平行操作3次。按前述方法測(cè)定總多糖含量和干膏得率，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖2A。由圖2A可知，綜合評(píng)分在料液比為1 ∶ 25～1 ∶ 30范圍內(nèi)時(shí)呈上升趨勢(shì)，且在料液比為1 ∶ 30時(shí)達(dá)到最大值，隨后呈下降趨勢(shì)。綜合以上因素，選擇料液比為1 ∶ 25～1 ∶ 35進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)考察。

3.1.2 提取溫度的考察 稱(chēng)取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，提取總生物堿后取藥渣，固定料液比為1 ∶ 30（按藥材原質(zhì)量計(jì)）、提取時(shí)間為60 min、提取次數(shù)為1次，分別在60、70、80、90、100 ℃加熱條件下進(jìn)行回流提取，平行操作3次。按前述方法測(cè)定總多糖含量和干膏得率，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖2B。由圖2B可知，當(dāng)提取溫度在60～80 ℃時(shí)，綜合評(píng)分變化不大，趨于平緩;當(dāng)提取溫度為80～100 ℃時(shí)，綜合評(píng)分上升較快，在100 ℃條件下綜合評(píng)分達(dá)最高值（由于實(shí)驗(yàn)室條件有限，未繼續(xù)考察更高的溫度）。綜合以上因素，選擇提取溫度為80～100 ℃進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)考察。

3.1.3 提取時(shí)間的考察 稱(chēng)取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，提取總生物堿后取藥渣，固定料液比為1 ∶ 30（按藥材原質(zhì)量計(jì)）、提取溫度為100 ℃、提取次數(shù)為1次，分別加熱回流提取30、60、90、120、150 min，平行操作3次。按前述方法測(cè)定總多糖含量和干膏得率，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖2C。由圖2C可知，當(dāng)提取時(shí)間為90 min時(shí)，綜合評(píng)分最高;雖然當(dāng)提取時(shí)間在150 min以上時(shí)綜合評(píng)分也有上升趨勢(shì)，但考慮到時(shí)間成本和能源消耗，并未繼續(xù)選擇更長(zhǎng)的提取時(shí)間進(jìn)行比較。綜合以上因素，選擇提取時(shí)間為60～120 min進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)考察。

3.1.4 提取次數(shù)的考察 稱(chēng)取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，提取總生物堿后取藥渣，固定料液比為1 ∶ 30（按藥材原質(zhì)量計(jì)）、提取溫度為100 ℃、提取總時(shí)間為90 min，分別加熱回流提取1、2、3、4次，平行操作3次。按前述方法測(cè)定總多糖含量和干膏得率，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖2D。由圖2D可知，當(dāng)提取1～3次時(shí)，綜合評(píng)分差異不大，但提取4次時(shí)綜合評(píng)分有下降趨勢(shì)。綜合以上因素，選擇提取次數(shù)為1～3次進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)考察。

3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

3.2.1 正交試驗(yàn)考察 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）為影響因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行設(shè)計(jì)和試驗(yàn)，平行操作3次，按前述方法測(cè)定總多糖含量和干膏得率，計(jì)算綜合評(píng)分，并以綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。因素與水平見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

由表3、表4可知，因素水平A1B3C2D1對(duì)提取工藝影響相對(duì)較大，其中以離差平方和最小的因素項(xiàng)（D）為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，根據(jù)極值（R）大小，確定A因素（料液比）對(duì)提取工藝的影響最大，各因素對(duì)綜合評(píng)分影響的順序?yàn)锳>C>B>D;除A因素對(duì)工藝的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余因素的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合考慮提取效率和試驗(yàn)條件等因素，結(jié)合單因素考察結(jié)果，確定總多糖水提取工藝的最佳工藝條件為A1B3C2D1，即料液比為1 ∶ 25（g/mL）、提取溫度為100 ℃、提取時(shí)間為90 min、提取1次。

3.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱(chēng)取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，提取總生物堿后取藥渣，按“3.2.1”項(xiàng)下最佳工藝條件進(jìn)行水提取及干燥，平行操作3次。按前述方法測(cè)定并計(jì)算水提物樣品中的總多糖含量和干膏得率。結(jié)果，平均總多糖含量為379.292 8 mg/g（RSD=1.93%，n=3），平均干膏得率為22.75%（RSD=2.41%，n=3），表明優(yōu)選水提取工藝條件穩(wěn)定、合理、可行。

4 討論

多糖是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子，是由多個(gè)單糖分子縮合形成糖苷鍵，并以糖苷鍵進(jìn)行線性或分枝連接而成的糖類(lèi)化合物，是許多中藥如靈芝、人參等中的活性成分[20]。目前，多糖提取方法有加熱提取法、微波提取法、超聲波輔助水提法、酶解輔助提取法等[21]。但多糖經(jīng)過(guò)超聲或微波處理后其糖苷鍵可能會(huì)發(fā)生斷裂;酶解輔助提取法雖然提取率較高，但酶反應(yīng)條件要求嚴(yán)格，會(huì)增加生產(chǎn)成本，且目前尚停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，暫不能直接用于工廠規(guī)?；a(chǎn)[22]。本研究采用的水提取法是目前最常用的多糖提取方法，工藝條件簡(jiǎn)單、易控制。綜合考慮石斛藥材的昂貴價(jià)格，從降低生產(chǎn)成本的角度，本課題組對(duì)雙斛膠囊的2種組方藥材中的兩類(lèi)主要成分采用先醇提取總生物堿，然后水提取總多糖的步驟進(jìn)行提取。本研究是在前期醇提取總生物堿的優(yōu)化提取工藝確定后，對(duì)其藥渣進(jìn)行總多糖的水提工藝優(yōu)化研究，旨在最大程度地保留2種石斛藥材的有效成分。

目前，多糖含量的測(cè)定方法一般有比色法、滴定法、高效液相色譜法等，其中比色法應(yīng)用最廣泛，主要包括硫酸-苯酚法、硫酸蒽酮法和3，5-二硝基水楊酸法等[20，23]。多糖比色法抗干擾能力較弱，藥材的不同產(chǎn)地、對(duì)照品的選擇、反應(yīng)溫度和時(shí)間等因素都會(huì)對(duì)多糖含量測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾[20，23]。故本研究參考文獻(xiàn)中報(bào)道較多的石斛多糖含量測(cè)定方法[24-25]，以葡萄糖為對(duì)照品，采用硫酸苯酚法進(jìn)行多糖含量測(cè)定，并對(duì)含量測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，供試品溶液的日間精密度和日內(nèi)精密度RSD值均偏大，提示經(jīng)硫酸、苯酚處理后的水提液樣品穩(wěn)定性不佳，因此應(yīng)盡快完成提取工藝的操作，減少存儲(chǔ)等外界條件對(duì)總多糖含量的干擾，并且供試品溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用，以確保其有效成分的穩(wěn)定。

本研究對(duì)醇提取總生物堿后的藥渣進(jìn)行水提取工藝考察，首先通過(guò)單因素試驗(yàn)初步確定料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)總多糖含量和干膏得率（以兩者計(jì)算的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)）的影響。在單因素考察結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交設(shè)計(jì)優(yōu)化，確定各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響程度排序?yàn)榱弦罕?gt;提取時(shí)間>提取溫度>提取次數(shù)，其中料液比對(duì)綜合評(píng)分的影響最為顯著（P<0.05）。綜合考慮其他因素，如提取溫度越高時(shí)多糖含量越高、不同提取時(shí)間條件下綜合評(píng)分差異不大、提取次數(shù)增多會(huì)對(duì)后續(xù)濃縮干燥帶來(lái)諸多不便等情況，最終確定最佳水提取工藝為料液比1 ∶ 25（g/mL）、提取溫度100 ℃、提取時(shí)間90 min、提取1次。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)表明，該提取工藝穩(wěn)定、可行，可為雙斛膠囊的下一步開(kāi)發(fā)利用奠定良好的基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究所建立的硫酸苯酚法簡(jiǎn)便，精密度、準(zhǔn)確度均良好;優(yōu)化所得的水提取工藝穩(wěn)定、可行，可用于雙斛膠囊總多糖的提取。

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（收稿日期：2019-05-07 修回日期：2019-08-07）

（編輯：段思怡）